La trascrittomica unicellulare rivela interazioni interrotte tra cellula e cellula del filtro renale dopo una lesione precoce e selettiva dei podociti Ⅱ

Risultati

Single-Cell Profiling of >29,000 Cellule renali arricchite glomerulari

Attuali protocolli unicellulari peridentificare l'intero rene<2.5% glomerular cells,9 and although a purifiedpreparazione glomerularel'utilizzo di microsfere magnetiche arricchisce questa popolazione,22 non riesce a catturare altri tipi di cellule del rene che potrebbero essere di interesse. È stato utilizzato un metodo di setacciatura per arricchire contemporaneamente i glomeruli e catturarliulteriori tipi di cellule renaliestendere questi risultati e sviluppare una comprensione dettagliata delle interazioni cellula-cellula all’interno del glomerulo nel contesto dell’intero paesaggio cellulare del rene, prima e dopodanno ai podociti.

Identificare i primi effetti trascrizionali dell'ablazione dei podociti in una cellulamaniera specifica per tipo, scRNAseq è stato eseguito con tessuto renale da WT e iCTCFpod/topi raccolti mediante setacciatura seriale dopo 1 settimana di trattamento con doxiciclina (Figura 1A). Il tessuto renale di quattro animali WT (quattro replicati biologici) e quattro iCTCFpod/animali ha prodotto un totale di 14.783 WT e 14.727 iCTCFpod/cellule profilate dopo il filtraggio (Figura supplementare S1, A e B; Tabelle supplementari S1 e S2). I dati sono stati normalizzati per rimuovere gli effetti dovuti al numero di UMI e alla percentuale di letture mitocondriali. Dopo l'integrazione di WT e iCTCFpod/campioni, è stata utilizzata una bassa risoluzione di clustering per rilevare nove cluster (Figura 1B). Repliche biologiche di WT e iCTCFpod / campioni sono state distribuite tra tutti i cluster (Figura supplementare S2, AC). Tutti i tipi di cellule del glomerulo, così come altri tipi di cellule renali, sono stati identificati utilizzando marcatori stabiliti e derivati ​​​​da dati (Figura 1C; Tabella supplementare S3; Figura supplementare S3A). Le cellule glomerulari, che rappresentano un totale dell'82,1% di tutte le cellule recuperate [36,9% podociti, 42,1% cellule endoteliali glomerulari (GEC), 2,7% cellule mesangiali e 0,36% PEC] sono state isolate e raggruppate (Figura 1D) . Quattro gruppi di podociti, cinque gruppi di GEC e un gruppo ciascuno di cellule mesangiali e PEC, che esprimono canonimarcatori di tipo cellulare, sono stati identificati (Figura 1E; Figura supplementare S3B). Repliche biologiche di WT e iCTCFpod/campioni sono state distribuite in tutti i cluster (Figura supplementare S2, DF; Tabella supplementare S4). Come anticipato, dato che la delezione CTCF specifica dei podociti porta alla perdita di podociti istologicamente rilevabile a 2 settimane,13 iCTCFpod / campioni contenevano una percentuale inferiore di podociti rispetto ai campioni WT (Figura 1F; Tabella supplementare S5). iCTCFpod / campioni avevano il 13,1% in meno di podociti, l'11,9% in più di GEC e l'1,5% in più di cellule mesangiali rispetto ai campioni WT (Tabella supplementare S5). Hanno contribuito i PEC<1% to either of the iCTCFpod / or WT samples. This finding suggests that disruption of transcriptional programs critical for podocyte survival precedes histologically detectable podocyte injury and loss and highlights the power of scRNAseq in discerning subtle changes that can be missed by histologic analysis.

non significativamente espresso in modo differenziale. L'asse è stato limitato a 100. La linea tratteggiata indica i parametri predefiniti: cutoffP Z 0,25. C: Visualizzazione dell'analisi di sovrarappresentazione dei geni espressi in modo differenziale univoco nel podocita 1 presentato come una rete o una mappa di arricchimento. I set di geni sovrapposti si raggruppano insieme.

