Forte calo della capacità di legame della variante SARS-CoV-2 Omicron (B.1.1.529) RBD agli anticorpi nei primi sieri convalescenti COVID-19 e nei sieri vaccinali inattivati

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Astratto

Una nuovaSARS-CoV-2la variante B.1.1.529 è stata nominata dall'OMS Omicron e classificata come Variant of Concern (VOC) il 26 novembre 2021. Poiché questa variante ha più di 50 mutazioni, comprese 30 mutazioni sulla punta, ha generato molte mutazioni preoccupazioni sui potenziali impatti del COV su COVID-19. Qui attraverso saggi ELISA utilizzando le proteine ​​​​RBD ricombinanti con sequenze uguali a quelle diSARS-CoV-2WIV04 (lignaggio B.1), la variante Delta e la variante Omicron come antigeni di rivestimento, le capacità di legame tra gli RBD e gli anticorpi nei sieri convalescenti COVID-19 e nei sieri vaccinali dopo due dosi del vaccino inattivato prodotto da Sinopharm WIBP vengono confrontati tra loro. I risultati hanno mostrato che la variante Omicron può eludere gli anticorpi indotti dal ceppo ancestrale e dal vaccino inattivato, con una significativa riduzione della capacità di legame del suo RBD molto maggiore di quella della variante Delta.

Parole chiave:SARS-CoV-2; Omicron; varianti di interesse; anticorpo; dominio di legame del recettore; vaccino inattivato

Wenhao Zhou 1,2,†, Ping He 1,2,†, Junhua Li 1,†, Huan Liu 1,2, Mengjuan Shi 1,2, Junping Yu 1,2,*e Hongping Wei 1,2,*

1 CAS Key Laboratory of Special Pathogens and Biosafety, Center for Biosafety Mega-Science, Wuhan Institute of Virology, Chinese Academy of Sciences, Wuhan 430071.

2 Università dell'Accademia cinese delle scienze, Pechino 100049, Cina

1. Introduzione

Una nuova variante diSARS-CoV-2Omicron (B.1.1.529), segnalato nel novembre 2021, è stato identificato come varianti sotto monitoraggio (VUM) il 24 novembre 2021 e designato come variante preoccupante (VOC) dall'OMS due giorni dopo, mentre la variante Delta ha assunto un mese da una variante di interesse (VOI: 4 aprile 2021) a VOC (11 maggio 2021) . Al 21 dicembre 2021, la variante Omicron è stata segnalata in 106 paesi in tutte e sei le regioni dell'OMS. È stato stimato che Omicron potrebbe diffondersi più velocemente di Delta, come indicato dall'OMS il 17 dicembre 2021. Omicron ha più di 30-mutazioni residue nella proteina spike rispetto alle 15-mutazioni residue nella variante Delta [ 1], che potrebbe essere la ragione della sua maggiore trasmissibilità [2]. I tipi di vaccini approvati hanno svolto un ruolo importante nel controllo della diffusioneSARS-CoV-2[3,4]. Tuttavia, con l'evoluzione delSARS-CoV-2e l'emergere di COV, gli anticorpi generati dagli attuali vaccini potrebbero perdere la capacità di neutralizzazione delle varianti [5-7]. Pertanto, è importante valutare la capacità degli attuali vaccini rispetto a diverse varianti [8,9].

Il gold standard per valutare l'efficacia di un vaccino è determinare i titoli di neutralizzazione dei sieri immunizzati sulla base di colture di virus vivi, come il test di neutralizzazione della riduzione della placca (PRNT). Tuttavia, il PRNT necessita di un livello di biosicurezza-3 di laboratorio ed è costoso e lungo da eseguire. Al fine di stimare rapidamente l'attività di neutralizzazione dei sieri contro le nuove varianti emerse, i saggi basati sulla proteina RBD, che è il dominio di legame del recettore del virus che si lega alle cellule ospiti, possono essere utilizzati per stimare in una certa misura l'attività di neutralizzazione [10] .

