La spermidina allevia il danno mitocondriale miocardico neonatale della prole indotta dall'ipossia intrauterina nei ratti inibendo lo stress ossidativo e regolando il controllo di qualità mitocondriale Parte 1

Astratto

Sfondo: L'ipossia intrauterina (IUH) aumenta il rischio di malattie cardiovascolari nella prole. Come scavenger di specie reattive dell'ossigeno (ROS), la poliammina spermidina (SPD) è essenziale per la sopravvivenza e la crescita embrionale e fetale. Tuttavia, sono necessari ulteriori studi sulla protezione SPD e sui meccanismi per il danno cardiaco indotto da IUH nella prole.

Il glicoside di cistanche può anche aumentare l'attività della SOD nei tessuti del cuore e del fegato e ridurre significativamente il contenuto di lipofuscina e MDA in ciascun tessuto, eliminando efficacemente vari radicali reattivi dell'ossigeno (OH-, H₂O₂, ecc.) e proteggendo dai danni al DNA causati da radicali OH. I glicosidi feniletanoidi di Cistanche hanno una robusta capacità di scavenging dei radicali liberi, una maggiore capacità di riduzione rispetto alla vitamina C, migliorano l'attività della SOD nella sospensione dello sperma, riducono il contenuto di MDA e hanno un certo effetto protettivo sulla funzione della membrana dello sperma. I polisaccaridi Cistanche possono migliorare l'attività di SOD e GSH-Px negli eritrociti e nei tessuti polmonari di topi sperimentalmente senescenti causati dal D-galattosio, nonché ridurre il contenuto di MDA e collagene nei polmoni e nel plasma e aumentare il contenuto di elastina, hanno un buon effetto scavenging su DPPH, prolunga il tempo di ipossia nei topi senescenti, migliora l'attività della SOD nel siero e ritarda la degenerazione fisiologica del polmone nei topi senescenti sperimentalmente Con la degenerazione morfologica cellulare, gli esperimenti hanno dimostrato che Cistanche ha la buona capacità antiossidante e ha il potenziale per essere un farmaco per prevenire e curare le malattie dell'invecchiamento cutaneo. Allo stesso tempo, l'echinacoside in Cistanche ha una significativa capacità di eliminare i radicali liberi DPPH e ha la capacità di eliminare le specie reattive dell'ossigeno e prevenire la degradazione del collagene indotta dai radicali liberi, e ha anche un buon effetto di riparazione sul danno dell'anione dei radicali liberi della timina.

Fare clic su Cistanches Herba per l'anti-invecchiamento

【Per maggiori informazioni:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

Obiettivi: Questo studio mirava a indagare gli effetti preventivi del trattamento SPD prenatale sul danno cardiaco indotto da IUH nei ratti appena nati e il suo sottostante meccanismo mitocondriale.

Metodi: Il modello ratto di IUH è stato stabilito dall'esposizione al 10% di O2 sette giorni prima del termine. Nel frattempo, per sette giorni, alle ratte gravide è stato somministrato SPD (5 mg.kg-1.d-1; ip). I ratti della prole di un giorno sono stati sacrificati per valutare diversi parametri, tra cui lo sviluppo della crescita, il danno cardiaco, la proliferazione dei cardiomiociti, lo stress ossidativo miocardico, l'apoptosi cellulare e la funzione mitocondriale e hanno il controllo di qualità mitocondriale (MQC), tra cui mitofagia, biogenesi mitocondriale e fusione/fissione mitocondriale. Negli esperimenti in vitro, i cardiomiociti primari sono stati sottoposti a ipossia con o senza SPD per 24 ore.

Risultati: IUH ha ridotto il peso corporeo, il peso del cuore, l'espressione di Ki67 cardiaco, l'attività di SOD e i livelli di CAT e adenosina 5'-trifosfato (ATP) e ha aumentato l'espressione di BAX/BCL2 e i numeri di nuclei TUNEL-positivi. Inoltre, l'IUH ha anche causato anomalie della struttura mitocondriale, disfunzione e diminuzione della mitofagia (diminuzione del numero di mitofagosomi), declino della biogenesi mitocondriale (diminuzione dell'espressione di SIRT-1, PGC-1, NRF-2 e TFAM) e ha portato allo squilibrio di fissione/fusione (aumento della percentuale di frammenti mitocondriali, aumento dell'espressione di DRP1 e diminuzione dell'espressione di MFN2) nel miocardio. Sorprendentemente, il trattamento SPD ha normalizzato le variazioni dei parametri indotti dalla IUH. Inoltre, SPD ha anche impedito l'accumulo di ROS indotto dall'ipossia, il decadimento del potenziale della membrana mitocondriale e la diminuzione della mitofagia nei cardiomiociti.

