La lipocalina associata alla gelatina dei neutrofili secreta mostra una maggiore capacità di inibire l'allargamento della cisti delle cellule ADPKD rispetto alla forma non secreta Ⅳ

4. Discussione

In questo studio, abbiamo dimostrato che l'aggiunta e/o la sovraespressione di mNGAL secretola proteina ha ridotto la proliferazione delle cellule 2L3Eha inibito la crescita delle cisti in vitro sovraregolando l'apoptosie autofagia edownregolando le vie di segnalazione legate alla proliferazione. Per identificare se le cellule M-1, stabilite da loci simili dei tubuli renali di topo come cellule 2L3, potrebbero essere utilizzate come cellule di controllo wild-type per le cellule 2L3, colorazione con lectina delle cellule M-1 e 2L3 con LTL ed è stata eseguita la DBA (Figura 1D). LTL e DBA sono stati utilizzati per identificare rispettivamente i tubuli prossimali differenziati e i dotti collettori dei reni di topo [45,46]. I risultati indicano che le cellule M-1 hanno una morfologia (Figura 1C) e un'origine dei tubuli renali (Figura 1D) simili alle cellule 2L3; pertanto, la linea cellulare M-1 è stata selezionata come controllo wild-type per le cellule 2L3.

NUOVE ERBE PERADPKD(MALATTIA POLICISTICA RENALE)

Nella maggior parte dei casi clinici, i pazienti con ADPKD mostrano livelli più elevati di NGAL nelle urine rispetto alle persone normali [19,47–49]. Il modello murino ADPKD utilizzato in questo studio presenta anche livelli di espressione di NGAL e NGAL-R più elevati [31]. Sia i risultati RT-qPCR che quelli western blot hanno mostrato che le cellule 2L3 esprimevano livelli più elevati di NGAL rispetto alla linea cellulare M-1 wild-type (Figura 1F, H), mentre non è stata identificata alcuna differenza significativa nel livello di espressione di NGAL-R tra le due linee cellulari (Figura 1G, H), il che non è coerente con i risultati in vivo [31]. Questa differenza potrebbe essere dovuta alla complessa interazione all'interno dei tessuti del topo, che non si verifica nel sistema cellulare molto più semplice.

I risultati del western blot hanno mostrato che la somministrazione diretta e/o la sovraespressione genetica di mNGAL in 2L3 hanno inibito la via ERK. Come mostrato nelle Figure 4A e 8A, il segnale di p-ERK1 (44 kDa) era più debole di p-ERK2 (42 kDa), mentre ERK1 (44 kDa) era più intenso di ERK2 (42 kDa), causando un marcato aumento di p-ERK2/ERK2 rispetto a p-ERK1/ERK1 in tutti i gruppi sperimentali. ERK1 ed ERK2 sono due isoforme di ERK che è stato suggerito abbiano effetti diversi sulla proliferazione cellulare [50]. È stato identificato che ERK1 induce la sopravvivenza e la crescita cellulare; tuttavia, ERK2 promuove la differenziazione cellulare e blocca la crescita cellulare [51]. Nel nostro studio, il rapporto p-ERK2/ERK2 era notevolmente più alto di quello p-ERK1/ERK1 in tutti i gruppi, il che indicava che le cellule tendevano a differenziarsi e a ridurre la crescita. Tuttavia, sia l'aggiunta che la sovraespressione di mNGAL hanno ridotto drasticamente il rapporto sia di p-ERK1/ERK1 che di p-ERK2/ERK2 rispetto al gruppo di controllo e hanno portato a un rapporto significativamente più basso di p-ERK/ERK, che indica l'effetto mNGAL nell’inibizione della proliferazione cellulare.

