La lipocalina associata alla gelatina dei neutrofili secreta mostra una maggiore capacità di inibire l'allargamento della cisti delle cellule ADPKD rispetto alla forma non secreta Ⅱ

3. Risultati

3.1. Confronto dell'espressione NGAL e della proliferazione cellulare tra cellule M-1 Wild Type e cellule 2L3 ADPKD

La linea cellulare 2L3 è stata stabilita mediante trasduzione del virus SV40 di cellule epiteliali renali primarie da topi Pkd1L3/L3 [17]. Le cellule M-1 (linea cellulare epiteliale renale di tipo selvatico di topo) acquistate da BCRC (Hsinchu, Taiwan) sono state utilizzate come controllo. È stata condotta la genotipizzazione PCR delle trascrizioni Pkd1 delle cellule 2L3 e M-1 per controllare i genotipi utilizzando primer prima e dopo il primo sito loxP nell'introne 30 dell'allele target (Figura 1A). I tessuti murini Pkd1+/+, Pkd1L3/+ e Pkd1L3/L3 sono stati utilizzati come controlli di genotipizzazione. I prodotti PCR da cellule M-1 hanno mostrato una singola banda Pkd1+/+ wild-type (WT) (473 bp), mentre i prodotti PCR da cellule 2L3 hanno mostrato una singola banda Pkd1L3/L3 (507 bp) a causa di un segmento loxP extra (34 bp) (Figura 1B).

Per caratterizzare se le cellule M-1 e 2L3 provenisserotubuli renali di origine simile, abbiamo prima confrontato la morfologia tra le 2 linee cellulari; Le cellule M-1 e le cellule 2L3 hanno mostrato una morfologia molto simile (Figura 1C). Inoltre, è stata eseguita la colorazione della lectina con la lectina di Lotus tetragonolobus (LTL, un marcatore di tubuli prossimali differenziati, marcato con fluoresceina) e l'agglutinina di Dolichos biflorus (DBA, un marcatore di tubuli distali differenziati e dotti collettori, marcati con rodamina) per verificarne l'origine. dai tubuli renali (Figura 1D). I risultati della colorazione hanno mostrato che le cellule M-1 e 2L3 erano sia LTL- (per lo più colocalizzate con DAPI) che DBA-positive (localizzate nel citoplasma) (Figura 1D). Questo risultato ha suggerito che le cellule M-1 e 2L3 abbiano avuto origine datubuli renalidi origini simili e potrebbero avere caratteristiche simili. I risultati della PCR in tempo reale hanno mostrato che le cellule 2L3 avevano livelli di espressione di mRNA Pkd1 altamente ridotti rispetto alle cellule M-1 (Figura 1E), il che era coerente con i dati dei topi 2L3 con livelli di espressione della proteina Pkd1 di solo il 25% di quelli dei topi selvatici [17]. È stato dimostrato che i topi 2L3 hanno livelli più elevati di proteina NGAL e del recettore NGAL (NGAL-R) nei loro reni rispetto ai topi selvatici [31]. I risultati della PCR in tempo reale hanno mostrato che il livello di espressione dell'mRNA di Lcn2 era 15,96- volte maggiore nelle cellule 2L3 rispetto alle cellule M-1 (Figura 1F), in linea con i dati riportati per i topi 2L3 [31], mentre non vi era alcuna differenza significativa nell'espressione dell'mRNA di Slc22a17 tra i due gruppi (Figura 1G). I risultati del Western blot hanno anche mostrato che le cellule 2L3 avevano un livello di espressione di NGAL più elevato rispetto alle cellule M-1, mentre non c'era alcuna differenza significativa nel livello di espressione di NGAL-R tra i due gruppi (Figura 1H). Cellule e surnatanti di cellule M-1 e 2L3 sono stati entrambi raccolti dopo coltura per 48 ore per quantificare NGAL nei lisati cellulari e nei surnatanti (che rappresentano l'NGAL secreto) mediante ELISA. Coerentemente con i risultati del western blot, ELISA ha mostrato che 2L3 aveva NGAL intracellulare e secrezione di NGAL nel surnatante significativamente più elevati rispetto a M-1 (Figura 1I).