Conclusione: Il trattamento materno SPD ha causato danni cardiaci indotti da IUH nei ratti appena nati migliorando la funzione mitocondriale miocardica attraverso l'antiossidazione e l'anti-apoptosi e regolando l'MQC.

1. Contesto

Studi epidemiologici e su animali indicano che un ambiente intrauterino favorevole è associato ad un aumentato rischio di malattie cardiovascolari in età adulta (1). L'ipossia prenatale, l'ambiente intrauterino avverso più comune, può rendere il feto incapace di realizzare il suo potenziale di crescita geneticamente determinato, che si manifesta come ritardo della crescita e danno alla funzione d'organo nella prole(2). L'ipossia fetale cronica spesso deriva da una gravidanza con un'aumentata resistenza vascolare placentare come pre-clampsia, inter-gravidanza ad alta quota o malattie respiratorie materne. Più significativamente, un terzo di loro è affetto dalla sindrome da ipoventilazione dell'apnea ostruttiva del sonno (OSAHS) nella tarda gravidanza, ed è anche associata allo sviluppo della sindrome da ipertensione gestazionale. Il cambiamento patofisiologico più critico SAHS è l'ipossia intermittente cronica (3, 4). In diversi modelli animali, l'ipossia intrauterina (IUH) porta a riduzione dell'efficienza cardiaca, disfunzione diastolica e sistolica, crescita ipertrofica, diminuzione della proliferazione dei cardiomiociti e ritardata maturazione dei cardiomiociti nel cuore fetale e neonatale, aumentando così il rischio di disturbi cardiaci nella prole adulta. 5). L'effetto di programmazione dell'ipossia cronica può spiegare principalmente il meccanismo nelle fasi critiche dello sviluppo del cuore, che porta al potenziamento dello stress ossidativo cardiaco e all'aumento dell'apoptosi cellulare nella prole (6-9). Il concetto di programmazione dello sviluppo ha senso perché la nostra fisiologia è molto più malleabile e plastica durante la prima infanzia. La condizione intrauterina determina e programma i concetti di fisiologia e metabolismo che caratterizzano la nostra vita. Di conseguenza, la risposta adattativa fetale alla IUH porta allo sviluppo di malattie cardiovascolari dell'adulto (10). I mitocondri sono organelli complessi che svolgono ruoli cruciali nella generazione di energia cellulare e in una miriade di eventi di segnalazione delle cantine. L'integrità strutturale e funzionale dei mitocondri è fondamentale per la sopravvivenza dei cardiomiociti e, se compromessa, l'interruzione dell'omeostasi mitocondriale determina lo sviluppo di malattie del carac. Recentemente, diversi studi si sono concentrati sul ruolo della disfunzione mitocondriale che induce l'ipossia prenatale cronica nella mediazione del danno cardiaco della prole. È stato riportato che la funzione mitocondrialeiratoria era compromessa e l'espressione di diverse regole mol mitocondriali alterava il cuore perinatale esposto a IUH (11). Inoltre, l'IUH porta ad una diminuzione dell'attività enzimatica del complesso mitocondriale e ad una disfunzione della fetta del cuore nella prole ult a seguito di ischemia miocardica (12). Di conseguenza, questo studio mirava a scoprire il legame molecolare tra ipossia prenatale, stress ossidativo, disazione mitocondriale e danno cardiaco nella nuova prole (13).