Per stabilire una piattaforma di coltura 3D per la caratterizzazione e la valutazione del trattamento della formazione di cisti nelle cellule 2L3, sono state tentate diverse condizioni. È stato dimostrato che la concentrazione di Matrigel per la coltura 3D influenza la percentuale di cisti e tubuli strutturali formati in vitro [25,52,53]. Nel nostro studio, abbiamo scoperto che il 40% di Matrigel era la formula migliore per mostrare la formazione ottimale della struttura cistica delle cellule 2L3. C'erano diverse condizioni, inclusi modelli incorporati e modelli in alto per le culture 3D [54]. Abbiamo scelto il metodo in cima (modello a sandwich) per un modo migliore e più semplice per analizzare le cisti (Figura 6). Tuttavia, la nostra esperienza ha dimostrato che le cisti delle cellule 2L3 non erano sufficientemente grandi quando coltivate senza alcun induttore nella coltura 3D fino al giorno 14. La forskolina è comunemente usata per indurre la formazione di cisti attivando l'adenilato ciclasi (AC) per aumentare l'adenosina monofosfato ciclico (cAMP) [11,55]. Pertanto, nel nostro studio, abbiamo utilizzato forskolina (20 µM) per indurre la formazione di cisti nelle cellule 2L3 prima del trattamento mentale.

Il nostro studio precedente ha dimostrato che la sovraespressione di NGAL specifico per il rene nei topi 2L3 potrebbe rallentare la progressione dell’ADPKD diminuendo la dimensione della cisti ma non il numero di cisti nei topi 2L3 [31]. Nel presente studio, l'aggiunta del mentale ha inibito significativamente l'allargamento delle cisti delle cellule 2L3 sopprimendo il diametro, l'area e la percentuale della cisti di grandi dimensioni (Figura 6F, G, I), mentre non vi era alcuna differenza significativa nel tasso di aumento del totale numero di cisti (Figura 6H). I risultati della progressione della cisti 2L3 nella coltura 3D erano coerenti con i risultati in vivo. Tuttavia, il trattamento mNGAL ha inibito la crescita delle cisti delle cellule 2L3 nella coltura 3D, mentre abbiamo utilizzato una concentrazione più elevata di mNGAL (2 mg/mL) (Figura 6) rispetto ai precedenti esperimenti 2D (600 µg/mL) per il test MTT da esaminare l'effetto di mNGAL sulla vitalità cellulare (Figura 3). Abbiamo ipotizzato che l'mNGAL ricombinante purificato da E. coli mancasse di modificazione post-traduzionale [56,57] e risultasse in una bassa bioattività dell'mNGAL ricombinante. La sovraespressione di NGAL nelle cellule 2L3 mediante trasfezione di costrutti pN + LS e pN - LS potrebbe aiutare a chiarire questa domanda.

Per determinare se una concentrazione più elevata di mNGAL (2 mg/mL) utilizzata nella coltura 3D per sopprimere l'ingrossamento della cisti delle cellule 2L3 (Figura 6) fosse il risultato della mancanza di modificazione post-traduzionale di mNGAL e per verificare se NGAL dovesse essere secreto e interagire con NGAL-R per indurre l'apoptosi e inibire ulteriormente la progressione della cisti, i costrutti pN + LS e pN - LS sono stati trasfettati in cellule 2L3 per sovraesprimere le proteine ​​NGAL secrete e non secrete (Figura 7). Le cellule trasfettate in pool sono state raccolte una settimana dopo la selezione della blasticidina e sia la trasfezione pN + LS che quella pN − LS hanno aumentato notevolmente i livelli di espressione di mRNA di Lcn2 (totale, incluso NGAL sia endogeno che esogeno) e Lcn2-c-myc (esogeno NGAL) rispetto al gruppo di controllo (Figura 7F, G) e non vi era alcuna differenza significativa in Lcn2 e Lcn2-c-myc tra i gruppi pN + LS e pN - LS (Figura 7F, G). L'espressione di Lcn{{20}}myc nei gruppi pN + LS e pN - LS era circa 8500- volte maggiore di quella nelle celle 2L3 (Figura 7G); tuttavia, l'espressione di Lcn2 in pN + LS e pN - LS era circa 1,5-volte maggiore di quella nelle celle 2L3 (Figura 7F). In teoria, Lcn2-myc non era presente nelle cellule 2L3, portando a bassi livelli di espressione (di fondo) mediante RT–QPCR. Di conseguenza, il rapporto relativo di Lcn2-myc nelle cellule pN + LS e pN − LS era nettamente più alto (circa 8500 volte) rispetto a quello del gruppo di controllo 2L3, con conseguente grande differenza tra il rapporto relativo di Lcn2 e Lcn2-myc. Inoltre, il rapporto di espressione di Lcn2 nelle cellule pN + LS e pN − LS (pN + LS era 0,91-piega quello di pN − LS) era simile a quello di Lcn2-c-myc (pN + LS era 1,01-piega quello di pN - LS) (Figura 7F, G). L'espressione della proteina NGAL intracellulare nelle cellule pN + LS e pN - LS era aumentata rispetto a quella del gruppo di controllo (Figura 7I) e non vi era alcuna differenza significativa tra i gruppi pN + LS e pN - LS. I risultati del western blot per l'espressione totale della proteina NGAL nei gruppi pN + LS e pN - LS (pN + LS era 0,92- volte quello di pN - LS) (Figura 7I) erano coerenti con i risultati RT-qPCR (pN + LS era 0,91-piega quello di pN − LS) (Figura 7F). Secondo questi risultati, i livelli di proteine ​​NGAL (sia totali che esogene) nelle cellule pN + LS e pN - LS erano simili, il che indicava che i due gruppi avrebbero dovuto essere confrontati in ulteriori esperimenti.

