Cellule staminali per medicina rigenerativa e antietà Parte 1

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Astratto:Per studiare i metodi per migliorare il trattamento dei rifiuti suini, la pelle dei suini è stata idrolizzata utilizzando diverse proteasi disponibili in commercio (Alcalase, Flavorzyme, Neutrase, Bromelain, Protamex e Papain) in diverse condizioni ottimali. Dopo l'idrolisi enzimatica, gli idrolizzati di collagene (CH) sono stati frazionati per peso molecolare (3 kDa) tramite ultrafiltrazione su membrana. I CHS sono stati analizzati per proprietà fisiche (pH, recupero proteico, contenuto di gruppi amminici liberi, distribuzione del peso molecolare e composizione amminica) nonché per proprietà funzionali (attività antiossidanti e attività anti-invecchiamento). Tra i CH, i CH idrolizzati da Alcalase (CH-Alcalase) hanno mostrato il più alto grado di idrolisi rispetto ad altri CH. Sia "CH-Alcalase" che "CH-Alcalase<3 kda"="" fractions="" showed="" a="" considerably="" high="" antioxidant="" activity="" and="" collagenase="" inhibition="" activity.="" therefore,="" resulting="" bioactive="" have="" the="" potential="" for="" development="" as="" antioxidants="" and="" anti-aging="" ingredients="" in="" the="" food,="" cosmetics,="" and="" pharmaceuticals,="" from="" animal="">

Parole chiave:idrolisi; proteasi commerciali; idrolizzato di collagene; antiossidante; anti età

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1. Introduzione

Con l'aumento dell'aspettativa di vita, le procedure antietà della pelle stanno ricevendo molta attenzione. Il collagene, utilizzato nei prodotti per la cura della pelle come ingrediente cosmeceutico per l'anti-età, è ampiamente utilizzato nel mercato cosmetico. Il collagene è una proteina fibrosa di origine animale ad alto peso molecolare, che si trova abbondantemente nel tessuto connettivo, nella pelle, nei tendini, nella cartilagine, nei legamenti, nei denti, nelle unghie e nei capelli di esseri umani e animali. Il bestiame rimane la principale fonte di collagene industriale[1]. Ogni anno, grandi quantità di sottoprodotti del bestiame vengono scartate in tutto il mondo, come rifiuti, dalle industrie alimentari e di lavorazione della carne. Tuttavia, questi possono essere utilizzati come importanti risorse proteiche per nuovi materiali alimentari o convertiti in prodotti a valore aggiunto tramite idrolisi, che è ampiamente applicata per migliorare e potenziare le proprietà funzionali e nutrizionali delle proteine ​​[2,3]. Il collagene è anche sempre più considerato una fonte di peptidi bioattivi, che si sono mostrati promettenti come composti benefici per l'uso in applicazioni nutrizionali o farmaceutiche.benefici di cistance,Pertanto, l'idrolisi del collagene può svolgere un ruolo importante nel migliorarne la biodisponibilità e l'idoneità all'uso in vari processi commerciali.

Attività fisiologiche dei peptidi bioattivi, che di solito contengono 2-20 residui di amminoacidi (<6000 da),="" are="" based="" on="" the="" composition="" and="" sequence="" of="" their="" amino="" acids="" [2,4].="" due="" to="" their="" structural="" properties="" such="" as="" molecular="" weight,="" bioactive="" peptides="" may="" possess="" specific="" characteristics="" that="" affect="" numerous="" physiological="" processes="" related="" to="" antimicrobial,="" antioxidant,="" emulsifying,="" antihypertensive,="" antidiabetic,="" and="" immunomodulatory="" functions="" in="" organisms[1,5,6].="" generally,="" low="" molecular="" weight="" hydrolysates="" display="" lower="" viscosity,="" better="" dispersion,="" higher="" hydrophobicity,="" and="" smaller="" particle="" size="" [7].="">colesterolo delle cistanzeIl grado di idrolisi influenza direttamente il peso molecolare e la composizione aminoacidica degli idrolizzati [8]. Pertanto, il processo di idrolisi può essere necessario per produrre nuovi peptidi bioattivi.