Lo sviluppo e la maturazione di questo sistema mitocondriale ad alto volume nel miocardio si verificano principalmente nelle fasi di sviluppo perinatale e postnatale, principalmente a causa del cambiamento metabolico cardiaco dall'utilizzo di glucosio o acidi grassi per la generazione di adenosina 5'-trifosfato (ATP) dopo la nascita (14). Prove emergenti suggeriscono che i meccanismi di controllo della qualità mitocondriale (MQC) sono determinanti critici per la maturazione dei cardiomiociti (15). Il controllo della qualità mitocondriale, che include principalmente la biogenesi mitocondriale, la mitofagia insieme alla dinamica, una rete regolatoria finemente sintonizzata, orchestra la quantità e la qualità dei mitocondri e migliora la funzione mitocondriale e la sopravvivenza dei cardiomiociti in condizioni di stress (16). Il coattivatore 1 dei recettori per l'attivazione dei proliferatori dei perossisomi (PPAR) (PGC-1) ​​gioca un ruolo critico nel guidare la biogenesi e la funzione mitocondriale nel cuore (17). I cuori dei topi attivano i proliferatori del perossisoma coattivatore 1 / (-/-) dei topi mostrano le firme del difetto di maturazione e una grave anomalia nella funzione e nella densità mitocondriale (18). Inoltre, l'eliminazione del mediatore mitofagico Parkin impedisce la maturazione morfologica e funzionale dei mitocondri nella fase neonatale (19). I mitocondri sono organelli altamente dinamici, sottoposti a costanti eventi di fissione e fusione associati alla loro funzione. Nel tardo periodo embrionale, l'ablazione genetica auto-specifica della fusione mitocondriale pro in MFN1 e MFN2 nei topi mostra una grave disfunzione mitocondriale dopo la nascita e sviluppa cardiomiopatia (20). Sorprendentemente, uno studio recente ha rivelato che l'ip ia cronica ha interrotto le dinamiche mitocondriali nel proencefalo fetale di maiale (21). Di conseguenza, MQC può fungere da punto focale nello sviluppo di lesioni del miocardio nella prole neonatale IUH. Tuttavia, si sa poco sugli effetti dell'ipossia prenatale sul sistema MQC cardiaco neonatale e sull'effetto della disfunzione MQC sulla salute del cuore neonatale. Questo studio ha assunto questa missione per esplorare il meccanismo correlato ai mitocondri del danno miocardico indotto da IUH nella nuova prole ed esplorare ulteriormente le strategie preventive per ridurre il danno cardiaco da IUH.

Le poliammine (PA), tra cui putrescina (PU), spermidina (SPD) e spermina (SP), sono presenti in quasi tutti gli organismi viventi e sono essenziali per la sopravvivenza, la crescita e lo sviluppo embrionale e fetale (22-24) . Gli studi hanno scoperto che le pecore esposte a IUH possono migliorare la displasia embrionale integrando le poliammine esogene (25, 26). Inoltre, il crescente corpo della letteratura indica il ruolo delle poliammine nell'eliminazione dei radicali liberi e nella protezione del DNA, delle proteine ​​e dei lipidi dal danno dannoso dello stress ossidativo. È stato anche rivelato che l'integrazione di poliammine aumenta la durata della vita negli organismi modello tramite pro-tentativi antiossidanti, antinfiammatori e che inducono la mitofagia (27-29). Studi recenti hanno documentato che l'integrazione con SPD nella dieta è cardioprotettiva e prolunga la durata della vita sia nei topi che nell'uomo stimolando la mitofagia e la respirazione mitocondriale e migliorando la funzione cardiaca (30, 31). Ancora più importante, in precedenza abbiamo riportato che l'esposizione ipossica materna durante le ultime fasi dello sviluppo fetale ha provocato l'analista dased e l'aumento del catabolismo delle poliammine nel tessuto carac dei ratti neonati. L'SPD ha prevenuto il danno cardiaco nei ratti della progenie ven-day esposti a IUH inibendo la mentazione mitocondriale (32).

2. Obiettivi

In questo studio, si ipotizza che IUH induca deficit della struttura e della funzione mitocondriale aumentando lo stress ossidativo e distruggendo il meccanismo MQC nel cuore del neonato, e si presume che il trattamento materno SPD in utero riduca il danno miocardico diminuendo il programma di sviluppo dei mitocondri. Questo studio può contribuire allo sviluppo di strategie preventive o terapeutiche per la prole IUH per prevenire le malattie cardiovascolari adulte.

3. Metodi

3.1. Animali

I ratti Wistar maschi e femmine (di 3 mesi) sono stati acquistati dal Dipartimento di animali da laboratorio dell'Università medica di Harbin. Tutte le procedure sono state approvate dal comitato di revisione etica della Harbin Medical University (Cina) e tutti gli esperimenti sono stati condotti secondo le linee guida del National Institutes of Health. I ratti con un rapporto maschio-femmina di 2:1 sono stati collocati casualmente in una gabbia per l'accoppiamento. Il giorno successivo sono stati eseguiti strisci vaginali per rilevare la presenza di spermatozoi nei tappi vaginali o negli strisci vaginali, che è stato confermato come il giorno zero della gravidanza. Le ratte gravide sono state tenute in una stanza con umidità controllata (60 percento) e temperatura controllata (21 gradi), e il ciclo luce-buio era di 12:12 ore.

