Sidt2 è una proteina chiave nel percorso di degradazione autofagia-lisosomiale ed è essenziale per il mantenimento della struttura renale e della funzione di filtrazione Ⅱ
Nov 07, 2023
DISCUSSIONE
Un gran numero di studi hanno dimostrato che le LMP sono coinvolte nella funzione renale o nell’omeostasi strutturale [21–25]. Il nostro studio precedente ha scoperto che LMP Sidt2 influenza la via di segnalazione infiammatoria e provoca danni alle cellule mesangiali glomerulari del topo [28]. In questo studio, per la prima volta, abbiamo studiato gli effetti sulla struttura e sulla funzione dei reni dei topi causati dall'LMP Sidt2. Si è scoperto che la delezione di Sidt2 porta alla fusione dei processi del piede renale di topo, all'ispessimento della membrana basale, all'edema delle cellule epiteliali tubulari renali, al danno dei microvilli e all'aumento della proteinuria a 24 ore, indicando che la perdita di Sidt2 porta a una compromissione della funzione di filtrazione e la struttura del rene del topo, ma il suo meccanismo dettagliato non è chiaro.
Poiché le LMP sono importanti unità funzionali del lisosoma [17] edisfunzione lisosomialeè uno dei fattori patogeni comuni di molte malattie renali croniche (CDK) (rif. [4, 29]), abbiamo effettuato indagini correlate sui lisosomi dopo la delezione di Sidt2 e scoperto che il numero di lisosomi acidi è diminuito e il pH del i lisosomi sono aumentati in vitro. Tuttavia, non sono stati riscontrati cambiamenti evidenti nel numero di lisosomi primari legati agli autofagosomi e nei lisosomi totali mediante analisi al microscopio elettronico. Le catepsine rappresentano il gruppo più numeroso di enzimi proteolitici nei lisosomi [30], tra cui CTSB è una delle proteasi lisosomiali più abbondanti [31].
Poiché le catepsine devono essere acidificate per la maturazione (attivazione), un cambiamento nel pH porterà eventualmente ad una significativa riduzione della degradazione delle proteine [32]. I livelli in vivo e in vitro hanno mostrato una diminuzione dell'attività e del contenuto dell'idrolasi dell'acido lisosomiale, confermando ulteriormente che Sidt2 inibisce la funzione lisosomiale influenzando la maturazione delle proteasi nei lisosomi.
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Nel frattempo, il lisosoma funge da centro di riciclaggio per la degradazione dei metaboliti cellulari e dei prodotti di scarto alla fine dell’autofagia [1]. La normale funzione di degradazione lisosomiale è essenziale per l'autofagia, per il mantenimento dell'omeostasi cellulare e per consentire alle cellule di sopravvivere negli stati fisiologici [33-36]. È stato dimostrato che la comparsa e lo sviluppo di molte malattie renali sono correlati ad un’autofagia anomala [37-39]. Studi recenti hanno scoperto che Sidt2 è un trasportatore di DNA/RNA lisosomiale. I tipi non convenzionali di autofagia attraverso RNautofagia e DNautofagia (RDA) sono importanti per la degradazione selettiva di RNA/DNA [40]. Abbiamo precedentemente scoperto che la delezione di Sidt2 danneggia la fusione di autofagosomi e lisosomi, impedendo la degradazione dei mitocondri danneggiati, con conseguenti danni alla struttura e alla funzione del muscolo scheletrico [41]. Pertanto, in questo studio, abbiamo esplorato l'autofagia quando il danno renale era causato dalla delezione di Sidt2. Abbiamo osservato che gli autofagolisosomi venivano accumulati nei reni dei topi Sidt2−/− attraverso la microscopia elettronica. L'autofagia è un processo dinamico, inclusa la formazione di autofagosomi e la formazione e degradazione degli autofagolisosomi. La formazione dei primi autofagosomi è controllata dal gene Atg e la formazione di LC3-II è un segno della formazione di autofagosomi [42]. Abbiamo scoperto che le espressioni delle proteine correlate all'autofagia Atg e LC3-II aumentavano entrambe dopo la delezione di Sidt2, indicando che l'attività dell'autofagia potrebbe essere migliorata. Tuttavia, l'accumulo di LC3-II può anche essere causato dal blocco del percorso degli autofagolisosomi alla fine dell'autofagia