Cistanche può antietà

L'idrolisi proteica, che porta alla scissione dei legami peptidici, può essere effettuata tramite processi enzimatici o chimici [9]. I processi chimici, inclusa l'idrolisi alcalina o acida mediante estrazioni con solventi, sono dannosi non solo per l'ambiente ma anche per l'uomo che consuma i prodotti risultanti [4,10]. I processi chimici, difficili da controllare, producono prodotti contenenti amminoacidi modificati [9]. Al contrario, l'idrolisi enzimatica può essere eseguita in condizioni miti, evitando così gli ambienti estremi richiesti dai trattamenti chimici. Inoltre, i processi non producono reazioni collaterali né diminuiscono il valore nutritivo della fonte proteica [8]. Diverse proteasi, tra cui alcalasi, pepsina, protamex, tripsina e neutrasi, sono comunemente utilizzate per idrolizzare le proteine, risultando in vari tipi di idrolizzati proteici e peptidi con una varietà di attività biofunzionali. Uno studio ha riportato la produzione di idrolizzati di collagene con attività antiossidante dalla gelatina della pelle dei suini utilizzando l'idrolisi enzimatica da parte di pepsina e pancreatina [11].cistanche deserticola effetti collateraliI sottoprodotti del salmone sono stati idrolizzati per produrre idrolizzati peptici utilizzando varie proteasi, dove i peptidi finali hanno mostrato eccellenti proprietà antiossidanti e antinfiammatorie [12].

L'obiettivo della ricerca era: (a) identificare gli idrolizzati di collagene più attivi prodotti dall'idrolisi enzimatica utilizzando diverse proteasi disponibili in commercio (Alcalase, Flavorzyme, Neutrase, Protamex, Bromelain e Papain); (b) confermare l'effetto di frazionamento di idrolizzati di collagene ottenuti dall'idrolisi enzimatica e (c) per determinare le loro attività antiossidanti e anti-invecchiamento in vitro.

2. Risultati e discussione

2.1. Effetto dell'idrolisi enzimatica sugli idrolizzati di collagene

2.1.1.pH

Le proprietà funzionali delle proteine ​​possono essere migliorate attraverso l'idrolisi da parte di alcune proteasi. In questo studio, sei diverse proteasi (Alcalase, Flavorzyme, Neutrase, Bromelain, Protamex e Papain) sono state utilizzate per idrolizzare il collagene dalla pelle dei suini al fine di ottenere idrolizzati di collagene attivo a basso peso molecolare.cistance dosaggio redditLa variazione del pH negli idrolizzati di collagene (CH) è mostrata nella Figura 1. Il pH della sospensione di collagene (miscela di pelle suina al 5%) era inizialmente6.{3}}.55 (a 0h). CH-Alcalase e CH-Flavorzyme hanno raggiunto il pH ottimale (pH 8.0) a 12 h di incubazione. CH-Protamex, CH-Bromelain e CH-Papain hanno raggiunto il pH ottimale (pH7.0) a 6 ore di incubazione, mentre CH-Flavorzyme ha continuato a diminuire da pH6,39 a pH5,69 per 24 ore di incubazione (Figura 1). Il pH di un idrolizzato proteico è un fattore importante che regola le reazioni di idrolisi enzimatica[13]. Pertanto, la generazione di idrolizzati di collagene in condizioni di pH diverso può essere dovuta a cambiamenti nella conformazione degli enzimi dipendenti dal pH, che possono influire sulla loro bioattivazione e sulle proprietà fisico-chimiche.

