Studio degli effetti antietà del calcitriolo sulle cellule natural killer umane in vitro Ⅱ

3. Risultati

Questo studio si è concentrato sugli effetti antietà del calcitriolo sulle cellule NK. I risultati hanno mostrato che il calcitrioloha ridotto l'espressione di biomarcatori correlati all'invecchiamento, incluso il CD16, TIM3, PD-1, KIR eaumentato l'espressione di NKG2A delle cellule NK. ancheinibizione della proliferazione delle cellule NKEarrestarli nella fase G1. Calcitriolodiminuzione del rilascio di fattori infiammatoricome IL-5, IL-13, IFN- e TNF- e aveva alcunieffetti antiossidanti, che potrebbe contribuire alla suaeffetti antietà.

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3.1 Il calcitriolo ha invertito l'espressione dei marcatori di invecchiamento della superficie, ha rallentato l'amplificazione delle cellule NK e ha mantenuto le cellule NK nella fase G1.

Le cellule NK senescenti hanno mostrato un'elevata espressione di biomarcatori correlati all'invecchiamento, come CD16, PD-1, TIM3 e KIR, e una bassa espressione di NKG2A. Abbiamo scoperto che i livelli di espressione dei biomarcatori correlati all'invecchiamento NKG2A (Figura 1a) (*P <0.05) sono aumentati, mentre l'espressione di CD16 (Figura 1b), TIM3 (Figura 1c ), PD -1 (Figura 1d) e KIR (Figura 1e) (* P <0,05) sono diminuiti dopo il trattamento con calcitriolo per 72 ore. Gli effetti di inversione erano positivamente correlati con la concentrazione di calcitriolo (Figura 1 supplementare).

Abbiamo espanso le cellule dai campioni di sangue periferico umano in vitro. Quindi abbiamo isolato le cellule NK (CD{{0}}CD56 plus) mediante smistamento di sfere magnetiche (figura 1f). Le cellule NK selezionate sono state quindi coltivate con diverse concentrazioni di calcitriolo o rapamicina per 72 ore. I risultati della colorazione CCK8 hanno mostrato che il tasso di crescita delle cellule NK ad alta concentrazione trattate con calcitriolo (10−[7] M) era più lento di quello del gruppo di controllo negativo (NC) (*P <{{17 }}.05) (Figura 1g). Inoltre, il calcitriolo regolava il ciclo delle cellule NK. Dopo il trattamento con calcitriolo per 48 ore, le cellule NK hanno mostrato un elevato spostamento dipendente dalla concentrazione di calcitriolo verso la fase G1 (* P <0, 05), mentre la percentuale di cellule nella fase G2 (# P <0, 05) è diminuita. La proporzione di cellule NK trattate con calcitriolo nella fase S non ha mostrato alcun cambiamento, indipendentemente dalla concentrazione di calcitriolo (Figura 1h, Figura 2 supplementare). Abbiamo quindi testato se questo arresto di fase G1 derivato dal calcitriolo inducesse l'apoptosi delle cellule NK e abbiamo scoperto che il biomarcatore apoptotico delle cellule NK, l'immunoglobulina delle cellule T e il dominio del motivo inibitorio basato sulla tirosina dell'immunorecettore (ITIM) (TIGIT), non mostravano cambiamenti significativi ( P > 0,05 , NS) (Figura 1i). Questi risultati implicavano che l'aggiunta di calcitriolo riducesse il tasso di crescita delle cellule NK, diminuisse la loro proliferazione e inducesse l'arresto della fase G1 delle cellule NK invece di causare l'apoptosi.

3.2 Il calcitriolo ha diminuito il rilascio di citochine infiammatorie nelle cellule NK e ha inibito la citotossicità delle cellule NK

L'infiammazione è un'infiammazione cronica di basso grado. Accelera l'invecchiamento delle cellule NK, poiché le cellule NK partecipano a questa infiammazione cronica. La Figura 2a dimostra che i livelli di IL-5, IL-13, IFN- e TNF- sono diminuiti significativamente in tutti i gruppi rispetto al controllo negativo (*P < 0.05). IFN- e TNF- sono ben note citochine pro-infiammatorie, ma alcuni studi hanno anche dimostrato le proprietà pro-infiammatorie dell'IL-5. È stato riportato che IL-13 contribuisce a diversi tipi di infiammazione della mucosa, come l'asma allergico, la colite ulcerosa, l'esofagite eosinofila e diverse malattie correlate alla fibrosi.