È stato dimostrato che i topi 2L3 mostrano una proliferazione cellulare più elevata rispetto ai topi wild-type [17]. Sono stati condotti test di incorporazione di MTT e BrdU per verificare se la linea cellulare 2L3 mostrasse anche una migliore vitalità e proliferazione rispetto alle cellule di tipo selvaggio (Figura 2A-C). Le immagini rappresentative hanno rivelato una maggiore confluenza di cellule 2L3 rispetto alle cellule M-1 dopo la coltura per 48 ore con gli stessi numeri di semina iniziale (Figura 2A). I test MTT hanno mostrato che le cellule 2L3 avevano una vitalità significativamente migliore rispetto alle cellule M-1 coltivate per 24 e 48 ore (Figura 2B). Per confrontare la capacità di proliferazione delle cellule M-1 e 2L3, le cellule sono state coltivate per 24 ore dopo il test di incorporazione di BrdU, che ha mostrato che le cellule 2L3 avevano una proliferazione significativamente migliore rispetto alle cellule M-1 (Figura 2C) .

NUOVE ERBE PER LA MALATTIA RENALE

3.2. Effetti dell'aggiunta di mNGAL sulla vitalità e proliferazione delle cellule 2L3

È stato dimostrato che la somministrazione di NGAL esogeno riduce la crescita delle cisti in vitro [25]. Il nostro studio precedente ha dimostrato che la sovraespressione di NGAL in un modello murino di ADPKD (topi Pkd1L3/L3; NGALTg/Tg) riduceva la progressione della cisti accompagnata da cambiamenti in una serie di percorsi molecolari coinvolti nellaproliferazione cellulare, apoptosi, Efibrosi[31]. Pertanto, abbiamo studiato gli effetti del mNGAL ricombinante sulla vitalità delle cellule 2L3 utilizzando il test MTT (Figura 3). La purezza del mNGAL ricombinante (senza il peptide segnale) purificato da E. coli è stata determinata per la prima volta mediante SDS-PAGE e colorazione con Coomassie blue, che ha rivelato una singola banda 20-kD e una banda dimerica molto leggera ad alte concentrazioni ( Figura 3A). Inoltre, la stabilità di mNGAL nel mezzo di coltura cellulare è stata analizzata mediante western blotting, che ha dimostrato la stabilità di mNGAL nel mezzo per almeno 48 ore (Figura 3B). Abbiamo notato che mNGAL ha ridotto significativamente la vitalità delle cellule 2L3 rispetto al gruppo di controllo dopo il trattamento per 8 ore (Figura 3C). In questo esperimento è stata utilizzata la rapamicina come controllo positivo, che è riconosciuta come un inibitore di mTOR ed è nota per inibire la proliferazione delle cellule epiteliali e la crescita delle cisti in un modello murino di PKD [32]. Inoltre, il test di incorporazione di BrdU ha anche mostrato che il trattamento mNGAL per 24 ore ha inibito significativamente la proliferazione delle cellule 2L3 (Figura 3D). La proliferazione cellulare è una caratteristica chiave dell'ADPKD e la scoperta che la proliferazione delle cellule 2L3 potrebbe essere ridotta dall'mNGAL ha suggerito che l'mNGAL potrebbe inibire ulteriormente la formazione di cisti nelle cellule 2L3.

3.3. Vie di segnalazione influenzate dall'aggiunta di mNGAL alle cellule 2L3

È stato dimostrato che l’accoppiamento NGAL e NGAL-R sequestra il ferro intracellulare e induce ulteriormente l’apoptosi [29]. Inoltre, gli studi hanno dimostrato che NGAL può indurre l'apoptosi in un modello di ADPKD in vitro e in vivo [25,31]. Per indagare se mNGAL potesse indurre l'apoptosi delle cellule 2L3, abbiamo analizzato l'apoptosi delle cellule 2L3 mediante citometria a flusso. Sulla base della scoperta che mNGAL ha inibito la proliferazione delle cellule 2L3 dopo il trattamento mNGAL per 8 ore (Figura 3D), abbiamo analizzato gli effetti di mNGAL sulle cellule 2L3 sia in momenti precedenti (4 ore) che successivi (12 ore).