Abbiamo previsto che la sovraespressione di NGAL senza un peptide segnale non avrebbe aumentato la secrezione di NGAL nonostante l'alto livello di espressione intracellulare di NGAL. Tuttavia, i risultati ELISA utilizzando il surnatante della coltura hanno mostrato che sia le cellule pN + LS che pN - LS avevano livelli significativamente più alti di NGAL secreto rispetto alle cellule di controllo 2L3 (Figura 7J), mentre la quantità di NGAL secreta dalle cellule pN - LS era significativamente inferiore a quello delle cellule pN + LS (Figura 7J). Questi risultati hanno rivelato che la sovraespressione di NGAL senza peptide segnale (pN - LS) limitava la secrezione di NGAL, sebbene all'interno delle cellule fossero identificati alti livelli di mRNA e proteina NGAL intracellulare (Figura 7F, I). I risultati dell'incorporazione di BrdU hanno mostrato una proliferazione significativamente più elevata delle cellule pN - LS rispetto alle cellule pN + LS (Figura 7K).

Le quantità intracellulari e di secrezione di NGAL erano rispettivamente circa 1,6-volte e 2,2-volte più alte in pN + LS rispetto alle cellule 2L3 (Figura 7I, J), il che potrebbe portare all'inibizione di pN + LS rispetto alla proliferazione cellulare 2L3 (Figura 7K). Tuttavia, le quantità intracellulari e secrete di NGAL nelle cellule 2L3 erano rispettivamente circa 4-volte e 5,3-volte più alte di quelle nelle cellule M-1 (Figura 1H, I), mentre più alte la proliferazione cellulare è stata osservata nelle cellule 2L3 rispetto alle cellule M-1 (Figura 2C). Sospettiamo che l'aumento dell'espressione e della secrezione di NGAL, che svolgono un ruolo protettivo nelle cellule 2L3, non sia sufficiente per inibire la proliferazione cellulare risultante dal knockout di Pkd1, ma l'aumento dell'espressione e della secrezione di NGAL in pN + LS fornisce NGAL supplementare per ottenere la soppressione della proliferazione. Nel nostro studio precedente, i topi Pkd1L3/L3 avevano livelli renali significativamente maggiori di proteina NGAL e antigene nucleare delle cellule proliferanti (PCNA) rispetto ai topi Pkd1+/+ [31]. Tuttavia, il livello renale della proteina NGAL nei topi Pkd1L3/L3 × NGALTg/Tg era circa 2- volte superiore a quello dei topi Pkd1L3/L3 × NGAL+/+ e la sovraespressione di NGAL ha portato a livelli marcatamente più bassi di PCNA nei topi Pkd1L3 /L3 × NGALTg/Tg rispetto ai topi Pkd1L3/L3 × NGAL+/+ e ha ulteriormente inibito la crescita delle cisti e prolungato i giorni di sopravvivenza [31]. L'NGAL sembra svolgere un ruolo protettivo nell'inibire l'aumento della proliferazione nei modelli di ADPKD, mentre l'espressione endogena di NGAL è insufficiente e l'NGAL esogeno supplementare può aiutare.