Tuttavia, la citotossicità delle cellule NK comporta principalmente il rilascio di citochine infiammatorie e la degranulazione delle cellule. Abbiamo etichettato le cellule K562 con DIO e co-coltivato le cellule DIO-K562 con cellule NK trattate con calcitriolo per 4 ore. La percentuale di celle DIO plus PI plus era inferiore in tutti i gruppi di rapporto effettore (E)/target (T) rispetto al controllo negativo (*P <0.05) (Figura 2b, C). L'espressione dedotta del cluster di differenziazione 107 (CD107) indicava una degranulazione inferiore (* P <0, 05) (Figura 2d). Questi risultati mostrano l'inibizione della funzione di uccisione di NK da parte del calcitriolo.

3.3 Il calcitriolo ha attivato l'espressione di SIRT1- ∆Exon8 e la via SIRT1/pERK correlata all'anti-invecchiamento

Per studiare gli effetti anti-invecchiamento del calcitriolo sulle cellule NK, abbiamo rilevato le vie di segnalazione correlate all'invecchiamento mediante immunoblotting. L'analisi Western blotting è stata eseguita per valutare i livelli di espressione di VDR, SIRT1-∆Exon8, SIRT1 e PERK nelle cellule NK trattate con calcitriolo. L'analisi statistica ha mostrato che il calcitriolo ha attivato l'asse VDR/SIRT1/pERK ad alte concentrazioni. Nel frattempo, il calcitriolo ha attivato l'espressione di SIRT1-∆Exon8 (*P <0.05). (Figura 3a).

Figura 1. Fenotipo correlato all'invecchiamento, espansione cellulare e analisi del ciclo cellulare delle cellule NK. (ae) Le cellule NK umane trattate con calcitriolo o rapamicina per 72 ore hanno mostrato i seguenti biomarcatori cellulari: gruppo natural killer 2 membro A (NKG2A), cluster di differenziazione 16 (CD16), immunoglobulina delle cellule T e proteina contenente il dominio della mucina 3 ( TIM3) morte cellulare programmata-1 (PD-1) e recettore killer simile all'immunoglobulina (KIR), correlati all'invecchiamento. La rapamicina 50 nM (RAPA) è stata utilizzata come controllo positivo. n=3 per ogni gruppo. *P < 0.05 e **P < 0.01 sono stati confrontati con il gruppo di controllo negativo (NC). ( f ) Cellule NK (a destra) isolate da cellule mononucleari del sangue periferico umano (PBMC, a sinistra) mediante smistamento di sfere magnetiche. (g) Analisi della proliferazione cellulare misurata dal kit di conteggio delle cellule 8 (CCK8). (h) Effetto del calcitriolo o della rapamicina sul cel cyce in nk cel ordinati dopo il trattamento per 72 ore, wp 0.0, 0.05 e fp < 0,05 indicavano il significativo differenze nelle fasi G1, S e G2, rispettivamente. Tutti i gruppi sono stati confrontati rispettivamente con NC. n=3. ) La percentuale di globulina di cellimmunoa T e di cellule NK positive al dominio del motivo inibitorio basato sulla tirosina immunorecettore (TGI) dopo il trattamento con calcitriolo o rapamicina per 72 h. * p <0, 05 e ** p <0, 01 sono state confrontate con NC. n=3.