2.1.2. Elettroforesi su gel di sodio dodecil solfato-poliacrilammide (SDS-PAGE)

Vengono mostrati i profili di elettroforesi su gel di sodio dodecil solfato-poliacrilammide (SDS-PAGE) di CH trattati con varie proteasi per 24 ore (Figura 2). Il profilo peptidico della sospensione di collagene (a 0 h) ha mostrato una banda visibile nell'intervallo di peso molecolare basso-alto. I risultati hanno indicato una rapida idrolisi in CH-alcalasi, CH-neutrasi, CH-Bronneline e CH-Protamex, poiché non c'erano bande dopo 3 ore di incubazione. Le bande ad alto peso molecolare di CH-Alcalase, CH-Neutrase e CH-Protamex sono diminuite in un modo di incubazione dipendente dal tempo. Tuttavia, la CH-Bromelina non variava con il tempo di incubazione perché ha la birra completamente idrolizzata dopo solo 1 ora di incubazione. È interessante notare che i CH sono completamente scomparsi quando il campione ha reagito con Alcalase o Neutrase per 6 ore, indicando che il collagene ha agito come substrato adatto per alcuni degli altri enzimi testati.benefici dell'estratto di cistanche,Tuttavia, le bande di CH-Flavorzyme e CH-Papain sono apparse nell'intervallo di peso molecolare da basso ad alto dopo 24 ore. Le proteine ​​possono essere parzialmente idrolizzate in peptidi o amminoacidi mediante idrolisi enzimatica, a seconda del tipo di proteasi, del tempo di incubazione e del rapporto proteasi-substrato (quantità di proteine)[14]. Il processo di idrolisi enzimatica è determinato principalmente dal fatto che il tipo di proteasi coinvolto sia un'endopeptidasi o un'esopeptidasi [15,16]. Poiché Alcalase, Neutrase e Protamex sono endopeptidasi, ci si può aspettare che i loro processi di idrolisi rompano casualmente i legami peptidici dagli amminoacidi non terminali, facilitando così un'ulteriore idrolisi delle proteine. D'altra parte, Flavorzyme è sia un'endo- che un'esopeptidasi, che rompe il non o N-terminale delle catene peptidiche. In questo studio, la proteina del collagene conteneva siti di legame, che erano più suscettibili all'attività dell'esopeptidasi rispetto all'attività dell'endopeptidasi di Flavorzyme. Pertanto, a causa dell'attività dell'esopeptidasi, l'idrolisi delle proteine ​​​​del collagene da parte di Flavorzyme ha comportato la rottura graduale dei legami peptidici dall'N-terminale degli amminoacidi, che ha rallentato l'idrolisi delle proteine.

