SLC37A2, una molecola correlata al fosforo aumenta nelle cellule muscolari lisce nell'aorma calcificata

Calcificazione vascolareè una delle principali fonti dimalattia cardiovascolarenei pazienti con malattia renale cronica.Iperfosfatemiaporta ad un aumento dell'afflusso di fosforo intracellulare, che porta ad un aumento delle cellule simili agli osteoblasti nelle cellule muscolari lisce vascolari. PiT-1 transita il fosfato nelle cellule muscolari lisce vascolari. Tuttavia, il meccanismo della calcificazione vascolare non è completamente compreso. Questo studio ha studiato molecole candidate correlate al fosforo diverse da PiT-1. Abbiamo ipotizzato che le molecole legate al fosforo appartenenti altrasportatore di soluti(SLC) sarebbe coinvolta nella calcificazione vascolare. Come risultato dell'analisi del DNA microarray, ci siamo concentrati su SLC37A2 e abbiamo dimostrato che l'espressione di mRNA di queste cellule aumentava sulle cellule muscolari lisce aortiche calcificate (AoSMC). È stato segnalato che SLC37A2 trasporta sia gli scambi glucosio-6-fosfato/fosfato che quelli fosfato/fosfato. L'analisi in vitro ha mostrato che l'espressione di SLC37A2 non era influenzata dall'infiammazione su AoSMC. L'espressione dell'mRNA e della proteina SLC37A2 è aumentata nell'AoSMC calcificato. In vivo, l'analisi ha mostrato che l'espressione dell'mRNA di SLC37A2 nell'aorta dimalattia renale cronicaratti era correlato con i geni marcatori osteogenici. Inoltre, SLC37A2 era espresso nell'area della calcificazione vascolare inratti con malattie renali croniche. Di conseguenza, abbiamo dimostrato che SLC37A2 è una delle molecole che aumentano concalcificazione vascolarein vitro e in vivo.

Parole chiave: SLC37A2,calcificazione vascolare, cellule muscolari lisce dell'aorta,malattia renale cronica, iperfosfatemia

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Come il numero di pazienti conmalattia renale cronica(CKD) aumenta il numero di pazientiche necessitano di dialisiaumenterà anch'esso. La maggior parte dei decessi nei pazienti sottoposti adialisisono dovute amalattia cardiovascolaread esempioinsufficienza cardiaca, disturbi cerebrovascolari, o infarto del miocardio. (,2) Una delle principali fonti dimalattia cardiovascolareè la calcificazione ectopica,() un'anomalia causata dalla formazione e deposizione di cristalli di fosfato di calcio nei tessuti molli. (4 6) Vari fattori come l'infiammazione. lo stress ossidativo e l’aumento dei livelli plasmatici di calcio (Ca) e fosforo (P) sono coinvolti nella progressione della calcificazione vascolare. Tra questi fattori, l’iperfosfatemia è quella più fortemente associata alla calcificazione vascolare. (7.8) L'iperfosfatemia è causata da un'assunzione eccessiva di P in presenza di una ridotta funzionalità renale. Pertanto, i pazienti sottoposti a dialisi devono limitare l’assunzione di P. (79-12). Tuttavia, è stato riportato checalcificazione vascolaresta già progredendo quando viene iniziata la dialisi; è stata osservata anche in pazienti con insufficienza renale cronica in stadio iniziale quando l'iperfosfatemia non è evidente. (3) Di conseguenza, è importante prevenire la calcificazione vascolare nei pazienti con insufficienza renale cronica in stadio iniziale per migliorare la prognosi di vita.

che porta ad un aumento dell'afflusso di P nelle cellule muscolari lisce vascolari (VSMC). L'afflusso di P viene effettuato tramite PiT-1, un trasportatore sulla superficie della membrana cellulare di VSMC. PiT- è un membro della superfamiglia dei trasportatori di soluti (SLC), che include un trasportatore di fosfato di sodio codificato da SLC20A1.04 PiT- trasporta il fosfato attraverso le membrane cellulari Na-dipendenti e successivamente la mineralizzazione della matrice a causa di elevati livelli di p.s) Come intracellulare I livelli di P aumentano, le VSMC iniziano ad esprimere fattori di trascrizione osteogenici, come il fattore di trascrizione correlato a runt 2 (Runx2)(16). Questo effetto è seguito da una maggiore espressione di geni specifici degli osteoblasti, come l'osteopontina e l'osteocalcina. Inoltre, ridotta l'espressione delle proteine ​​specifiche del muscolo liscio. come la proteina muscolare liscia 22-0 (SM22-0). Di conseguenza, le VSMC vengono trasformate in cellule simili agli osteoblasti. (1718)Recenti studi clinici hanno dimostrato che i livelli ematici di calcio. le particelle proteiche (CPP), che rappresentano particelle colloidali di fosfato di calcio, aumentano con la diminuzione della funzionalità renale. (19-21)Inoltre, sono state riportate correlazioni con i livelli di CPP e P nel sangue.2o2i) È possibile che il CpP possa innescare la progressione della calcificazione vascolare.22-24)