Per esplorare ulteriormente l'effetto di Sidt2 sullo stato dell'autofagia renale, sono state misurate l'espressione e la formazione della proteina cargo P62 e sono stati studiati anche gli effetti dei farmaci che mirano all'autofagia (CQ e RAPA). P62 deve essere combinato con LC3B e poi degradato nel lisosoma. Un aumento del livello della proteina P62 rappresenta spesso un blocco del flusso autofagico [43]. Per eliminare la causa dell'aumento della produzione di P62, abbiamo misurato il livello di mRNA di P62 e abbiamo scoperto che la produzione di P62 era ridotta, quindi l'accumulo di LC3-II era probabilmente dovuto ad una degradazione ostacolata. Per esplorare ulteriormente il processo di autofagia, abbiamo condotto un esperimento di flip con clorochina. La clorochina può neutralizzare l’ambiente acido del lisosoma e, successivamente, distruggere la funzione del lisosoma e inibire l’autofagia [44]. L'aumento della proteina LC3-II prima e dopo il trattamento con CQ riflette il numero di autofagosomi degradati dai lisosomi, che possono riflettere l'attività dell'autofagia. Lo stesso test del flip CQ può essere utilizzato anche per determinare la quantità di degradazione di P62 attraverso la via dell'autofagolisosoma. Coerentemente con i nostri risultati, la cancellazione di Sidt2 ha portato a una riduzione del flusso autofagico a causa dell'estremità bloccata dell'autofagia. Allo stesso tempo, nell'esperimento RAPA, i livelli delle proteine LC3-II e P62 sono aumentati significativamente nel gruppo Sidt2−/−, il che può ulteriormente supportare il fatto che la mancanza di Sidt2 compromette la fase finale dell'autofagia.
La fase finale dell'autofagia comprende la formazione e la degradazione degli autofagolisosomi. Abbiamo utilizzato esperimenti di co-localizzazione con immunofluorescenza LAMP1 e LC3B per rilevare la fusione di autofagosomi e lisosomi [45, 46] e i risultati hanno mostrato che la fusione di autofagosomi e lisosomi è stata bloccata dopo la delezione di Sidt2. L'esperimento di doppia etichettatura Ad-mCherry-GFP-LC3B rileva la formazione e la degradazione degli autofagolisosomi [27]. Ha inoltre confermato che il blocco della formazione e della degradazione degli autofagolisosomi è la ragione principale del danno alla struttura e alla funzione renale dopo la delezione di Sidt2.
Dai risultati sopra riportati, possiamo concludere che l'assenza di Sidt2 provoca una diminuzione del numero di lisosomi acidi e che la disfunzione dell'acidificazione dei lisosomi influisce sulla maturazione degli enzimi idrolizzati. Questa potrebbe essere la causa più importante di danno al percorso di degradazione dell'autofagia-lisosoma oltre ai disturbi della fusione dell'autofagosoma e del lisosoma. Nel frattempo, il processo di autofagia compromesso può essere strettamente correlato alla struttura renale danneggiata e alla funzione del filtro dopo la delezione di Sidt2 (Fig. 8). Il nostro studio affronta solo parte degli effetti di Sidt2 sulla struttura e sulla funzione renale, ma ciò che è interessante è che l’accumulo di proteine chiave dell’autofagia e il deterioramento della struttura e della funzione renale causato dalla delezione di Sidt2 sono simili ai cambiamenti nelle proteine chiave dell’autofagia e aumento significativo della proteinuria osservato nella nefropatia diabetica [37, 47]. La riparazione della funzione lisosomiale può rappresentare una potenziale nuova strategia per il trattamento della nefropatia diabetica [37]. Ci aspettiamo che Sidt2 fornisca un modo per esplorare la patogenesi e il trattamento delle malattie renali in futuro.
