In che modo la sostanza vegetale Acteoside inibisce le cellule tumorali?

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ASTRATTO

I prodotti naturali sono caratterizzati da un'estrema diversità strutturale e quindi offrono una fonte unica per l'identificazione di nuovi agenti antitumorali. Qui riportiamo che la sostanza vegetaleacteosideessere isolato con metodi fitochimici avanzati dalle foglie di Lippia citriodora ha mostrato una maggiore citotossicità contro le cellule tumorali metastatiche; agito in sinergia con vari agenti citotossici e cellule cancerose chemioresistenti sensibilizzate.Atteosidida erba cistanchcenon era tossico in contesti cellulari fisiologici, mentre aumentava il carico ossidativo, influenzava l'attività dei moduli proteostatici e sopprimeva le metalloproteinasi della matrice nelle linee cellulari tumorali. Somministrazione intraperitoneale o orale (tramite acqua da bere).cistanceacteoside in un modello murino di melanoma le risposte antiossidanti sovraregolate nei tumori; tuttavia, solo la somministrazione intraperitoneale ha soppresso la crescita del tumore e ha indotto risposte immunitarie antitumorali reattive. L'identificazione/analisi di quantificazione mediante spettrometria di massa ha rivelato che la somministrazione intraperitoneale diacteosideha determinato una concentrazione significativamente più alta, rispetto alla somministrazione orale, del composto nel plasma e nei tumori dei topi trattati, suggerendo che l'effetto antitumorale in vivo dipende dalla via di somministrazione e dalla concentrazione raggiunta nel tumore. Infine, studi di modellistica molecolare e saggi di attività enzimatica hanno mostrato che l'acteoside inibisce la proteina chinasi C. In conclusione, l'acteoside è promettente come impalcatura chimica per lo sviluppo di nuovi agenti antitumorali.

Parole chiave:Atteosidi, Cancro, Composto naturale, Stress ossidativo, Proteostasi, Immunomodulazione

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1. Introduzione

La cancerogenesi è caratterizzata dalla deregolazione di diverse vie di segnalazione cellulare ed è associata ad un aumento dello stress cellulare ossidativo, replicativo, metabolico, genotossico e proteotossico [1]. Per adattare e superare questi fenotipi di stress, le cellule maligne sovraregolano (a parte gli oncogeni) diversi percorsi non oncogeni che mirano a sopprimere o (almeno) alleviare lo stress in corso. Tra le varie vie non oncogeniche trovate frequentemente sovraregolate durante la tumorigenesi ci sono i moduli della rete di proteostasi (PN) insieme alle risposte antiossidanti cellulari [2,3].

I componenti chiave della PN sono i due principali meccanismi di degradazione, vale a dire la via dell'autofagia-lisosoma (ALP) e la via dell'ubiquitina-proteasoma (UPP), insieme alla rete degli accompagnatori molecolari cellulari. L'ALP è principalmente coinvolta nella degradazione degli aggregati proteici e degli organelli danneggiati [4], mentre l'UPP degrada le normali proteine ​​​​di breve durata e le proteine ​​​​mal ripiegate o spiegate non riparabili [5-8]. Il proteasoma 26Seucariotico è costituito dalle particelle regolatrici 19S (RP) e dalla particella 20 Score (CP); quest'ultimo è composto da quattro anelli eptamerici sovrapposti (due di tipo circondanti due di tipo) che formano una struttura a botte. Le attività della peptidasi proteasoma simile alla chimotripsina (CT-L), alla tripsina (TL) e alla caspasi (CL) si trovano rispettivamente nelle subunità proteasomiali 5, 2 e 1 [6]. La dimostrata efficacia clinica degli inibitori del proteasoma Bortezomib (Velcade®; chiamato anche PS-341) e Carfifilzomib contro varie neoplasie ematologiche [9] ha fornito la "prova di concetto" del targeting dell'UPP come strategia promettente per il trattamento del cancro. La complessa rete di vie di difesa antiossidanti cellulari che sono frequentemente sovraregolate durante la carcinogenesi [3,10] include enzimi antiossidanti, così come diversi fattori di trascrizione che mobilitano le risposte genomiche citoprotettive; questi includono il forkhead box O (Foxo) e il fattore correlato all'eritroide 2-fattore nucleare (Nrf-2). Nrf-2 è fondamentale nella protezione delle cellule dal danno ossidativo e/o xenobiotico poiché stimola l'espressione dei geni antiossidanti e di fase II [11-13].