3.2. Modello di ipossia intrauterina

Dal 15° al 21° giorno di gravidanza, i ratti nel gruppo ipossia (n=10) sono stati inseriti in una camera di plexiglass chiusa, iniettati con aria e azoto e monitorati da un analizzatore di ossigeno (Pro OX12{{13 }}; BioSpherix, New York, USA) e inalato con un contenuto di ossigeno del 10% per quattro ore al giorno. I campioni di sangue arterioso sono stati prelevati dall'arteria femorale destra, i valori dei gas ematici e del pH sono stati misurati per mantenere la pressione parziale dell'ossigeno arterioso di 50 - 55 mmHg, la saturazione dell'ossigeno nel sangue è stata mantenuta al 80 - 85 percento e procedure specifiche sono state eseguite come precedentemente descritto (32). I ratti femmina sperimentali sono stati divisi casualmente in quattro gruppi: gruppo di controllo (controllo), gruppo di ipossia intrauterina (Hpx), gruppo di ipossia intrauterina più spermidina (Hpx-Spd) e gruppo di ipossia intrauterina più spermidina più inibitore (Hpx-Spd-DFMO ). Sei ratti per gruppo sono stati iniettati per via intraperitoneale il 15 - 21° giorno di gravidanza. Ai ratti è stata somministrata soluzione fisiologica allo 0,9% (1 mL/kg/giorno) nei gruppi di controllo e Hpx, SPD (5 mg/kg/giorno) nel gruppo Hpx-Spd e SPD (5 mg/kg/giorno) e difuoromethy -L-ornitina (DFMO, un inibitore dell'enzima chiave della sintesi delle poliammine ODC) (5 mg/kg/d) nel gruppo Hpx-Spd-DFMO, rispettivamente. Dopo il parto, 1-neonati di un giorno sono stati sacrificati e i loro cuori sono stati estratti per studi sperimentali di follow-up.

3.3. Analisi istologica

Il tessuto ventricolare sinistro dei ratti è stato tagliato in uno spessore < 1 cm, fissato con paraformaldeide al 4%, disidratato con alcool e incorporato in paraffina. La paraffina incorporata è stata tagliata in fette spesse 5 mm, quindi essiccata a una temperatura costante del forno di 60 gradi, decerata con xilene e seguita dalla colorazione con ematossilina-eosina (HE). Le fette di tessuto sono state osservate per valutare i cambiamenti nella morfologia e nelle strutture cardiache con un microscopio ottico (Eclipse E200; Nikon, Tokyo, Giappone).

3.4. Analisi di immunofluorescenza

La colorazione con immunofluorescenza Ki67 è stata eseguita come precedentemente descritto (33). In breve, il tessuto ventricolare sinistro dei ratti è stato fissato in formalina al 4 per cento, incorporata in paraffina; la deceratura, l'idratazione e la riparazione dell'antigene sono state completate per prime. Questi tessuti sono stati bloccati con 0,5% di albumina di siero bovino per 2 ore e quindi incubati con l'anticorpo monoclonale di coniglio Ki67 (1: 100, AF1738, Beyotime, Cina) a 4 gradi durante la notte. Dopo il lavaggio con PBS, il tessuto è stato incubato con IgG anti-coniglio di capra marcata con fluor Alexa (1: 500, A 0468, Beyotime, Cina) e controcolorata con DAPI per i nuclei. Le immagini sono state visualizzate e scansionate al microscopio laser confocale (OLYMPUS, FV1000, Giappone). Il software è stato utilizzato per analizzare la colocalizzazione delle immagini unite.

3.5. Quantificazione della fibrosi

La fibrosi cardiaca è stata valutata mediante colorazione tricromica di Masson. Come descritto sopra, le sezioni di tessuto cardiaco dei ratti neonati sono state decerate e idratate con metodi standard e quindi colorate con tricromica di Masson secondo i protocolli. Per ogni cuore sono state utilizzate due sezioni trasversali non adiacenti. La percentuale di area fibrotica nell'area totale del miocardio ventricolare sinistro è stata analizzata utilizzando il software ImageJ, vl.52 (NIH, Bethesda, MD).