Secondo i risultati della coltura 3D (Figura 10), entrambi i gruppi pN + LS e pN - LS hanno inibito la crescita delle cisti abbassando il diametro (Figura 10C), l'area (Figura 10D) e la percentuale di cisti grandi (diametro > 100 µm) (Figura 10F), ma non i numeri (Figura 10E). Questa scoperta non è coerente con il nostro sospetto che solo pN + LS ma non pN - LS inibisca l'ingrossamento delle cisti perché la secrezione di mNGAL dalle cellule 2L3 è necessaria per l'inibizione della proliferazione cellulare. Tuttavia, l'inibizione dell'allargamento della cisti da parte di pN - LS è stata inferiore rispetto a pN + LS (Figura 10B-D), il che ha rivelato che la sovraespressione di mNGAL secreto aveva una capacità superiore di inibire l'allargamento della cisti di cellule 2L3 nella coltura 3D rispetto a quella di mNGAL non secreto . Sebbene osserviamo una maggiore soppressione dell'allargamento della cisti nel gruppo pN + LS rispetto al gruppo pN - LS nella coltura 3D, è difficile vedere l'effetto migliore di pN + LS rispetto a pN - LS in p-AKT/AKT (Figura 8B ), p-CREB/CREB (Figura 8C) e p62 (Figura 9D). È stato dimostrato che l’accoppiamento NGAL e NGAL-R può sequestrare il ferro intracellulare e indurre ulteriormente l’apoptosi [29], che è associata a una strategia di deplezione del ferro del sistema immunitario innato contro le infezioni batteriche [30]. Abbiamo proposto che l'mNGAL secreto inducesse l'apoptosi nelle cellule 2L3 attraverso l'interazione con NGAL-R, mentre l'mNGAL non secreto non poteva interagire con NGAL-R per indurre l'apoptosi (Figura 9A, B). È stato dimostrato che le vie Ras/B-Raf/MEK/ERK [10,11] e AKT/mTOR [38] sono sovraregolate nelle cellule ADPKD, il che porta ad un aumento della proliferazione cellulare e all'ingrossamento delle cisti. I nostri risultati hanno mostrato che il mNGAL secreto ha inibito le vie ERK (Figura 8A) e AKT (Figura 8B) e la via ERK inattivata mNGAL non secreto (Figura 8A). Ciò suggerisce che l’inattivazione mentale della via ERK potrebbe non essere necessaria attraverso NGAL-R. Per esplorare la questione verrà effettuato il knockout di NGAL-R nelle cellule 2L3

Inoltre, la sovraespressione di mNGAL nelle cellule 2L3 ha inibito l'allargamento della cisti cellulare (Figura 10) e si è verificata con una secrezione di NGAL relativamente inferiore (2,27 ng/ml) (Figura 7J) rispetto all'effetto con un'alta concentrazione di mNGAL (2 mg/ml). mL) applicato nei precedenti esperimenti di coltura 3D (Figura 6). Questo risultato potrebbe essere dovuto alla mancanza di modifica post-traduzionale del mNGAL da E. coli utilizzato in esperimenti precedenti, che richiedevano un'elevata dose di mNGAL per inibire l'ingrossamento della cisti (Figura 6). Per esaminare ulteriormente se una modifica post-traduzionale dell'mNGAL sia il fattore responsabile della richiesta di più mNGAL ricombinante da E. coli, in ulteriori studi verrà utilizzato un mezzo condizionato comprendente mNGAL secreto da una linea cellulare di topo.

Nel presente studio, le cellule pN + LS e pN - LS utilizzate per RT-qPCR, western blotting, ELISA, incorporazione di BrdU e coltura 3D sono state ottenute da un pool policlonale misto, che aveva vari livelli di espressione del transgene nella popolazione mista. L'identificazione del meccanismo dell'mNGAL nelle cellule ADPKD 2L3 mediante i metodi sopra descritti utilizzando cellule clonali dovrebbe aiutare a trovare strategie per il futuro trattamento clinico dell'ADPKD.