NUOVE ERBE PER LA SALUTE DEI RENI

La delezione inducibile di CTCF podocita-specifica porta a cambiamenti nell'espressione genica in tutti i tipi di cellule glomerulari

L'analisi dell'espressione differenziale è stata eseguita in ciascuno degli 11 cluster confrontando le cellule iCTCFpod / e WT (Tabella supplementare S6). I geni sono stati considerati espressi in modo differenziale se trovati in almeno l'10% delle cellule in un dato cluster, con una variazione logaritmica assoluta minima di 0.1 e una P aggiustata < 0 .05. Ctcf era espresso in modo differenziale in ciascuno dei quattro cluster di podociti, con variazioni medie logaritmiche di 0,390, 0,189, 0,331 e 0,303, rispettivamente. Il numero di cellule in ciascun cluster è stato sottoposto a campionamento e l'analisi dell'espressione differenziale è stata ripetuta per confrontare il numero di geni espressi in modo differenziale tra gli 11 cluster. I cluster di podociti avevano i geni espressi in modo più differenziale, seguiti da GEC-1 e GEC-2 (Figura 1G). I restanti tre gruppi di GEC, insieme alle cellule mesangiali e alle PEC, avevano molti meno geni differenzialmente espressi (Figura 1G), suggerendo che GEC-1 e GEC-2, tra tutti i cluster glomerulari, erano i più colpiti dalle conseguenze della lesione dei podociti provocata dalla delezione del CTCF.

Programmi genetici associati alla malattia identificati in cluster specifici di podociti e cellule endoteliali

Questo studio ha innanzitutto cercato di esaminare come i singoli gruppi di podociti rispondono al danno. Un diagramma di Venn dei geni espressi in modo differenziale in ciascuno dei quattro cluster di podociti ha rivelato che il podocita 1 aveva i geni espressi in modo differenziale più univoco dei quattro cluster di podociti (Figura 2A; Tabella supplementare S7). L'osservazione che uno dei quattro gruppi di podociti è stato colpito in modo più evidente è in accordo con i dati istologici precedenti che indicano che non tutti i podociti sono colpiti con la stessa gravità a fronte della lesione ed evidenzia il potere di scRNAseq di caratterizzare a livello molecolare l'eterogeneità degli stati cellulari all'interno del stesso tipo di cellula.23 È stata eseguita un'analisi di sovrarappresentazione per identificare i programmi genetici arricchiti come conseguenza della perdita di CTCF nel cluster dei podociti 1 (Tabella supplementare S8). I termini arricchiti superiori sono stati visualizzati con una mappa di arricchimento per raggruppare set di geni reciprocamente sovrapposti (Figura 2B). Un gruppo importante di termini arricchiti riguardava le funzioni mitocondriali, tra cui la sintesi di ATP, l'organizzazione mitocondriale, la catena di trasporto degli elettroni e la fosforilazione ossidativa (Figura 2B). Questi dati estendono il lavoro recente che indica la disfunzione mitocondriale come segno di danno ai podociti.24 Inoltre, la genetica umana ha sottolineato l'importanza delle funzioni mitocondriali nei podociti, comprese diverse mutazioni nella via di biosintesi del CoQ (PDSS1, PDSS2, COQ2, COQ6, e ADCK4) che causano la sindrome nefrosica, soprattutto nei bambini.25,26 È stato quindi ipotizzato che la disfunzione mitocondriale dei podociti possa rappresentare uno stato cellulare prominente associato a tutte le malattie che derivano dalla perdita di podociti.24 I dati forniscono supporto a questa nozione a livello individuale -risoluzione cellulare, suggerendo che la disfunzione mitocondriale può rappresentare il primo stato di lesione in una specifica popolazione di podociti, portando alla perdita di podociti. Uno dei principali gruppi di termini arricchiti dall'analisi di sovrarappresentazione (Figura 2B) era l'organizzazione del citoscheletro, nonché un singolo termine arricchito correlato per l'adesione cellula-matrice. Il citoscheletro di actina svolge un ruolo essenziale nel mantenimento della struttura unica e complessa dei podociti e l'adesione al GBM è essenziale per la funzione dei podociti.27 Le adesioni focali mature contengono centinaia di proteine ​​che collegano il citoscheletro di actina, il legame della matrice dei recettori, la trasduzione del segnale intracellulare e polimerizzazione dell'actina. Uno dei geni più sottoregolati nel podocita 1 era Rhpn1 (Figura supplementare S4A), un componente essenziale per stabilire la dinamica del citoscheletro dei podociti e mantenere l'architettura del processo del piede del podocita.28 Il componente complesso Arp2/3 Arpc3, un driver della polimerizzazione dell'actina, è stato sovraregolato nel cluster dei podociti 1 (Figura 2C; Figura supplementare S4B). Anche un gene per un componente aggiuntivo del complesso, Actr2, è stato sovraregolato sia nel podocita 1 che nel podocita 4. Inoltre, Wasl, il cui prodotto proteico, N-WASP, attiva il complesso Arp2/3 ed è necessario per il mantenimento dei processi del piede dei podociti in vivo29, era sovraregolato anche nel podocita 1, podocita 3 e podocita 4. Il regolatore citoscheletrico Arhgdia, la cui delezione è associata alla sindrome nefrosica nei topi,30 era sottoregolato nel podocita 1 (Figura 2C). Anche i livelli di espressione di due Rho GTPasi che sono regolatori ben consolidati dell'etone del citoschele di actina e delle dinamiche di adesione cellulare31 erano alterati: RhoA era sovraregolato e RhoC era sottoregolato, così come un effettore centrale a valle di Rac1, Pak1, in linea con uno studio precedente.23 Inoltre, Cd2ap, un componente critico del citoscheletro di actina dei podociti,27,32 era sovraregolato nel podocita 1. Insieme, questi cambiamenti suggeriscono che una delle prime risposte dei podociti alla lesione provocata dalla delezione di CTCF è quella di alterare componenti critici del scheletro di actina-cito in una lotta per mantenere l'attaccamento al GBM e quindi sopravvivere alla lesione. Inoltre, scRNAseq ha identificato mediatori specifici di questa risposta abbinati a una popolazione specifica di podociti, indicando possibili tar get per un intervento terapeutico precoce.