3.6. Etichettatura Nick End dUTP mediata da TdT e misurazioni di cellule apoptotiche

Per determinare il numero di cellule apoptotiche nei cuori di ratto neonatale di un giorno è stato utilizzato un test di etichettatura del nick dUTP mediato da TdT (TUNEL). I tessuti cardiaci sono stati trattati seguendo la nostra procedura precedentemente descritta utilizzando un kit di rilevamento della morte cellulare (Roche, Germania) secondo le istruzioni del produttore. Tre vetrini di ciascun blocco sono stati valutati per la percentuale di cellule apoptotiche. Quattro campi di vetrini sono stati esaminati in modo casuale con ingrandimento 200 ×. In totale, sono state contate 100 celle in ciascun campo.

3.7. Misurazione dell'attività enzimatica antiossidante

L'attività della superossido dismutasi (SOD) e della catalasi (CAT) è stata misurata utilizzando kit commerciali (SOD: A001-3- 1 e CAT: A007-1-1; Jiancheng Bio. Institute, Nanjing, China) con uno spettrofotometro (Perkin- Elmer, Norwalk, CT, Stati Uniti). Secondo le istruzioni del produttore, l'operazione è stata completata e la concentrazione proteica è stata misurata utilizzando il metodo dell'acido bicinconinico (Pierce, Rockford, Stati Uniti) con albumina di siero bovino (BSA) come standard (34).

3.8. Misurazione del contenuto di adenosina 5'-trifosfato

Il contenuto di ATP nel tessuto cardiaco è stato misurato utilizzando un kit di analisi ATP (S0026B, Beyotime, Bio. Institute, Cina). Secondo le istruzioni del produttore, il lisato è stato aggiunto in proporzione al peso del tessuto, omogeneizzato con un omogeneizzatore di vetro e quindi centrifugato a 4 gradi 12000 g. Il surnatante è stato prelevato e il contenuto di ATP in ciascun campione è stato rilevato con un kit BCA luminometrico (NanoDrop, Nanodrop2000, Thermo, USA) (P0012s, Beyotime, Bio. Institute, Cina). Il metodo dell'acido bicinconinico è stato utilizzato per determinare la concentrazione proteica e quindi convertire la concentrazione di ATP in nmol/g di proteina.

3.9. Microscopia elettronica a trasmissione

Il tessuto apicale cardiaco è stato sezionato in piccoli pezzi di circa 1 mm × 1 mm × 1 mm e quindi fissato in tampone glutaraldeide fosfato a 4 gradi. Dopo la normale disidratazione, ammollo, inclusione e colorazione, sono state realizzate le sezioni ultrasottili di 50 - 70 nm. L'ultrastruttura del tessuto cardiaco è stata osservata al microscopio elettronico a trasmissione (TEM) e fotografata (H600 Hitachi, Tokyo, Giappone). Singoli mitocondri e miofilamenti sono stati mappati in condizioni di ingrandimento 10000 volte con il software Image J versione 1.80 (National Institutes of Health) e le loro aree sono state misurate da ciascun cuore (35). Nel frattempo, sono stati identificati frammenti mitocondriali < 1 µm3, che non erano divisi (solitamente rotondi), e la percentuale media di frammenti mitocondriali nel campo visivo è stata contata utilizzando l'indice di frammentazione mitocondriale (MFI).

3.10. Isolamento mitocondriale

I mitocondri sono stati isolati a 4 gradi mediante centrifugazione differenziale con un kit di isolamento dei mitocondri (Beyotime Biotechnology, Shanghai, Cina). In breve, il tessuto cardiaco fresco è stato tagliato in pezzi di tessuto e centrifugato con 10 volumi di PBS pre-raffreddato, il supernatante è stato scartato, il precipitato è stato digerito con tripsina per 20 minuti, il tampone di isolamento A aggiunto è stato centrifugato, il surnatante è stato trasferito in un altro tubo, nuovamente centrifugato, e la frazione precipitata era costituita dai mitocondri isolati. Il pellet mitocondriale cardiaco finale è stato risospeso in tampone omogeneizzante, conservato su ghiaccio e utilizzato per esperimenti sulla funzione respiratoria mitocondriale entro 4 ore.