Noi e altri abbiamo recentemente proposto che il targeting di queste dipendenze tumorali (cioè i moduli proteostatici e/o le vie di risposta antiossidante) o l'aumento dei livelli cellulari di ROS nel contesto di un genotipo trasformato offrono una potenziale finestra terapeutica per l'uccisione selettiva delle cellule tumorali [3 ,14]; a supporto, è stata segnalata l'uccisione selettiva delle cellule tumorali da parte di una piccola molecola che sovraregola i livelli di ROS cellulari [2]. Ci si aspetta che gli approcci combinatori che includono anche l'attivazione di risposte immunitarie reattive antitumorali [15] massimizzeranno probabilmente la finestra terapeutica offerta dall'inibizione della PN e delle risposte antiossidanti e/o dall'aumento dei livelli di ROS cellulari.

I prodotti naturali (estratti o composti puri) (NP) di varie fonti (piante, organismi marini, microrganismi, ecc.) sono sottoposti a screening per la loro capacità di agire come agenti antitumorali a causa della loro estrema diversità strutturale e complessità chimica, nonché perché agiscono pleiotropicamente modulando diverse vie di segnalazione cellulare [16]. Secondo quanto riferito, le NP attivano risposte antinfiammatorie, antitumorali e/o anti-metastatiche [16,17] ed eludono anche la resistenza multifarmaco [18,19]. Tra questi, i composti fenolici (compresi i glicosidi feniletanoidi) hanno suscitato un notevole interesse a causa del loro ruolo riportato nella prevenzione e/o nel trattamento di varie malattie umane.

L'acteoside, chiamato anche kusagin o verbascoside [20], è un glicoside feniletanoide isolato da molti dicotiledoni. Secondo quanto riferito, l'acteoside esercita alcune interessanti attività biologiche, tra cui proprietà antiossidanti, antinfiammatorie e di regolazione dell'apoptosi cellulare [21,22]. Tuttavia, la sua potenziale attività antitumorale non è stata affrontata. Segnaliamo qui, che l'acteoside ha mostrato una maggiore citotossicità contro le cellule tumorali dei mammiferi senza effetti tossici apparenti in contesti cellulari fisiologici. Inoltre, l'acteoside ha soppresso la crescita del tumore del melanoma in un modello murino in vivo, attivando (tra gli altri) risposte immunitarie antitumorali reattive.

estratto di cistanche antitumorale

2. Materiali e metodi

2.1. Materiale vegetale ed estrazione

Le foglie essiccate di Lippia citriodora (Lamiaceae) (4,5 kg) sono state acquistate dal mercato locale di Atene, in Grecia. Le foglie sono state polverizzate ed estratte mediante agitazione meccanica per 12 ore con metanolo (2 × 20 L). L'estratto metanolico è stato evaporato a secco e lavato con una miscela di CH2Cl2/MeOH 98/2 (15 L). Il residuo insolubile è stato separato ed essiccato, producendo una polvere giallo-verde (450 g).

2.2. Purificazione dell'acteoside e analisi UPLC-HRMS

Una porzione (10 g) del suddetto residuo è stata sottoposta a cromatografia in controcorrente utilizzando un apparato di cromatografia a partizione centrifuga veloce (FCPC) (Kromaton, Francia); come sistema solvente bifasico è stata utilizzata una miscela di EtOAc/EtOH/H2O in rapporto 5/0,5/4,5. Le frazioni raccolte sono state sottoposte a cromatografia su strato sottile; quindi i cromatogrammi sono stati osservati sotto una lampada UV (254 e 365 nm) e visualizzati spruzzando con metanolo vanillina solfato seguito da riscaldamento per due minuti. Un totale di 2,1 g di acteoside (purezza maggiore o uguale al 90 percento) è stato isolato mediante il suddetto processo. L'identificazione dell'acteoside è stata eseguita mediante risonanza magnetica nucleare (NMR) e spettri di spettrometria di massa (MS), mentre la sua purezza è stata stabilita mediante analisi UPLC-MS e NMR; per i dettagli vedere suppl. Materiali e metodi.