5. Conclusioni

In questo studio, abbiamo esplorato il meccanismo alla base della ridotta progressione della cisti in presenza di NGAL utilizzando una linea cellulare ADPKD immortalata. L'aggiunta di mNGAL ricombinante ha inibito la proliferazione cellulare nelle cellule ADPKD. L'analisi patologica ha mostrato che mNGAL diminuiva la proliferazione e induceva percorsi di apoptosi e autofagia nelle cellule ADPKD. Inoltre, è stata creata una piattaforma di coltura cellulare 3D per identificare la progressione della cisti e ha dimostrato che l'aggiunta di mNGAL ricombinante ha inibito l'allargamento della cisti. Inoltre, la sovraespressione di mNGAL secreto (pN + LS) ha avuto un effetto più forte nell’inibire l’ingrossamento delle cisti delle cellule ADPKD rispetto a quello di mNGAL non secreto (pN − LS), sebbene entrambe le forme abbiano ridotto il diametro della cisti, l’area e la percentuale di cisti di grandi dimensioni, così come i loro effetti sulla proliferazione, apoptosi e autofagia. Concludiamo che l'mNGAL secreto ha una capacità più pronunciata e costante di inibire l'ingrossamento delle cisti rispetto a quello dell'mNGAL non secreto nelle cellule ADPKD. Il nostro lavoro potrebbe aiutare a identificare strategie per il futuro trattamento clinico dell’ADPKD.

Materiali supplementari: video supplementari a questo articolo possono essere trovati online (1) Video S1: Costruzione di una cisti nella cultura 3D: https://reurl.cc/Kjy8rq (accesso il 26 novembre 2021); (2) Video S2: sezioni Z-stack di una cisti in coltura 3D: https://reurl.cc/VXGY5y (visitato il 26 novembre 2021). Grafico supplementare: i controlli negativi per Fig 1D (tralasciando la colorazione LTL e DBA) sono disponibili online all'indirizzo https://reurl.cc/LpMmje (accesso il 26 novembre 2021). Contributi dell'autore: Concettualizzazione, W.-YJ, HMH-L. e Y.-YC; cura dei dati, H.-YC; analisi formale, H.-YC; acquisizione di finanziamenti, HMH-L. e Y.-YC; metodologia, H.-YC, W.-YJ, EW, C.-MH, HMH-L. e Y.-YC; amministrazione del progetto, H.-YC e HMH-L.; risorse, W.-YJ, S.-TJ e Y.-YC; supervisione, HMH-L.; visualizzazione, H.-YC; scrittura-bozza originale, H.-YC e HMH-L.; scrittura-revisione e editing, H.-YC e HMH-L. Tutti gli autori hanno letto e accettato la versione pubblicata del manoscritto. Finanziamento: questa ricerca è stata finanziata dalle sovvenzioni 107-2622-B-006-005-CC2 e 108-2622-B-006-002- CC2 del Ministero della Scienza e della Tecnologia (MOST) e della sede centrale per l'avanzamento universitario dalla National Cheng Kung University, Tainan, Taiwan (Yuan-Yow Chiou). Dichiarazione del Comitato di Revisione Istituzionale: Non applicabile. Dichiarazione di consenso informato: non applicabile. Dichiarazione sulla disponibilità dei dati: i dati generati durante lo studio sono disponibili presso l'autore corrispondente su richiesta. Ringraziamenti: Gli autori sono grati per l'assistenza del Molecular Imaging Core Facility della National Taiwan Normal University sotto gli auspici del MOST. Ringraziamo la National RNAi Core Facility presso l'Academia Sinica di Taiwan per aver fornito particelle virali, plasmidi e servizi correlati. Ringraziamo Shu-Wen Lo per l'assistenza con l'editing grafico. Conflitti di interessi: gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi.