2.1.3. Recupero proteico e contenuto libero di gruppi amminici

Viene mostrato il recupero proteico dei CH ottenuti tramite diverse proteasi commerciali (Figura 3A). Il controllo (sospensione di collagene) aveva un contenuto di recupero proteico di 1,19 mg/mL. Il recupero delle proteine ​​è un parametro dell'efficienza dell'idrolisi enzimatica. Il basso contenuto di recupero proteico di CH è indicativo di una maggiore degradazione delle proteine. Inoltre, il recupero delle proteine ​​si correla bene con la solubilità delle proteine. Una maggiore attività idrolitica può essere causata da un aumento delle catene laterali idrofobiche esposte, portando ad un aumento delle interazioni idrofobiche tra proteine ​​e/o peptidi. Queste catene laterali idrofobiche possono portare a una ridotta solubilità proteica, con conseguente aumento del recupero proteico degli idrolizzati. Nel nostro studio, il contenuto di recupero proteico era ben correlato ai cambiamenti nei modelli SDS-PAGE. I livelli di contenuto di recupero proteico più basso e più alto sono stati registrati rispettivamente per l'idrolisi di Alcalase e Flavorzyme. Per l'efficienza dell'idrolisi correlata al tempo di incubazione, CH-Alcalase, CH-Bromelain e CH-Protamex sono diminuiti drasticamente entro un'ora dall'incubazione rispetto al controllo. La diminuzione del contenuto di recupero proteico risultante dall'idrolisi proteica ha mostrato una relazione inversa con il contenuto del gruppo amminico. Inoltre, la maggior parte dei CH, ad eccezione della CH-neutrase, ha mostrato un basso contenuto proteico tra 3 ore e 12 ore. Dopo la 24incubazione, il loro contenuto proteico è aumentato nuovamente in CH-alcalasi, CH-Flavorzyme, CH-neutrasi, CH-bromelina, CH-Protamex e CH-Papaina come segue:0,83 mg/mL,1,29 mg/ ml, 0,75 mg/ml, 0,97 mg/ml, 0,77 mg/ml e 1,11 mg/ml, rispettivamente. Alcuni rapporti indicano che il tempo di idrolisi ottimale dipende da diversi fattori come la specie selezionata, la materia prima, l'enzima utilizzato, il tasso di materia prima/enzima, la concentrazione dell'enzima e il grado di idrolisi perseguito, ecc. [16 ]. Alcuni rapporti indicano che l'idrolisi enzimatica prolungata (oltre 24 h) può portare a una riduzione dell'attività proteasica; pertanto, l'idrolisi enzimatica dovrebbe essere effettuata entro 24 h dall'idrolisi enzimatica [17,18].

The free amino group content of CH, which is an indicator of enzymatic hydrolysis efficiency, was estimated(Figure 3B). The expected outcome of protein breakdown is that protein may be hydrolyzed into shorter peptide products. The free amino group content of the control was initially 0.14 mg/mL. The free amino group content of all CHs dramatically increased with increasing incubation time. After 24 h incubation, the free amino group content by descending order was: CH-Alcalase (1.00 mg/mL)>CH-Protamex(0.70 mg/mL)> CH-Neutrase(0.68 mg/mL)>CH-Bromeline (0.67 mg/mL)>CH-Flavorzyme (0.53 mg/mL)>CH-Papaina(0.40 mg/mL). Le differenze comuni nel contenuto di proteine ​​totali o di gruppi amminici liberi dei campioni idrolizzati enzimaticamente possono essere correlate alla specificità dell'enzima. Dipende dalle proprietà di un enzima durante il processo di idrolisi enzimatica [16,17]. Ad esempio, le proteasi alcaline (come l'alcalasi) esibiscono attività idrolitiche più elevate rispetto alle proteasi acide o neutre.

2.2. Effetto di ultrafiltrazione sulle proprietà dell'idrolizzato di collagene

Un processo di ultrafiltrazione può essere un metodo utile e vantaggioso dal punto di vista industriale per produrre piccole frazioni peptidiche con una dimensione molecolare desiderata e un'elevata bioattività, a seconda della composizione dell'idrolizzato di partenza e dell'attività studiata [19]. Sono mostrati la solubilità, il contenuto di gruppi amminici liberi e la resa di CH dopo la liofilizzazione (Tabella 1). La solubilità e il contenuto del gruppo amminico libero del controllo erano rispettivamente dell'11,95% e del 0,79%. Dopo idrolisi enzimatica e ultrafiltrazione con cut-off del peso molecolare di 3 kDa, in CH-alcalasi sono stati osservati la massima solubilità (21,17 percento) e il contenuto di gruppi amminici liberi (14,17 percento)<3 kda.="" however,=""><3kda was="" the="" lowest="" field="" (12.42%)observed.="" therefore,="" although="" ultrafiltration="" is="" useful="" in="" separating="" chs="" with="" low="" molecular="" weight,="" it="" may="" cause="" a="" reduction="" in="">