3.11. Misurazione del consumo di ossigeno mitocondriale

Il consumo di ossigeno mitocondriale è stato misurato da un elettrodo di ossigeno di tipo Clark (Hansatech Instruments, Norfolk, Regno Unito) in un tampone di respirazione mitocondriale. Il piruvato (5 mM) e il malato (5 mM) sono stati utilizzati come substrato per i mitocondri contenenti il ​​complesso I alla concentrazione finale di 500 µg di proteine/mL. Il consumo di ossigeno stimolato dall'ADP (respirazione allo stato 3) è stato misurato in presenza di 200 µM di ADP ed è stato monitorato il consumo di ossigeno indipendente dall'ADP (respirazione allo stato 4). Il rapporto di controllo respiratorio (RCR, stato 3 diviso per lo stato 4) riflette il consumo di ossigeno per fosforilazione (accoppiamento). Le procedure sono proseguite, come descritto in precedenza (36).

3.12. Analisi Western Blot

Il campione di tessuti cardiaci è stato raccolto e conservato a -80 gradi . I tessuti cardiaci del ventricolo sinistro congelati sono stati omogeneizzati nel tampone di lisi RIPA ghiacciato (Beyotime Inc., Shanghai, Cina P0013B). Le concentrazioni proteiche sono state quantificate utilizzando un kit di analisi proteica BCA (Beyotime Inc., Shanghai, Cina P0006C). I campioni contenenti proteine ​​totali sono stati separati dal 10% (p/v) SDS-PAGE e trasferiti su una membrana PVDF (Millipore, Bedford, MA, Stati Uniti). Sono stati utilizzati i seguenti anticorpi: Anticorpi per GAPDH (1:2000,10494-1-AP), MFN2 (1:1000,12186-1- AP), SIRT-1 (1:1000,{{16 }}AP), NRF-2 (1:600,16396-1-AP), TFAM (1:1000,19998-1-AP) e BAX (1.1000,509599-2-Ig) sono stati acquistati da Proteintech (WuHan, Cina), BCL2 (1: 2000, sc-7382) e DRP1 (1:1000, sc-271583) sono stati acquistati da Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX) e PGC -1 (1:1000, ab106814, Abcam, Cambridge, MA, Regno Unito). L'anticorpo secondario (IgG anti-coniglio di capra marcata con perossidasi di rafano) proveniva da Beyotime Corporation (Shanghai, Cina). Le intensità delle bande proteiche sono state quantificate utilizzando un sistema di imaging su gel Fluor Chem Chemiluminescence (Protein Simple, USA). La densità ottica delle bande proteiche è stata analizzata con il software Image J versione l.52 (NIH, Bethesda, MD).

3.13. Modello di cardiomiocita ipossico

I cardiomiociti di ratto neonatale (NRMC) sono stati isolati e coltivati ​​con metodi standard, come precedentemente descritto (32). In breve, i cuori dei ratti neonati di tre giorni sono stati estratti, tritati, coltivati ​​e poi digeriti in 0.25% di tripsina e 0.02% di EDTA (Beyotime Biotechnology, Shanghai, Cina). Dopo la centrifugazione, i precipitati sono stati trasferiti in DMEM integrato con il 10% di siero di vitello fetale (Biolot, Russia) e incubati in aria umida contenente il 5% 2. Tre giorni dopo essere stati seminati, le cellule sono state poste in una camera ipossica di vetro (Biospherix OxyCycler C42 , Redfield, NY) e riempito con azoto per 8 minuti per scaricare l'ossigeno residuo. Questi cardiomiociti sono stati divisi casualmente nei seguenti gruppi: (1) gruppo di controllo (controllo), cellule coltivate in normali condizioni di incubazione; (2) gruppo ipossia (Hpx), cellule poste nella camera ipossica per 24 ore e poi coltivate normalmente per 24 ore; (3) gruppo Hpx-Spd, cellule poste nella camera ipossica e incubate con 10 µmol/L SPD per 24 ore; (4) Gruppo Hpx-SpdDFMO, cellule poste in una camera ipossica e incubate con 10 µmol/L SPD più 2 mmol/L DFMO per 24 ore.

3.14. Misurazione delle specie reattive dell'ossigeno

La generazione di ROS è stata misurata mediante il test di colorazione con diidroetidio (DHE) (Cat No. S0063, Beyotime, Cina). In breve, i cardiomiociti primari sono stati incubati con 5 µmol/L DHE a 37 gradi per 30 minuti, lavati con PBS e quindi spostati al microscopio per osservare i cambiamenti nell'intensità della fluorescenza. Le immagini sono state scattate con un microscopio a fluorescenza Olympus FluoView FV1000 (Olympus Optical Co., Ltd., Takachiho, Giappone) a una lunghezza d'onda di eccitazione di 535 nm e la lunghezza d'onda di emissione massima era di 610 nm, n> 20 cellule per gruppo.