Qui attraverso saggi ELISA che utilizzano le proteine ​​​​RBD ricombinanti con sequenze uguali a quelle di SARS-CoV-2 WIV04 (lignaggio B.1), la variante Delta e la variante Omicron come antigeni di rivestimento, le capacità di legame tra gli RBD e gli anticorpi nei sieri convalescenti COVID-19 e nei sieri vaccinati dopo due dosi del vaccino inattivato prodotto da Sinopharm WIBP vengono confrontati tra loro. I risultati hanno mostrato che gli anticorpi in entrambi i tipi di sieri avevano una capacità di legame ridotta con Omicron RBD, ma la piccola riduzione del legame con Delta RBD rispetto a quella con B.1 RBD indica una capacità molto maggiore della variante Omicron di sfuggire al vaccino inattivato e per infettare le persone precedentemente recuperate rispetto alla variante Delta.

2. Materiali e metodi

2.1. Campioni

Undici campioni di siero del vaccino sono stati raccolti da undici volontari sani a circa 3 settimane dopo una seconda dose del vaccino inattivato prodotto da Sinopharm WIBP (Wuhan Institute of Biological Products Co., Wuhan, Cina). Tra febbraio e maggio 2020 sono stati raccolti diciassette campioni di siero dei pazienti convalescenti infettati dalla linea SARS-CoV-2 B.1 per i test di neutralizzazione. Tutti i sieri sono stati conservati a -80 ◦C fino al momento dell'uso. Lo studio è stato approvato dal comitato etico del Wuhan Institute of Virology, Chinese Academy of Sciences (n. WIVH17202102).

2.2. Test di neutralizzazione della riduzione della placca (PRNT)

Un totale di 24 campioni di siero, inclusi 7 sieri inattivati ​​indotti da vaccino e 17 sieri convalescenti sono stati utilizzati per valutare la relazione tra l'attività di neutralizzazione del PRNT e la capacità di legame dell'RBD agli anticorpi nei sieri misurati mediante ELISA. Il PRNT è lo stesso di un precedente rapporto [11] con lievi modifiche. In breve, le cellule Vero E6 sono state coltivate in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) contenente l'10 percento di siero bovino fetale (FBS; Biological Industries, 04–001–1ACS, Cromwell, CT, USA) e 100 U/mL di penicillina-streptomicina. Le cellule sono state seminate in 12-piastre a pozzetti e incubate a 37 ◦C con il 5% di CO2 fino a formare monostrati. SARS-CoV-2 Le soluzioni WIV04 con titoli di circa 300 unità formanti placca (PFU) sono state miscelate con quattro diluizioni di ciascun campione di siero (20, 80, 320 e 1280 volte) e incubate per 1 ora a 37 ◦ C. Successivamente, le miscele sono state trasferite su 12-piastre a pozzetti contenenti monostrati cellulari Vero E6, individualmente. Dopo l'incubazione a 37°C per 1 ora con il 5% di CO2, la miscela è stata rimossa dai pozzetti, quindi i pozzetti sono stati ricoperti con DMEM contenente il 2% di FBS e lo 0,9% di metilcellulosa e incubati a 37°C con il 5% di CO2 per 4 giorni. La fissazione è stata quindi condotta aggiungendo 1 ml di formaldeide all'8% a ciascun pozzetto e incubando per 20 minuti. Infine, le piastre sono state colorate con 0,5% di violetto di cristallo. PRNT50 (maggiore o uguale al 50 percento di riduzione del numero della placca virale) è stato utilizzato per mostrare i titoli di neutralizzazione, che sono stati ottenuti secondo l'EC50 adattato mediante regressione non lineare con il software GraphPad Prism 7.