Tuttavia, è stata osservata calcificazione vascolare in pazienti con insufficienza renale cronica in stadio iniziale con livelli plasmatici normali di P. (13) Inoltre. L'mRNA di PiT-1 è espresso ubiquitariamente in tutti i tessuti. Quindi un'altra molecola può agire principalmente nell'area della calcificazione vascolare. Ci sono rapporti che lo diconoinfiammazionepromuove la calcificazione vascolare. Fattori infiammatori come l'interleuchina (IL)-1B, IL-6 e il fattore di necrosi tumorale alfa (TNF-a) hanno indotto la differenziazione delle VSMC in cellule simili agli osteoblasti (2s26). Il TNF-a induce calcificazione vascolare attraverso il percorso dell'cAMP, che svolge un ruolo nella differenziazione degli osteoblasti.2728) IL-6 regola vari percorsi che portano alla calcificazione vascolare delle VSMC2-31) Inoltre. Anche IllB, IL-6 e TNF-a sono fattori associati all'aumento della calcificazione vascolare indotta da elevati livelli di p.3233) Tuttavia. i dati attuali non spiegano completamente il meccanismo vascolare

calcificazione indotta da questi fattori. Abbiamo ipotizzato che potrebbero esserci altre molecole correlate al P come quelle della superfamiglia SLC, coinvolte nella calcificazione vascolare. Ci siamo concentrati sulle proteine ​​di membrana nella superfamiglia SLC e abbiamo studiato potenziali molecole candidate correlate a P diverse da PiT-1 per il coinvolgimento nella calcificazione vascolare. Inoltre, abbiamo esaminato la relazione tra le molecole candidate e la calcificazione vascolare in video e in vivo.

Materiali e metodi

Coltura cellulare. Le normali cellule muscolari lisce dell'aorta umana (AoSMC) sono state ottenute da Lonza (Basilea, Svizzera). L'AoSMC è stato coltivato secondo le istruzioni del produttore. Le AoSMC sono state mantenute in un mezzo di crescita (mezzo basale di cellule muscolari lisce integrato con il 5% di siero bovino fetale (FBS), fattore di crescita epidermico, insulina, fattore di crescita dei fibroblasti B e gentamicina/anfotericina B). I media venivano cambiati a giorni alterni. Gli AoSMC sono stati coltivati ​​in un incubatore umidificato al 5% di CO a 37 gradi e mantenuti fino al raggiungimento della confluenza e quindi utilizzati negli esperimenti.

AoSMC calcificata. La calcificazione di AoSMC è stata indotta come descritto in precedenza.435) Gli AOSMC sono stati coltivati ​​in mezzo di Eagle modificato da Dulbecco integrato con FBS al 15% e penicillina-streptomicina e coltivati ​​con P 2,6 mM per 3, 6, 9, 12 e 14 giorni. La concentrazione di P è stata regolata dal tampone P NaH, PO/Na e HPO. pH 7,2). Altri AoSMC non sono stati coltivati ​​con P 2,6 mM.

Microarray di DNA. È stato utilizzato l'RNA totale di campioni AoSMC coltivati ​​e non coltivati ​​con P 2,6 mM. L'RNA totale 5.0 ug è stato analizzato utilizzando un microarray di DNA (Agilent Technologies, Tokyo, Giappone). SurePrint G3 Human GE 8 x 60k ver. 2 Il microarray è stato utilizzato per esaminare circa 26,000 geni. Il rapporto è stato calcolato dividendo il livello di espressione di AoSMC coltivato con 2,6 mM per 12 giorni per il livello di espressione di AoSMC non coltivato con 2,6 mM P