Test delle proteine urinarie nei topi Topi WT di 12-settimane e topi maschi Sidt2−/− selezionati casualmente sono stati posti in gabbie metaboliche e tenuti a digiuno ma trattati con acqua. Sono stati raccolti campioni di urina delle 24 ore e quindi analizzati per le proteine urinarie (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, CHN, C035-2-1) (fare riferimento ai materiali supplementari per i metodi dettagliati). Le cellule podociti glomerulari di topo MPC5 sono state acquistate dalla BeNa Culture Collection e coltivate con FBS al 10% (Excell Bio, Sud America, FSP500) e DMEM a basso contenuto di glucosio (Sigma-Aldrich, 6046). Le cellule mesangiali glomerulari di topo SV40 MES 13 sono state acquistate dalla tipica banca cellulare del comitato di conservazione della coltura dell'Accademia cinese delle scienze e coltivate con FBS al 10% (Excell Bio, Sud America, FSP500) e DMEM ad alto contenuto di glucosio (Sigma-Aldrich, 6429) . La concentrazione di CO2 della scatola di coltura cellulare è stata mantenuta al 5% e la temperatura è stata mantenuta a 37 gradi. La clorochina (CQ) e la rapamicina (RAPA) sono state acquistate da Sigma-Aldrich (C6628, V900930). 10 mM di CQ e 25 mg/mL di rapamicina sono stati entrambi sciolti in acqua ultrapura. CQ è stato aggiunto alla capsula Petri in modo che la concentrazione finale fosse di 50 μM e incubato per 16 ore come inibitore dell'autofagia. La rapamicina è stata aggiunta alla capsula Petri ad una concentrazione finale di 15 μM e incubata per 2 ore come attivatore dell'autofagia. Il sistema vettoriale lentivirus di modifica genetica CRISPR/Cas9 è stato utilizzato per rimuovere il gene Sidt2. Sono stati acquistati plasmidi Lenticrispr-v2 (AddgenePlasmid49535, Feng Zhang) e lo strumento di progettazione online sgRNA (http://crispr.mit.edu/) è stato utilizzato per progettare sgRNA mirati a Sidt2.
Le sequenze di primer erano le seguenti: F: 5′-ACCACACCGTGACCC CAC-3′, R: 5′-GTTGCGGGTCACTGGTGT-3′, sintetizzate dalla società di biotecnologia (Sangon Biotech, Shanghai, CHN). Utilizzando il sistema lentivirus CRISPR/Cas9, il plasmide Lenticrispr-v2 è stato linearizzato e collegato al duplex di sgRNA ricotto per costruire il plasmide ricombinante Lenticrispr-v{{1{{180}}}} Sidt2. Il reagente di trasfezione Vigofect (Vigorous Biotechnology, Pechino, CHN) è stato utilizzato per trasfettare il plasmide Lenticrispr-v2 e il plasmide ricombinante Lenticrispr-v2-Sidt2 al fine di costruire il lentivirus. Il lentivirus ottenuto è stato trasfettato nelle cellule MPC5 e nelle cellule SV40 MES 13. Dopo 48 ore, le cellule sono state incubate con purinomicina per 72 ore fino alla selezione. Le cellule sopravvissute erano il gruppo Sidt2+/+ e il gruppo Sidt2−/− che erano stati trasfettati con successo. Isolamento dell'RNA e test PCR in tempo reale Trizol (Invitrogen) è stato utilizzato per estrarre l'RNA dalle cellule renali di topo e il metodo RT-PCR specifico era quello descritto in precedenza [21]. Le sequenze di primer della RT-PCR erano le seguenti: actina (senso: F: 5′- GGACTCC TATGTGGGTGACG-3′, R:5′-CTTCTCCATGTCGTCCCAGT-3′), P62 (senso: F:5 ′- GGACCCATCTACAGAGGCT G-3′, R: 5′-ATCACAATGGTGGAGGGGTGC-3′), Sidt2(senso: F:5′-TAGTGCCTGTTACCACGTCTGC-3′, R:5'-GGATGCAGTCTGTG TAGAGCACA{ {48}}′). Western blotting Il metodo specifico è quello menzionato prima [28]. In questo studio, gli anticorpi primari includevano anti-LC3B di coniglio (1:1000; Sigma-Aldrich L7543), anti-P62 di coniglio (1:1000; Abcam ab205719), anti- -Actina di topo (1:1000; Sigma Aldrich A5316), anti-Sidt2 di coniglio (1:1000; Invitrogen PA5-69064), anti-Atg5 di coniglio (1:1000; Cell Signaling Technology 9980S), anti-Atg7 di coniglio (1:1000; Cell Signaling Technology 8558S) , anti-Atg12 di coniglio (1:1000; Cell Signaling Technology 2011S), anti-LAMP1 di topo (1:1000; Santa Cruz Biotechnology H4A3), anti-catepsina B di coniglio (1:1000; Cell Signaling Technology 31718S). Ad-mCherry-GFP-LC3B Le cellule sono state inoculate su piastre Petri con fondo in vetro Nunc. Dopo essere cresciuto fino a raggiungere una densità adeguata, è stato aggiunto Ad-mCherry-GFP-LC3B (tempo