2.3. Saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA)

Tre proteine ​​RBD ricombinanti del ceppo SARS-CoV-2 B.1 (residui 319–537 della proteina spike SARS-CoV-2) e variante B.1.1.529 (Omicron, residui 319–537 con 15 mutazioni di G339D, S371L, S373P, S372F, K417N, N440 K, G446S, S477N, T478K, E484A, Q493R, G496S, Q498R, N501Y, Y505H) e B.1.617.2 (Delta, residui 319 –537 con mutazioni di L452R e T478K) (Acro Biosystems, Pechino, Cina) sono stati utilizzati per il test ELISA. In breve, le piastre ELISA (Jet Biofifil, Guangzhou, Cina) sono state rivestite con 100 µL/pozzetto di tampone carbonato (pH{36}}) contenente proteine ​​RBD ricombinanti (5 ug/mL) e incubate a 4? C durante la notte. Successivamente, le piastre sono state lavate tre volte con PBS contenente lo 0,05 percento di Tween 20 (PBST), bloccate con 330 μL/pozzetto di latte scremato in polvere al 5 percento (Oxoid, Altrincham, Regno Unito) in PBST per 2 ore a 37 gradi e poi lavate tre volte con PBST. I sieri sono stati prima diluiti con PBST a 1∶20 e 180 diluizioni e aggiunti ai pozzetti rivestiti (100μL per pozzetto). Le piastre sono state incubate a 37°C per 1 ora e poi lavate accuratamente con PBST. Infine, gli anticorpi di coniglio marcati con perossidasi di rafano (HRP) contro le IgG umane (Biodragon Immunotechnologies, Suzhou, Cina) a una diluizione di 1∶10,{55}} in PBST (100 μL/pozzetto) sono stati aggiunti alle patè e incubati per 1 ora a 37 gradi C. Dopo il lavaggio con PBST, le piastre sono state aggiunte con 100 μL/pozzetto di 3,3,5, 5- tetrametilbenzidina （TMB）（Tiangen Biotech, Pechino, Cina) e incubate per 10 minuti a temperatura ambiente. Dopo che la reazione è stata interrotta da 2 MH, SO, la densità ottica (OD) è stata misurata a 450 nm utilizzando un lettore di micropiastre (INFINITE 200 PRO, TECAN, Manredorf, Svizzera). L'analisi è stata eseguita utilizzando il software GraphPad Prism 7.

3. Risultati

3.1. La corrispondente relazione tra le capacità di legame RBD misurate mediante ELISA e la neutralizzazione dei sieri I valori PRNT50 (i titoli di neutralizzazione con una riduzione della placca virale del 50%) per sette sieri vaccinati e 17 sieri convalescenti contro SARS-CoV-2 B.1 e i corrispondenti OD450 nm misurati mediante ELISA con la diluizione dei sieri di 1:20 utilizzando l'RBD di SARS-CoV-2 B.1 come antigene rivestito erano elencati nella Tabella S1. I risultati corrispondenti sono stati illustrati nella Figura 1.

Come mostrato nella Figura 1A, B, sia per i sieri vaccinati che per i sieri convalescenti, i valori di PRNT50 sono generalmente correlati ai valori di OD450 nm, indicando che valori di OD450 nm più elevati corrispondevano all'incirca a valori di PRNT50 più elevati, cioè una maggiore attività di neutralizzazione. Attraverso l'analisi di correlazione di Pearson (come mostrato nella Figura 2C, D), è stata evidente una forte correlazione tra i valori di PRNT50 e OD450 nm di RBD con sieri sia per il gruppo convalescente che per il gruppo vaccinato. Pertanto, la misurazione dei cambiamenti in OD450 nm con il metodo ELISA potrebbe fornire una rapida indicazione per valutare i cambiamenti nell'attività di neutralizzazione dei sieri. Poiché la variante Omicron non era disponibile nel nostro laboratorio, il metodo ELISA è stato utilizzato per valutare se Omicron potesse sfuggire agli anticorpi indotti dalle infezioni naturali e dalla vaccinazione.