3.15. Determinazione del potenziale di membrana mitocondriale

Il colorante tetrametilrodamina etil estere (TMRE) è caricato positivamente e può essere localizzato selettivamente nei mitocondri. È ampiamente utilizzato per determinare il potenziale di membrana mitocondriale (∆Ψm). In breve, la soluzione di lavoro colorante TMRE ad una concentrazione di 200 µmol/L è stata aggiunta ai cardiomiociti trattati raggruppati, miscelata accuratamente e posta in un incubatore cellulare a 37 gradi per 20 min. Il surnatante è stato aspirato e le cellule sono state lavate con PBS e spostate su un microscopio invertito per osservare il cambiamento nell'intensità della fluorescenza. La lunghezza d'onda di eccitazione era di 549 nm e la luce di emissione era di 579 nm. L'intensità della fluorescenza rossa indicava il cambiamento di ∆Ψm, n > 20 cellule per gruppo.

3.16. Esperimento di localizzazione mitocondriale e lisosomiale

Secondo le istruzioni, Mito-Tracker Green (NO.C1048, Beyotime, Cina) e Lyso-Tracker Red (NO.C1046, Beyotime, Cina) hanno utilizzato l'analisi della colocalizzazione mitocondriale e lisosomiale. Gli NRCM sono stati caricati con 200 nM MitoTracker Green FM e 50 nM LysoTracker Red in HBSS per 30 minuti prima degli esperimenti, le cellule sono state lavate con PBS e quindi le immagini cellulari sono state ottenute utilizzando un microscopio a fluorescenza Olympus FluoView FV1000. La linea laser a 488 nm è stata utilizzata per eccitare la fluorescenza di MitoTracker Green, misurata tra 505 e 515 nm. Per LysoTracker Red, è stata utilizzata la linea laser a 577 nm con una misurazione di 590 nm. La sovrapposizione dell'intensità dei pixel rossi e verdi è stata determinata utilizzando il software di quantificazione sul microscopio Nikon Eclipse, n > 20 celle per gruppo.

3.17. Analisi statistica

Tutti i dati dei gruppi sperimentali sono stati confrontati utilizzando ANOVA unidirezionale seguita dal test post hoc di Bonferroni con il software GraphPad Prism versione 8 (GraphPad Software Inc., La, Jolla.CA) e il software SPSS versione 17.1 (SPSS, Chicago, IL, United Stati). I dati sono stati espressi come media ± SEM e il livello di significatività è stato impostato su P <0.05.

4. Risultati

4.1. Prole e caratteristiche del cuore

Sono stati misurati il ​​peso corporeo (BW) e il peso cardiaco (HW) ed è stato calcolato il rapporto tra HW e BW (HW/BW) (Figura 1). I risultati hanno mostrato che il peso corporeo e il peso corporeo dei ratti neonati sono diminuiti e il loro peso corporeo/peso è aumentato a causa dell'ipossia intrauterina. Rispetto al gruppo IUH, il BW e l'HW dei ratti neonati nel gruppo SPD sono aumentati (P ​​< 0.05) e l'HW/BW è diminuito (P < 0. 05); Rispetto al gruppo SPD, sia BW che HW del gruppo di trattamento DFMO sono diminuiti (P ​​<0,05) e HW/BW sono aumentati significativamente (P <0,05).

4.2. Effetti dell'SPD sulla struttura morfologica del miocardio, sulla proliferazione cellulare e sulla fibrosi nella progenie neonatale esposta a