3.4 Il calcitriolo ha resistito all'invecchiamento delle cellule NK indotto dallo stress ossidativo in vitro

È ampiamente accettato che l'invecchiamento sia causato dall'accumulo di danni ossidativi a causa dell'ampio corpus di prove trovate nel corso degli anni [31]. Abbiamo coltivato le cellule NK con diverse concentrazioni di H2O2 per 24 ore e abbiamo scoperto che 1{{1{{20}}}}0 μM era la concentrazione più vicina alla dose letale mediana (LD50) (Figura 3b) . L'espressione di TIM3 nella popolazione di cellule NK è aumentata con l'aggiunta di H2O2, mentre l'espressione è diminuita dopo il trattamento con calcitriolo (* P <0, 05) (Figura 3c). Inoltre, le cellule NK invecchiate sono state colorate di blu in presenza di -galattosidasi. Questo colore blu delle cellule è un segno distintivo specifico delle cellule senescenti. L'analisi statistica ha dimostrato che le cellule NK non trattate hanno una minore attività cellulare -galattosidasica, mentre le cellule NK esposte a H2O2 hanno mostrato un'elevata attività -galattosidasica. Il calcitriolo ha ridotto la popolazione positiva alla galattosidasi, indicando la presenza di un minor numero di cellule che invecchiano (* P <0, 05) (Figura 3d). Il potenziale di membrana mitocondriale diminuito è stato osservato anche in una varietà di cellule che invecchiano da diverse specie di mammiferi. Abbiamo valutato il potenziale di membrana mitocondriale delle cellule NK in questo studio. I risultati statistici hanno mostrato che H2 O2 ha ridotto significativamente l'attività cellulare delle cellule NK rispetto a quella delle cellule non trattate, mentre il calcitriolo ha aumentato il danno causato da H2 O2 (* P <0,05) (Figura 3e).

Figura 2. Effetti del calcitriolo sulle funzioni delle cellule NK. ( a ) Analisi della citochina rilasciata dalle cellule NK trattate con calcitriolo in 48 ore. b) I risultati del cel sorting attivato dalla fluorescenza (FACS) hanno mostrato cellule K562 morte etichettate da 3, 3 - ottadecil-ossacarbocianinaDlO) e ioduro di propidio (P). Le cellule K562 sono state co-coltivate con diversi rapporti di cellule Nk trattate con calcitriolo per 4 h. (C) FACSinalysis di cel K562 morti nei test di uccisione. (d) Gli effetti di degranulazione delle cellule Nk trattate nei test di uccisione. n=3 per ogni gruppo. *p < 0.05 e **p < 0,01 sono stati confrontati con NC

3.5 Il calcitriolo ha resistito all'apoptosi delle cellule NK indotta dallo stress ossidativo in vitro

Successivamente, abbiamo misurato il numero di cellule apoptotiche. I risultati della citometria a flusso hanno mostrato che il trattamento con 100 μM H2O2 per 24 h ha portato a una significativa apoptosi delle cellule NK. Tuttavia, il trattamento con calcitriolo ha ridotto il rapporto apoptotico (* P <0, 05) (Figura 4a). Tutti i risultati di cui sopra hanno dimostrato la resistenza del calcitriolo allo stress ossidativo causato da H2O2. Tuttavia, abbiamo rilevato proteine ​​​​apoptotiche nelle cellule NK sotto stress ossidativo. Prima del trattamento con H2O2, 10- [7] M calcitriol è stato aggiunto alle cellule NK per 24 ore. I livelli delle proteine ​​correlate all'apoptosi, caspase-3 p17 e caspase-3 p20, sono aumentati significativamente dopo il trattamento con H2O2. Il calcitriolo ha diminuito l'apoptosi derivata da H2O2- e ha ridotto l'espressione di caspase-3, p17 e caspase-3 p20 (*P <0,05) (Figura 4b). Questi risultati hanno indicato che il calcitriolo ha resistito all'apoptosi indotta da H2O2.

Figura 3. Ileffetti antietàdi calcitriolo sulle cellule NK. (a) L'espressione del recettore della vitamina D (VDR), sirtuina 1 (SIRT1), SIRT1- ∆Exon8 e protein chinasi R-like endoplasmic reticulum kinase (pERK) nelle cellule NK è stata rilevata mediante analisi western blotting dopo trattamento con calcitriolo per 48 h. Come controllo di caricamento è stata utilizzata la gliceraldeide -3- fosfato deidrogenasi (GAPDH). Diagramma a barre che illustra i risultati del western blotting (n=3). *P < 0.{{10}}5 e **P < 0.01 sono stati confrontati con NC (n=3). (b) Curva di mortalità del dosaggio delle cellule NK dopo trattamento con perossido di idrogeno (H2O2) per 24 ore. (c) Percentuale di cellule TIM3 che mostrano un'espressione elevata dopo il trattamento con 100 μM H2O2 per 24 ore. ( d ) I risultati della colorazione e dell'analisi della -galattosidasi associati alla senescenza. Le cellule senescenti sono state colorate in blu e indicate da frecce rosse. Barra della scala, 50 μm. (e) Le cellule NK sono state colorate con Hoechst e Chloromethyl-X-Rosamine (CMXRos) per determinare la posizione cellulare e il potenziale della membrana mitocondriale. Le cellule di invecchiamento e apoptotiche erano Hoechst plus CMXRos- e indicate da frecce bianche. Barra della scala, 50 μm. L'analisi statistica ha mostrato l'intensità relativa della fluorescenza. *P <0,05 e **P <0,01 sono stati confrontati con il gruppo H2O2 nelle figure C, D ed E (n=3).