Microarray di DNA

È stato utilizzato l'RNA totale di campioni AoSMC coltivati ​​e non coltivati ​​con P 2,6 mM. L'RNA totale 5.0 ug è stato analizzato utilizzando un microarray di DNA (Agilent Technologies, Tokyo, Giappone). SurePrint G3 Human GE 8 x 60k ver. 2 Il microarray è stato utilizzato per esaminare circa 26,000 geni. Il rapporto è stato calcolato dividendo il livello di espressione su AoSMC coltivato con 2,6 mM per 12 giorni per il livello di espressione su AoSMC non coltivato con 2,6 mM P.Espressione di SLC37A2 nell'infiammazione vascolare. Per indurre una risposta infiammatoria nell'AoSMC, le cellule sono state coltivate con terreno di crescita fino a raggiungere la confluenza e quindi trattate con 1 ugmL di lipopolisaccaridi (LPS) (LPS da escherichia coli O111:B4; Sigma, St. Louis, MO) per 24 e 72 senza 2,6 mM P. Altri AoSMC non sono stati coltivati ​​con l'analisi della reazione a catena della polimerasi (PCR) in tempo reale. L'RNA totale è stato estratto da AoSMC trattato con LPS per 24 e 72 ore e da cellule non trattate con LPS. La PCR quantitativa in tempo reale basata sul verde SYBR è stata eseguita utilizzando cDNA sintetizzato e un set di primer appropriato per ciascun gene bersaglio con un sistema PCR in tempo reale StepOnePlus (Applied Biosystems, FosterCity, CA). Le sequenze di primer erano le seguenti: IL umana-6.5-AATTCGGTACATCCTCGACGG-3' e 5-GCCATCTTTGGAAGGTTCAGG-3'; SLC37A2,5TCACTTTAGTGCCAAGGAGGC umano-3' e 5CCATTGGTGTAGTCAGAGACG-3'; gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi (GAPDH5'-CTGCACCACCAACTGCTTAGC- e 5-CTTCTGGGIGGCAGTGATGGC-3. I livelli di espressione dell'mRNA di IL-6 e SLC37A2 sono stati calcolati dopo la normalizzazione con GAPDH. Espressione di SLC37A2 in calcificati AoSMC. Il totale è stato estratto da cellule AoSMC non coltivate con P 2,6 mM e cellule AoSMC coltivate con P 2,6 mM per 3, 6, 9, 12 e 14 giorni. La PCR in tempo reale è stata eseguita utilizzando il cDNA sintetizzato. Le sequenze di primer erano come segue: Runx2 umano, 5-TGAGAGCCGCTTCTCCAACCC-3' e 5-CTCTGGCTTTGGGAAGAGCCG-3. I livelli di espressione dell'mRNA di Runx2 e SLC37A2 sono stati calcolati dopo la normalizzazione con APPH.

Analisi Western blotting.

Le proteine ​​totali sono state raccolte da campioni AoSMC coltivati ​​nelle stesse condizioni utilizzate per l'analisi PCR in tempo reale. Questi campioni sono stati lisati utilizzando soluzione salina tamponata con Tris (pH 75) integrata con NP-40 al 5% e un cocktail di inibitori della proteasi all'1%. I campioni di concentrazione proteica sono stati misurati utilizzando il kit di analisi proteica BCA (Thermo FisherScientific.Waltham, MA). e la concentrazione è stata regolata mediante western blotting, 10 ug di proteina sono stati separati in un gel di poliacrilammide al 10% utilizzando elettroforesi su gel di sodio dodecil solfato-poliacrilammide. La membrana è stata trattata con anticorpo SLC37A2 (Novus Biologicals, Centennial, CO) o anticorpo GAPDH (GeneTex, Irvine, CA) come anticorpi primari, incubato con anticorpo coniugato con perossidasi di rafano lgG di coniglio (R&D Systems, Minneapolis, MN) come anticorpo secondario e visualizzati utilizzando Amersham ECL Select (GE Healthcare. Buckinghamshire, Inghilterra) e un analizzatore di immagini luminescenti (LAS-1000 plus, FUNIFILM, Tokyo, Giappone). La banda è stata quantificata utilizzando lmagel.

Sperimentale

Tutti i protocolli di studio sono stati approvati dal Comitato Etico dell'Università di Hyogo, Scuola di Scienze Umane e Ambiente. Ratti Sprague-Dawley maschi di dodici settimane sono stati acquistati dal Japan SLC (Shizuoka, Giappone). I ratti sono stati mantenuti in un ciclo di 12-luce, 12-h di buio (09:00-21:00) e gli è stato concesso libero accesso al cibo e all'acqua estremamente pura.