Il peso molecolare medio degli idrolizzati proteici è un fattore importante che determina le loro proprietà biologiche [19]. Generalmente, una frazione media con MW<3 kda="" represents="" a="" collagen="" hydrolysate;="" an="" average="" fraction="" with="" mw=""> 50 kDa represents gelatin, and an average fraction with MW>300 kDa rappresentano il collagene [20,21]. La distribuzione relativa del peso molecolare del controllo (campione di pretrattamento), CH-alcalasi e CH-alcalasi<3 kda="" is="" depicted="" in="" figure="" 4.="" the="" molecular="" weight="" distribution="" was="" over="" 20,100="" da="" for="" the="" control,="" which="" did="" not="" include="" the="" collagen="" hydrolysate=""><3 kda).="" this="" could="" not="" be="" numerically="" provided="" in="" this="" study,="" as="" the="" detection="" limit="" of="" the="" index="" detector="" system="" only="" ranged="" from="" 106="" to="" 20,100="" da.="" however,="" ch-alcalase="" showed="" detectable="" values="" in="" a="" higher="" range="" of="" relative="" molecular="" weight="" distribution,="" which="" ranged="" from="" 20,100="" da="" to="" 4270="" da="" (maximum="" peak:12,600="" da).in="" ch-alcalase=""><3 kda,="" the="" molecular="" weight="" distribution="" mainly="" showed="" three="" peaks:="" one="" with="" an="" mw="" of="" approximately="" 4270="" da(maximum="" peak),="" one="" with="" an="" mw="" of="" approximately="" 424="" da,="" and="" one="" with="" an="" mw="" of="" approximately="" 222="" da="" and="" 102="" da.="" ultrafiltration="" is="" an="" effective="" purification="" method="" used="" to="" obtain="" low="" molecular="" weight="" peptides="" from="" crude="" hydrolysates.="" results="" indicated="" that="" enzymatic="" hydrolysis="" by="" alcalase="" clearly="" reduced="" the="" high="" mw="" of="" the="" control="" (either="" collagen="" or="" gelatin),="" and="" that="" ultrafiltration="" was="" an="" effective="" purification="" method="" that="" can="" be="" used="" to="" obtain="" low="" molecular="" weight=""><3 kda)="" from="" crude="" collagen="" hydrolysates.="" reportedly,="" low="" molecular="" weight="" peptides="" (2-20="" amino="" acids)="" are="" more="" biologically="" active="" compared="" to="" their="" parent="" polypeptide/="" proteins,="" which="" are="" larger="">

Viene mostrata la composizione di amminoacidi nei CH (Tabella 2). Il CHS di diverse proteasi aveva diverse composizioni di amminoacidi e proprietà antiossidanti [23]. La composizione aminoacidica del collagene era ricca di glicina (Gly), prolina (Pro) e acido glutammico (Glu). Il contenuto di amminoacidi di CHs(CH-alcalasi e CH-alcalasi<3 kda)="" increased="" more="" than="" that="" of="" the="" control,="" following="" enzymatic="" hydrolysis="" with="" or="" without="" ultrafiltration.="" in="" particular,="" the="" content="" of="" gly,="" pro,="" and="" glu="" was="" much="" higher="" in=""><3 kda(gly="" 218="" mg/g,="" pro="" 152="" mg/g,="" and="" glu="" 120="" mg/g)="" than="" ch-alcalase(gly149="" mg/g,="" pro="" 95mg/g,="" and="" glu78="" mg/g).="" an="" increase="" in="" the="" content="" of="" these="" amino="" acids="" is="" strongly="" related="" to="" enhanced="" antioxidant="" capabilities="" 16,20].="" gly="" and="" pro="" contain="" hydrophobic="" amino="" acid="" groups,="" and="" glu="" contains="" negatively="" charged="" amino="" acid="" groups.="" these="" amino="" acids="" have="" been="" reported="" to="" enhance="" antioxidant="" activity="" because="" of="" their="" increased="" solubilities="" in="" lipids="" or="" via="" free="" radical="" reactions="">

Questo articolo è estratto da Molecules 2019, 24, 1104; doi:10.3390/molecules24061104 www.mdpi.com/journal/molecules