Per l'analisi della citometria a flusso, erano necessari numeri di cellule molto più elevati e una durata di coltura più breve rispetto a quelli dei test MTT precedentemente condotti; pertanto, 2L3 cellule sono state seminate su piastre a pozzetti 6- e alle cellule è stata applicata una concentrazione più elevata di mNGAL (600–1200 µg/mL). I risultati hanno mostrato che 1200 µg/mL di mNGAL hanno inibito significativamente la vitalità cellulare dopo 4 e 12 ore di trattamento, mentre 600 µg/mL di mNGAL hanno inibito la vitalità cellulare solo dopo 4 ore di trattamento (Figura 3E). I test di apoptosi sono stati eseguiti mediante citometria a flusso per rilevare le cellule colorate con annessina V-FITC e PI. L'annessina V ha un'elevata affinità per la fosfatidilserina (PS) e viene utilizzata per identificare le cellule apoptotiche con PS esposta [33]. In base ai risultati della colorazione, le cellule possono essere classificate come normali (AV−/PI−), apoptosi precoce (AV+/PI−), apoptosi tardiva (AV+/PI+) e necrosi (AV−/PI+) e sono mostrate in diagrammi quadranti (Figura 3F). Le cellule nella fase apoptotica precoce mantengono le membrane intatte, il che differisce dalle cellule nella fase apoptotica tardiva con membrane disintegrate [34]. I risultati hanno mostrato che il tasso di apoptosi delle cellule 2L3 (inclusa l'apoptosi precoce AV+/PI− e tardiva AV+/PI+) era significativamente aumentato rispetto a quello del gruppo di controllo dopo 12 ore di trattamento con mNGAL (1200 µg/ml; Figura 3F, G ).

figura 1. Confronto dell'espressione NGAL tra cellule M-1 wild type e 2L3 ADPKD. (A) Struttura del tipo selvaggio e alleli L3 del gene Pkd1. La genotipizzazione della PCR è stata condotta utilizzando primer prima e dopo il primo loxP all'interno dell'introne 30 di Pkd1. Triangoli pieni: loxP; un gene di resistenza alla neomicina guidato dal promotore mc1 (mc1-neo) fiancheggiato da due siti loxP è stato inserito nell'introne 34 di Pkd1.(B) Genotipizzazione PCR dei trascritti Pkd1 delle cellule M-1 (473 bp) e cellule 2L3 (507 bp). Le trascrizioni Pkd1 dei topi wild-type (+/+), eterozigoti (L3/+) e omozigoti (L3/L3) sono state utilizzate come controllo. RT-qPCR ha mostrato che 2L3 aveva Pkd1 (C) M-1 significativamente più basso e le cellule 2L3 mostravano una morfologia simile. Barra della scala: 100 µm. (D) Le cellule M-1 e 2L3 sono state colorate con Lotus Tetragonolobus Lectin (LTL, etichettata con fluoresceina, verde) e Dolichos biflorus agglutinina (DBA, etichettata con Rhoda mine, rosso) e DAPI (blu) e osservate mediante un microscopio confocale. Barra della scala: 50 µm. RT-qPCR ha mostrato che 2L3 aveva livelli di espressione di Pkd1 (E) significativamente più bassi e Lcn2 (NGAL) (F) più alti rispetto a quelli delle cellule wild-type M-1. (G) Nessuna differenza significativa nei livelli di espressione di Slc22a17 (NGAL-R) tra le cellule M-1 e 2L3. RQ: quantificazione relativa=2 −ΔΔCt; Gapdh è stato utilizzato come controllo interno di ciascun campione. I valori sono stati normalizzati su M-1. (H) I risultati del Western blot hanno mostrato che 2L3