Riferimenti

1. Bergmann, C.; Guay-Woodford, LM; Harris, PC; Horie, S.; Peters, DJ; Torres, VE Malattia del rene policistico. Naz. Rev.Dis. Primer 2018, 4, 50. [CrossRef] [PubMed]

2. Grantham, JJ Pratica clinica. Malattia del rene policistico autosomico dominante. N. ingl. J.Med. 2008, 359, 1477–1485. [CrossRef] [PubMed]

3. Chapman, AB; Devuyst, O.; Eckardt, K.-U.; Gansevoort, RT; Harris, T.; Horie, S.; Kasiske, BL; Odland, D.; Pei, Y.; Perrone, RD; et al. Malattia del rene policistico autosomico dominante (ADPKD): sintesi esecutiva di una conferenza sulle controversie sulla malattia renale: miglioramento dei risultati globali (KDIGO). Rene Int. 2015, 88, 17–27. [CrossRef] [PubMed]

4. Grantham, JJ; Mulamalla, S.; Swenson-Fields, KI Perché i reni falliscono nella malattia renale policistica autosomica dominante. Naz. Rev. Nefrolo. 2011, 7, 556–566. [CrossRef] [PubMed]

5. Harris, PC; Torres, VE Meccanismi genetici e vie di segnalazione nella malattia renale policistica autosomica dominante. J. Clin. Investigare 2014, 124, 2315–2324. [CrossRef] [PubMed]

6. Ong, AC; Harris, PC Una visione incentrata sulla policistina della formazione e della malattia delle cisti: le policistine rivisitate. Rene Int. 2015, 88, 699–710. [RifCroce]

7. Weimbs, T. Segnalazione del terzo colpo nella formazione di cisti renali. J. Am. Soc. Nefrolo. 2011, 22, 793–795. [RifCroce]

8. Hanaoka, K.; Guggino, il cAMP del WB regola la proliferazione cellulare e la formazione di cisti nelle cellule della malattia renale policistica autosomica. J. Am. Soc. Nefrolo. 2000, 11, 1179–1187. [RifCroce]

9. Starremans, P.; Li, X.; Finnerty, P.; Guo, L.; Takakura, A.; Neilson, E.; Zhou, J. Un modello murino per la malattia del rene policistico attraverso una delezione somatica in-frame nell'estremità 5' di Pkd1. Rene Int. 2008, 73, 1394–1405. [RifCroce]

10. Yamaguchi, T.; Nagao, S.; Wallace, DP; Belibi, FA; Cowley, BD; Ortografia, JC; Grantham, JJ Cyclic AMP attiva B-Raf ed ERK nelle cellule epiteliali delle cisti dei reni policistici autosomici dominanti. Rene Int. 2003, 63, 1983–1994. [RifCroce]

11. YamaguchiJill, T.; Ortografia, JC; Ramaswamy, NT; Eppler, JW; Wallace, DP; Nagao, S.; Roma, LA; Sullivan, LP; Grantham, JJ cAMP stimola la proliferazione in vitro delle cellule epiteliali delle cisti renali attivando la via extracellulare della chinasi regolata dal segnale. Rene Int. 2000, 57, 1460–1471. [CrossRef] [PubMed]

12. Zhu, P.; Sieben, CJ; Xu, X.; Harris, PC; Lin, X. Gli attivatori dell'autofagia sopprimono la cistogenesi in un modello di malattia renale policistica autosomica dominante. Ronzio. Mol. Genetta. 2016, 26, 158–172. [CrossRef] [PubMed]

13. Belibi, F.; Zafar, I.; Ravichandran, K.; Segvic, AB; Jani, A.; Ljubanovic, direttore generale; Edelstein, CL Fattore inducibile dall'ipossia-1 (HIF-1) e autofagia nella malattia del rene policistico (PKD). Sono. J. Physiol.-Ren. Fisiolo. 2011, 300, F1235–F1243. [CrossRef] [PubMed]

14. Chun, Y.; Kim, J. Autofagia: un programma di degradazione essenziale per l'omeostasi e la vita cellulare. Celle 2018, 7, 278. [CrossRef]

15. Rubinsztein, DC; Shpilka, T.; Elazar, Z. Meccanismi della biogenesi dell'autofagosoma. Curr. Biol. 2012, 22, R29–R34. [RifCroce]

16. Mukhopadhyay, S.; Panda, PK; Sinha, N.; Das, DN; Bhutia, SK Autofagia e apoptosi: dove si incontrano? Apoptosi 2014, 19, 555–566. [RifCroce]