Il GBM è un reticolo di proteine ​​della matrice extracellulare situato tra podociti e GEC che fornisce supporto strutturale ai capillari glomerulari, ospita ligandi per i recettori sulla superficie dei GEC, dei podociti e delle cellule mesangiali adiacenti e contribuisce alla selettività del filtro glomerulare.33 Uno dei componenti critici del GBM è il collagene di tipo IV ɑ5 (Col4a5); mutazioni in questo gene causano la sindrome di Alport e la FSGS nell'uomo.33,34 Varianti di Col4a3, un altro componente strutturale del GBM, sono state recentemente identificate da uno studio completo di associazione sull'intero genoma nella DKD.35 Pertanto, le modifiche ai componenti del GBM come conseguenza del danno ai podociti sono ampiamente rilevanti per molte malattie renali. È stato chiesto se l'espressione dei geni che codificano per componenti strutturali del GBM fosse interrotta nel modello. Col4a5 era sovraregolato in iCTCFpod/podociti (con una variazione logaritmica di 0.130) (Figura supplementare S4C; Tabella supplementare S6). L'analisi del recettore del ligando ha suggerito che la sovraregolazione di Col4a5 nel podocita 1 porta ad un aumento delle interazioni con le cellule di tutti e cinque i cluster GEC e le cellule mesangiali attraverso diverse integrine (Figura 3A). L'espressione di Col4a5 nei podociti che esprimono Nphs2- era significativamente aumentata (P < 0,0001; t-test a due code corretto da Welch) (Figura 3B). La sovraregolazione osservata di Col4a5, con risoluzione spaziale, è stata convalidata da HCR, un metodo che genera fluorescenza a singola molecola tramite ibridazione in situ36 (Figura 3C; Figura supplementare S5). Questo risultato ha confermato che i dati sui geni individuali derivati ​​dall'esperimento trascrittomico su singola cellula potrebbero essere convalidati in modo indipendente, con risoluzione spaziale, rafforzando la validità delle conclusioni tratte dalle analisi computazionali. Inoltre, questi dati evidenziano che la risposta chiave al danno da parte di una specifica popolazione di podociti è quella di aumentare la produzione di collagene, il che può spiegare il GBM prominente o spesso osservato nelle malattie progressive, come la DKD.35

GEC-1 and GEC-2 had nearly as many differentially expressed genes as podocyte clusters 2 to 4, whereas the remaining GEC clusters, mesangial cells, and PECs had fewer differentially expressed genes. Therefore, these two endothelial clusters were most affected by podocyte injury. GEC-1 expressed >600 geni espressi in modo univoco differenziale (Figura supplementare S6A; Tabella supplementare S9). L'analisi della sovrarappresentazione ha indicato che i geni espressi in modo differenziale univoco in GEC-1 erano arricchiti nei programmi genetici per la migrazione e l'adesione cellulare (Figura supplementare S6, B e C; Tabella supplementare S10). Queste analisi hanno rivelato i primi cambiamenti trascrizionali che si verificano nei GEC come risposta alla lesione dei podociti.