I risultati della colorazione HE cardiaca hanno mostrato che i cuori dei figli di un giorno esposti a IUH mostravano gonfiore e fibre miocardiche disposte in modo lasco. Tuttavia, i cuori IUH trattati con SPD hanno mantenuto una struttura del tessuto miocardico accettabile (Figura 2A). Successivamente, abbiamo valutato il numero di cardiomiociti binucleari con la fetta di tessuto macchiata con HE; il numero di cardiomiociti binucleari era maggiore nel gruppo IUH rispetto al gruppo di controllo (P <0.05). Rispetto al gruppo IUH, la proporzione di cardiomiociti binucleari nel gruppo di trattamento SPD è diminuita significativamente (P <0.05); DFMO ha attenuato l'effetto di SPD (P <0.05) (Figura 2C). Abbiamo inoltre rilevato l'espressione di Ki67 (un marcatore di proliferazione cellulare) nel miocardio di ratto utilizzando il metodo dell'immunofluorescenza. Maggiore è l'espressione di Ki67, più forte è la fluorescenza rosa unendo rosso e blu (Figura 2E). I risultati hanno mostrato che rispetto al gruppo di controllo, l'espressione di Ki67 nel gruppo IUH è diminuita in modo significativo (P <0.05), l'espressione di Ki67 è aumentata in modo significativo dopo la somministrazione di SPD (P < { {28}}.05) e l'effetto di SPD è stato abolito da DFMO (P <0,05) (Figura 2F). Questi risultati indicano che SPD può inibire il ritiro prematuro dei cardiomiociti dal ciclo cellulare indotto dalla IUH e promuovere la proliferazione dei cardiomiociti nella nuova progenie esposta alla IUH. Quindi abbiamo utilizzato la colorazione di Masson per rilevare i cambiamenti nel contenuto di collagene miocardico e valutare la fibrosi miocardica mediante misurazione dell'area del collagene (Figura 2BandD). Abbiamo scoperto che la deposizione di collagene miocardico nei cuori dei ratti neonati esposti a IUH è aumentata (P <0,05), il cui livello era più alto rispetto al gruppo di controllo. Al contrario, l'area della fibrosi miocardica dopo il trattamento SPD si è ridotta significativamente (P <0,05). Tuttavia, rispetto al gruppo di trattamento SPD, l'area di fibrosi è aumentata significativamente nel gruppo HpxSpd-DFMO (P <0,05).

4.3. Effetti della spermidina sulla struttura mitocondriale del miocardio, sulla funzione respiratoria e sul contenuto di adenosina 5'-trifosfato nella prole neonata esposta all'ipossia intrauterina

I cambiamenti della struttura ultrastrutturale del tessuto cardiaco e delle caratteristiche mitocondriali sono stati analizzati da TEM (Figura 3A). Il software Image J è stato utilizzato per quantificare la percentuale di contenuto mitocondriale (area mitocondriale nell'intera area cellulare) e l'area mitocondriale (figure 3B e C). I risultati hanno mostrato che nel gruppo di controllo i miofilamenti miocardici erano disposti in modo ordinato, la struttura del sarcomero era chiara, i mitocondri erano compatti, la matrice era più densa e le creste mitocondriali erano disposte in modo ordinato. Tuttavia, i mitocondri si sono gonfiati e in alcuni cardiomiociti del gruppo IUH sono stati osservati l'allentamento della matrice e la diminuzione della densità. Rispetto al gruppo di controllo, la proporzione di mitocondri nei cardiomiociti e l'area dei mitocondri erano entrambe ridotte (P <0.05). Tuttavia, nei cuori di ratto del trattamento SPD, i miofilamenti del miocardio erano ordinati, la struttura del sarcomero era chiara, la matrice mitocondriale era compatta e il gonfiore mitocondriale diminuiva. Rispetto al gruppo IUH, la percentuale di mitocondri nei cardiomiociti è aumentata (P <0.05) e l'area dei mitocondri è aumentata (P <0,05). DFMO ha inibito questi effetti indotti da SPD (P <0,05).

Abbiamo usato piruvato/malato come substrato per valutare la funzione respiratoria mitocondriale, compresi gli stati 3 e 4 frequenze respiratorie e RCR (Figura 3D - F). Abbiamo notato che rispetto al gruppo di controllo, la frequenza respiratoria negli stati 3 e 4 e l'RCR del gruppo IUH erano tutti significativamente più bassi (P <0.{{10}}5). È interessante notare che l'RCR degli stati 3 e 4 si è ripreso dopo il trattamento SPD (P <0.05). Al contrario, questi effetti SPD sono stati significativamente inibiti nel gruppo di trattamento con DFMO (P < 0.05). Allo stesso modo, rispetto al gruppo di controllo, il contenuto di ATP miocardico nel gruppo IUH si è ridotto significativamente (P <0,05). Rispetto al gruppo IUH, il contenuto di ATP è notevolmente aumentato nel gruppo trattato con SPD (P <0,05) e il DFMO ha attenuato gli effetti di SPD (P <0,05) (Figura 3G). Questi risultati suggeriscono che SPD può proteggere la struttura mitocondriale miocardica e il danno funzionale e prevenire il declino dei livelli di ATP nei ratti neonati esposti a IUH.

【Per maggiori informazioni:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】