Beyo, Shanghai, CHN, C3011-10 mL), ottenendo una concentrazione finale di 10 −11 vp/mL. Dopo la stimolazione per 48 ore, il numero di punti di fluorescenza mCherry e GFP è stato osservato direttamente al microscopio confocale laser (Leica SP8, Germania). Immunofluorescenza Le cellule sono state inoculate su piastre Petri con fondo di vetro e fissate con paraformaldeide. Dopo il blocco, le cellule sono state incubate durante la notte con l'anticorpo primario e quindi incubate con l'anticorpo secondario per 90 minuti al buio. Le cellule sono state fotografate utilizzando il microscopio confocale a scansione laser (Leica SP8, Germania) dopo aver colorato i nuclei con DAPI (1 ug/mL). Gli anticorpi primari includevano P62 (1:200; Abcam ab205719), LAMP1 (1:200; Santa Cruz Biotechnology H4A3), LC3B (1:200; Sigma-Aldrich L7543); gli anticorpi secondari includevano anti-topo IgG anti-topo affinipure di capra coniugato a Cy3-secondario anti-topo (H + L) (1:200; Proteintech SA00009-1), Affinipure di capra coniugato con CoraLite488- anti-topo IgG (H + L) (1:200; Proteintech SA00013-1), CoraLite594- coniugato Affinipure capra anti-coniglio IgG (H + L) (1:200; Proteintech SA{{144 }}). Per LysoTracker (Beyotime, Shanghai, CHN, C1046), abbiamo anche inoculato le cellule su piastre Petri con fondo di vetro. Dopo essere cresciute fino a raggiungere una densità adeguata, alle cellule è stato aggiunto un fluido di coltura cellulare contenente una concentrazione finale di LysoTracker di 75 nM, che sono state fotografate dopo 45 m di stimolazione. Utilizzare ImageJ per contare il numero di punti fluorescenti e il coefficiente di correlazione di Pearson. Osservazioni al microscopio elettronico a trasmissione Da ciascun gruppo, topi maschi Sidt2−/− e WT di 3-5 12- settimane sono stati selezionati casualmente per preparare campioni al microscopio elettronico del tessuto renale e il metodo specifico è quello descritto in precedenza [48] , scattare foto casuali delle sezioni utilizzando un microscopio elettronico, ci sono più di 10 immagini prese da sezioni renali per ciascun topo, selezionare casualmente 3-5 immagini con ingrandimento 8000× dalle immagini del microscopio elettronico di ciascun topo, calcolare il numero di autofagolisosomi nell'immagine e confrontare il gruppo Sidt2−/− con il gruppo WT. Per quanto riguarda la preparazione dei campioni cellulari al microscopio elettronico, raschiare non meno di 105 cellule con un raschietto cellulare e raccoglierle in una provetta EP, quindi centrifugare a 800 giri/min per 5 m, scartare il surnatante e riempirlo con il fissativo del microscopio elettronico. Dopo essere stato conservato in un frigorifero a 4 gradi per più di 1 ora, può essere sottoposto a ispezione. Lo scatto al microscopio elettronico è stato effettuato da KingMed Diagnostics (Guangzhou, Cina). LysoSensor Le cellule sono state inoculate su una piastra a pozzetti 96-. Dopo la crescita fino a una densità adeguata, è stato aggiunto un mezzo preriscaldato (37 gradi) contenente LysoSensorDND-160® 1 µM (Thermo Fisher L7545). Le cellule sono state incubate per 5 minuti a 37 gradi, quindi il mezzo è stato rimosso e sostituito dopo aver lavato le cellule tre volte con PBS. La modalità WellScan è stata utilizzata per leggere la piastra in BioTek Citation 5 (BioTek, Winooski, VT, USA). La fluorescenza è stata misurata utilizzando le lunghezze d'onda di eccitazione/emissione Ex360nm/Em450nm e Ex380nm/Em540nm e il pH del lisosoma è stato determinato dal rapporto tra Em540 e Em450. Analisi statistica I risultati sono stati espressi come media ± SEM. Il confronto statistico tra due gruppi è stato eseguito utilizzando t-test non appaiati. Quando è stato utilizzato il software Graphics 8.0 per l'analisi statistica, P <0,05 è stato considerato statisticamente significativo. Ciascun gruppo di esperimenti in questo studio è stato ripetuto almeno tre volte in modo indipendente. DISPONIBILITÀ DEI DATI I set di dati generati e/o analizzati durante lo studio attuale sono disponibili presso l'autore corrispondente su ragionevole richiesta.
RIFERIMENTI
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