Modellare le rivelazioni della comunicazione intercellulare

Interazioni chiave tra tipi di cellule in risposta alla lesione precoce dei podociti

Dopo aver identificato i programmi genetici interrotti in diversi cluster cellulari distinti, lo studio ha poi cercato di comprendere in che modo la diafonia cellula-cellula glomerulare fosse influenzata dalla lesione dei podociti. Lo studio ha innanzitutto analizzato l'elenco dei geni espressi in modo differenziale nei cluster di podociti, GEC e cellule mesangiali. L'espressione di due ligandi chiave della prosopravvivenza autocrina, Vegfa e Pdgfb, nonché l'espressione del recettore PDGFB, Pdgfrb, sono stati interrotti (Tabella supplementare S6). L'espressione di Vegfa era diminuita in tutti i cluster di podociti (variazione media del log fold tra 0.034 e 0.149). Al contrario, l'espressione di Pdgfb era aumentata in tutti i cluster GEC (cambiamento medio di log fold tra 0.031 e 0,140) e il recettore Pdgfrb era sovraregolato nelle cellule mesangiali (cambiamento medio di log fold di 0,155). Questa analisi ha suggerito che la lesione dei podociti porta a una diminuzione dell'espressione del ligando prosopravvivenza Vegfa, influenzando negativamente i GEC. Per compensare, i GEC possono up-regolare il ligando prosurvival Pdgfb, attivando le cellule mesangiali per regolare il recettore Pdgfrb.

NicheNet, un nuovo algoritmo che deduce come le interazioni dei recettori ligando derivati ​​dai dati di espressione possono influenzare target specifici integrando conoscenze preesistenti sulle reti di segnalazione e di regolazione, è stato utilizzato per studiare più approfonditamente le interazioni ligando-recettore e i loro presunti geni bersaglio.20 NicheNet è stato applicato a modello di interazioni tra podociti e GEC nonché cellule mesangiali e GEC che potrebbero potenzialmente indurre geni differenzialmente espressi (geni bersaglio) nei GEC nel contesto di lesioni dei podociti (Figura 4A). Per questa analisi, tutti i cluster di ciascun tipo di cellula sono stati combinati in un unico cluster. I principali ligandi previsti espressi dalle cellule mesangiali e/o dai podociti erano pleiotropina (Ptn), angiopoietina 2 (Angpt2), Col4a1, molecola di adesione cellulare vascolare 1, proteina morfogenetica ossea 4 (Bmp4), Ephrin B1, fattore di crescita del tessuto connettivo e semaforo. 3e (Sema3e) (Figura 4B). Il modello di espressione dei recettori GEC attraverso i quali è noto che questi ligandi agiscono è stato mappato accanto all'analisi dell'attività del ligando. Inoltre, sono stati mappati anche i geni bersaglio previsti che erano espressi in modo differenziale in iCTCFpod/GEC rispetto ai controlli WT. I risultati nella Figura 4B sono riassunti come grafici circolari nella Figura 4, C e D.

Da questa analisi sono emersi diversi ligandi, recettori e geni bersaglio. La pleiotropina, un ligando altamente espresso nelle cellule mesangiali (Figura 4B), è un fattore di crescita secreto che può legare e inibire il recettore della proteina tirosina fosfatasi di tipo B, stimolando la migrazione delle cellule endoteliali tramite un aumento di Tek (Tie2)/Angpt137 e Kdr (Vegfr2)/Vegfa38 segnalazione. Di conseguenza, Tek è stato significativamente sovra-regolato nei GEC (Figura 4B). Angpt2, altamente espresso nelle cellule mesangiali, è un ligando antagonista di Tek, inibendo il legame di Angpt1.39 Poiché è noto che la segnalazione di Angpt1 promuove la sopravvivenza dei podociti e un'interruzione del rapporto Angpt1/Angpt2 contribuisce allo sviluppo di DKD,40 questo ligando l'analisi dei recettori sembrava indicare la segnalazione disadattiva di Tek nei GEC come una delle prime conseguenze della lesione dei podociti.