3.2. La capacità di legame di RBD da SARS-CoV-2 B.1, la variante Delta e la variante Omicron ai sieri vaccinati e ai sieri convalescenti

I rapporti S/N di OD450 nm dei sieri vaccinati e convalescenti rispetto a quello dei sieri di controllo negativi agli anticorpi sono stati usati per esprimere la capacità di legame degli RBD agli anticorpi nei sieri. S indica un segnale, che è l'OD450 nm dei sieri positivi all'anticorpo e N significa rumore, che è l'OD450 nm del siero negativo agli anticorpi. I risultati di 11 sieri vaccinati sono stati mostrati nella Figura 2A, B. Ad entrambe le diluizioni (1:20 e 1:80), gli anticorpi nei sieri vaccinati hanno mostrato una piccola riduzione (meno del 20%) nel legame con la variante Delta e un forte riduzione (oltre il 50 percento) nel legame con la variante Omicron rispetto a quella di B.1, come elencato nella Tabella S2. Risultati simili (Figura 2C, D) sono stati osservati anche per i sieri convalescenti del precedente ceppo B.1 (Tabella S3)

4. Discussioni

In questo studio, la capacità della variante SARS-CoV{1}} Omicron di sfuggire agli anticorpi indotti dal vaccino inattivato e dalle infezioni naturali della variante precoce è stata valutata mediante il metodo ELISA utilizzando i corrispondenti RBD come antigeni di rivestimento. Sebbene il metodo ELISA non sia uguale ai classici saggi di neutralizzazione basati su colture cellulari, come i PRNT, i valori di OD450 nm erano generalmente correlati al PRNT50 del siero (Figura 1), che è stato osservato anche da alcuni rapporti precedenti [10] poiché l'RBD della proteina spike SARS-CoV-2, in grado di riconoscere l'ACE-2 sulle cellule ospiti, si è dimostrato il principale dominio di legame del recettore alla cellula ospite ed è stato utilizzato per progettare i vaccini [12,13]. Tuttavia, ci sono alcune limitazioni all'utilizzo della capacità di legame RBD per stimare l'attività di neutralizzazione dell'anticorpo nei sieri. Altri frammenti del RBD potrebbero neutralizzare il virus [14]. Inoltre, al di fuori del RBD (RBD di Omicron contiene 15 mutazioni rispetto al lignaggio B.1 con un numero di sequenza di riferimento di NC_045512.2 su NCBI), la variante Omicron ha 15 mutazioni e diversi siti di delezione o inserimento, che potrebbero influenzare la conformazione del RBD nativo.

Come mostrato nella Figura 1 e nella Tabella S1, c'erano due campioni di siero (Vac3 e Conv10) che non mostravano una buona correlazione tra il PRNT50 e i corrispondenti valori di OD450 nm. La variante Omicron ha un totale di 30 mutazioni sulla proteina spike e la metà delle mutazioni si è verificata sull'RBD rispetto alla variante ancestrale B.1, mentre ci sono otto mutazioni per la variante Delta, due delle quali esistono sull'RBD. 15]. I risultati nella Figura 2 hanno rivelato che la variante Delta, con solo due mutazioni sull'RBD, ha una limitata diminuzione della capacità di legame dell'RBD sia ai sieri vaccinati che ai sieri convalescenti, che era coerente con alcuni studi recenti [16,17] . Tuttavia, Omicron elude efficacemente gli anticorpi provocati dalle varianti ancestrali e dal vaccino inattivato, con una forte riduzione della capacità di legame del suo RBD.

Omicron sta rapidamente diventando dominante e sta sostituendo la variante Delta. I risultati attuali potrebbero indicare la necessità di sviluppare booster utilizzando il picco di Omicron, piuttosto che i picchi di varianti ancestrali o precoci, per il potenziamento a lungo termine dell'immunità. Ciò è particolarmente importante quando si tratta dell'induzione di un'adeguata risposta immunitaria negli anziani o negli immunodepressi, che tendono a rispondere debolmente al vaccino inattivato. In conclusione, i risultati iniziali hanno mostrato che Omicron può eludere efficacemente gli anticorpi indotti dalle varianti ancestrali e dal vaccino inattivato, con una riduzione di oltre il 50 per cento della capacità di legame del suo RBD molto maggiore di quella della variante Delta.

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