2.3. Linee cellulari

I fibroblasti embrionali polmonari umani (cellule IMR90) insieme alle linee cellulari di topo B16.F1, B16.F10, YAC{5}} e WEHI-164 sono stati ottenuti dall'American Tissue Culture Collection (ATCC). Le linee cellulari di osteosarcoma umano U2 OS e Sa OS sono state gentilmente donate dal Prof. V. Gorgoulis (Scuola di Medicina, Università Nazionale e Kapodistriana di Atene, Grecia), mentre le cellule di osteosarcoma KH OS e le linee cellulari di osteosarcoma chemioresistente [23] sono state una donazione del Dr. E. Gonos (National Hellenic Research Foundation, Grecia). Le linee cellulari di cancro del topo C5N e A5 appartengono a un modello multistadio di carcinogenesi cutanea del topo [24,25] e sono state donate dal Prof. A. Balmain (Comprehensive Cancer Center, University of California, USA). Le condizioni di coltura delle linee cellulari utilizzate sono riportate in Suppl. Materiali e metodi.

beneficio dell'estratto di cistanche: anticancro

2.4. Modello murino di melanoma

Topi maschi C57BL/6 (25–30 g di peso, 6–8 settimane di età) sono stati ottenuti dall'Hellenic Pasteur Institute e alloggiati a temperatura controllata (22 gradi) e fotoperiodo (12 h luce: 12 h buio) con libero accesso ad acqua e cibo. I topi sono stati inoculati per via sottocutanea con 105 cellule di melanoma B16.F1 (in 100 μL di PBS) e sono stati assegnati in modo casuale a 3 gruppi (n=5/gruppo). Quando i tumori sono diventati palpabili (giorno 11) i topi hanno ricevuto acteoside attraverso due vie; per via intraperitoneale (IP) (1 mg/topo diluito in 200 μL di PBS; in totale 6 dosi somministrate a giorni alterni) o per via orale mediante acqua potabile (OR) (2,5 mg/topo; in totale 13 dosi per 13 giorni consecutivi). Ai topi di controllo è stato somministrato PBS. La crescita del tumore è stata registrata ogni 2 giorni misurando gli assi maggiore e minore dei tumori formati con un calibro digitale. Le misurazioni sono state trasformate in volume del tumore utilizzando la formula: volume del tumore (cm3)=asse maggiore × asse minore2 × 0,5. Il giorno 28, gli animali sono stati soppressi per lussazione cervicale e le milze sono state rimosse in modo asettico. L'esperimento è stato ripetuto tre volte con risultati simili.

Gli splenociti sono stati isolati da milze omogeneizzate individualmente e immediatamente testati per la loro citotossicità rispetto ai bersagli cellulari B16.F1, YAC-1 e WEHI-164. La citotossicità è stata valutata sulla base del rilevamento dell'esposizione al CD107 sulla superficie cellulare, come risultato della degranulazione delle cellule effettrici. Gli splenociti (105 cellule/pozzetto) sono stati co-coltivati ​​con bersagli in 96-micropiastre del fondo del pozzetto U con un rapporto effettore-bersaglio (E:T) di 100:1, a 37 gradi in 5% di CO2. In ciascun pozzetto sono stati aggiunti anticorpi monoclonali anti-CD107a e anti-CD107 b coniugati con FITC (25 μL/mL) e monensina (6 μL/mL; tutti da BD Biosciences). Le cellule sono state raccolte 6 ore dopo e analizzate utilizzando un citometro a flusso FACSCanto II. Parallelamente, i tumori sono stati asportati ed elaborati per i test a valle come descritto in Suppl. Materiali e metodi.

Effetti dell'estratto di cistanche: antitumorale e antitumorale