Questo studio ha anche riscontrato importanti cambiamenti nell'espressione del collagene di tipo IV in diverse cellule glomerulari (Figura 4B). Normalmente prodotti da podociti sani, gli erotrimeri del collagene IV passano da ɑ1ɑ1ɑ2 a ɑ3ɑ4ɑ5 durante lo sviluppo glomerulare, che è necessario per la corretta formazione e funzione del GBM.33 ,34 La sovraregolazione di Col4a1, insieme all'espansione della matrice mesangiale, è frequentemente osservata nella DKD.41,42 Nell'analisi attuale, Col4a1 è stato espresso sia dalle cellule mesangiali che dai GEC (espressione media della mappa termica del ligando) (Figura 4B) ed è stato specificatamente sovraregolato negli iCTCFpod/GEC rispetto ai controlli WT. Questi dati suggeriscono che i GEC sovraregolano Col4a1 nel contesto della lesione dei podociti, il che può portare a un GBM fibrotico più rigido che contribuisce allo sviluppo della sclerosi segmentale.33

Bmp4 era un ligando mesangiale altamente espresso identificato dall'analisi NicheNet (Figura 4, BD). Le BMP svolgono un ruolo chiave nello sviluppo e nelle malattie dei reni.43 La Bmp4 è sovraregolata nel contesto della nefropatia diabetica nei ratti,42 etrattamento dei topi con diabetecon un anticorpo anti-BMP4 previene la sovraregolazione di Col4a1 e l'espansione della matrice mesangiale.44 Di particolare interesse, è stato scoperto che Bmp4 mesangiale innesca l'espressione di GEC Smad6 (Figura 4B). L'espressione di Smad6 è indotta dalle BMP e in un ciclo di feedback negativo, Smad6 inibisce specificamente le BMP, incluso BMP4.45 Smad6 è stato sottoregolato negli iCTCFpod/GEC rispetto ai controlli WT, suggerendo un aumento della segnalazione di BMP nelle cellule endoteliali nel contesto della lesione dei podociti .

Uno dei ligandi prioritari identificati nei podociti era Sema3e (Figura 4, BD). Le semaforine di classe 3 sono proteine ​​secrete che funzionano in una varietà di processi biologici, tra cui angiogenesi, linfangiogenesi e malattie.46 Sema3a è sovraregolato nella DKD umana,47 e Sema3g è stato recentemente identificato come un gene specifico dei podociti che protegge i podociti dall'infiammazione in vivo. 48 Il ruolo di Sema3e nel podocita rimane poco chiaro. L'attuale analisi ha rivelato una coppia recettore-ligando precedentemente non riconosciuta in base alla quale il podocita Sema3e interagisce con la plesina D1 sui GEC per attivare diversi bersagli genetici a valle nelquadro della lesione dei podociti(Figura 4, C e D).

Tra i diversi geni bersaglio GEC appena identificati, Hes1 e Cx3cl1 sono stati trovati anche nei programmi dei geni di adesione arricchiti in GEC-1 (Figura 4, BD; Figura supplementare S6). Hes1 è un bersaglio della segnalazione di Notch, che svolge un ruolo importante nello sviluppo del rene, ma la riattivazione può portare alla fibrosi.49 Cx3cl1 è una chemochina prodotta principalmente dall'endotelio glomerulare che agisce come chemoattrattivo e molecola di adesione per il suo recettore, Cx3cr1, che è espresso in modo ubiquitario sui leucociti linfatici mononucleari e circolatori.50 Cx3cl1 è stato implicato in una varietà di malattie renali, tra cui DKD, nefropatia da IgA e glomerulonefrite.50 Hes1 e Cx3cl1 erano entrambi sovraregolati negli iCTCFpod/GEC rispetto ai controlli WT, suggerendo che i GEC rispondono al danno dei podociti aumentando i programmi proinfiammatori e profibrotici.

Infine, poiché molti dei ligandi e dei bersagli identificati nell’analisi NicheNet sono implicati nella DKD, sia nei modelli di roditori che negli esseri umani, il set di dati è stato confrontato con un set di dati trascrittomici di singoli nuclei della DKD umana precoce.10 Uno specifico è stato effettuato un confronto tra geni espressi in modo differenziale tra cluster di cellule umane e di topo. Dei 138 geni differenzialmente espressi nei GEC DKD umani, 25 geni sono stati identificati anche nelle cellule iCTCFpod/endoteliali di topo, incluso Col4a1 (Figura supplementare S7; Tabella supplementare S11). Insieme, questi risultati suggeriscono che i programmi delle cellule endoteliali frequentemente interrotti nella DKD umana possono essere parzialmente ricapitolati nel modello murino di danno glomerulare precoce tramite ablazione selettiva dei podociti. Inoltre, questi risultati suggeriscono che, oltre ai podociti, potrebbero esserci potenziali bersagli specifici endoteliali e strategie terapeutiche per arrestare o rallentare la progressione di malattie renali complesse e altamente prevalenti, come la DKD.