Le diete sperimentali includono una dieta P di controllo (1,0% P, 0,6 Ca, 20% proteine), una dieta adenina (0,75% adenina , 1,0% P, 0,6% Ca, 2,5% proteine), una dieta a basso contenuto di P (LP) (0,2% P,0 0,6% Ca, 10% proteine) e una dieta ad alto contenuto di P (HP) (1,0% P, 0,6% Ca, 10% proteine) basata sulla dieta AIN93-G (dieta orientale Lievito, Tokyo, Giappone) con caseina come fonte proteica.3637) È stato segnalato che una dieta a basso contenuto proteico promuove la calcificazione vascolare nei ratti con insufficienza renale indotta da adenina, quindi è stata eseguita una restrizione proteica.3738)Prima del raggruppamento, tutti i ratti (n=23) sono stati nutriti con una dieta MF standard (lievito orientale) per una settimana per acclimatarsi. All'età di 13 settimane, i ratti sono stati divisi in 2 gruppi: il gruppo di controllo (n=5) e il gruppo con insufficienza renale cronica indotta da adenina (n=18). Il gruppo di controllo ha ricevuto la dieta P di controllo per 6 settimane. . Il gruppo con CKD indotta da adenina ha ricevuto la dieta con adenina per circa 3 settimane ed è stato poi ulteriormente suddiviso in 2 sottogruppi: il gruppo CKD-LP (n=8) o il gruppo CKDHP (n=10). I ratti del gruppo CKD-LP e del gruppo CKD-HP hanno ricevuto rispettivamente la dieta LP e la dieta HP per 3 settimane. Durante il periodo sperimentale, l'assunzione di cibo è stata registrata quotidianamente. Durante la dieta adenina, i campioni di sangue venivano raccolti dalla vena della coda tra le 10:00 e le 11:00 una volta alla settimana fino alla seconda settimana, e successivamente una volta ogni 2 giorni per monitorare i livelli plasmatici. Durante la dieta LP o la dieta HP, i campioni di sangue venivano raccolti una volta alla settimana. Sono stati raccolti campioni di urina e il volume delle urine è stato registrato una volta alla settimana. I ratti sono stati sacrificati con anestetico utilizzando isoflurano (Wako Pure Chemical Industries. Osaka Giappone) e laparotomie. Sono stati raccolti campioni di sangue prelevati dalla vena cava inferiore e dall'aorta toraco-addominale per l'analisi.

Espressione SLC37A2 sull'aorta.

Circa un terzo dell'aorta toraco-addominale raccolta è stato utilizzato per visualizzare la calcificazione e condurre l'immunocolorazione. L'aorta è stata inclusa nella paraffina e sono state tagliate 4-um sezioni. Le sezioni sono state colorate utilizzando un kit Von Kossa Method for Calcium (Polysciences. Warrington, PA) secondo le istruzioni del produttore. l'analisi immunocolorante è stata eseguita con sezioni seriali. Le sezioni sono state incubate con anticorpo SLC37A2 durante la notte a 4 gradi e quindi trattate con Histofine Simple Stain Rat MAX-POMULTI) (Nichirei Biosciences, Tokyo, Giappone) per 30 minuti a temperatura ambiente. Successivamente, le sezioni sono state trattate con un kit DABsubstrate (Nichirei).

L'RNA totale è stato estratto dal resto dell'aorta toraco-addominale congelata. La PCR in tempo reale è stata eseguita utilizzando il cDNA sintetizzato. Le sequenze di primer erano le seguenti: osteo-pontina di ratto,5ACCCATCTCAGAAGCAGAATC-3' e 5ATCCATGTGGTCATGGCTTTTC-3' e; ratto SLC37A2,5-TAGTCCCAGCTTCGAGTACGG-3' e 5'-CTGATGGCTTTCTGGACATG-3. I livelli di espressione dell'mRNA dell'osteopontina e dell'mRNA SLC37A2 sono stati calcolati dopo la normalizzazione con GAPDH

Analisi statistica.

I dati sono presentati come media + SE. Le differenze tra i gruppi sono state analizzate utilizzando il t-test. Negli esperimenti AoSMC calcificati indotti da fosfato, le differenze sono state analizzate utilizzando un'analisi della varianza unidirezionale seguita dal metodo di Dunnett. Negli esperimenti sul modello CKD, le differenze sono state analizzate utilizzando il test K ruskal-Wallis seguito dal metodo Steel-Dwass. I coefficienti di correlazione (rs) sono stati determinati utilizzando il test dei ranghi dei coefficienti di correlazione di Spearman. Per tutti i test. valori p a due code<0.05 were considered statistically significant.