Figura 4. Gli effetti anti-apoptotici del calcitriolo sulle cellule NK. (a) Effetti anti-apoptotici del calcitriolo nel danno indotto da H2O2-. L'analisi FACS ha mostrato la percentuale di cellule NK apoptotiche dopo il trattamento con 100 μM H2O2 per 24 ore. (b) I livelli di espressione di caspase-3 p20 e caspase-3 p17 nelle cellule NK sono stati rilevati mediante analisi western blotting dopo trattamento con 100 μM H2O2 per 24 ore. GAPDH è stato utilizzato come controllo del caricamento. Diagramma a barre che illustra i risultati del western blotting (n=3). *P <0,05 è stato confrontato con il gruppo H2O2.

4. Discussione

L'interazione a lungo termine tra infiammazione e stress ossidativo è un fattore importante nell'invecchiamento. Inoltre, l'infiammazione e lo stress ossidativo sono sinergici [32]. L'eccesso di ROS generato dallo stress ossidativo attacca le cellule del corpo. Durante questo processo, i fattori infiammatori vengono rilasciati dal sistema immunitario attivato per uccidere le cellule anormali, il che porta a un'ulteriore generazione di ROS. La mancanza di calcitriolo può causare malattie autoimmuni, malattie metaboliche croniche e tumori. Tuttavia, si sa poco sugli effetti antietà del calcitriolo sul sistema immunitario, in particolare sulle cellule NK.

In questo studio, abbiamo studiato gli effetti anti-invecchiamento del calcitriolo sulle cellule NK. Abbiamo scoperto che il calcitriolo ha aumentato l'espressione di NKG2A, diminuendo l'espressione di KIR in vitro. La sottopopolazione CD56−CD16 plus di cellule NK, che è nota per essere correlata all'infiammazione cronica, è significativamente aumentata negli anziani [33]. Pertanto, la riduzione dell'espressione di CD16 indotta dal calcitriolo potrebbe essere attribuita al suo effetto antinfiammatorio. TIM-3 e PD-1 sono stati segnalati come recettori inibitori e di deplezione delle cellule NK. Il nostro studio ha dimostrato che il cal citriolo riduceva i livelli di espressione di TIM-3 e PD-1 e preveniva l'apoptosi delle cellule NK.

Inoltre, il calcitriolo ha inibito l'espansione delle cellule NK e ha mantenuto la popolazione di cellule NK nella fase G1 in vitro. Tuttavia, le cellule nella fase S non sono state colpite. TIGIT, noto come fattore di checkpoint delle cellule NK, è rimasto invariato. Questi risultati hanno indicato che Figura 4. Gli effetti anti-apoptotici del calcitriolo sulle cellule NK. (a) Effetti anti-apoptotici del calcitriolo nel danno indotto da H2O2-. L'analisi FACS ha mostrato la percentuale di cellule NK apoptotiche dopo il trattamento con 100 μM H2O2 per 24 ore. (b) I livelli di espressione di caspase-3 p20 e caspase-3 p17 nelle cellule NK sono stati rilevati mediante analisi western blotting dopo trattamento con 100 μM H2O2 per 24 ore. GAPDH è stato utilizzato come controllo del caricamento. Diagramma a barre che illustra i risultati del western blotting (n=3). *P <0,05 è stato confrontato con il gruppo H2O2. BIOENGINEERED 6851calcitriol non ha portato alla morte delle cellule NK, ma ha solo rallentato la velocità di espansione delle cellule NK.

È ben noto che l'infiammazione porta all'immunosenescenza [34,35]. Inoltre, abbiamo scoperto che il calcitriolo ha ridotto i livelli di IL-5, IL-13, IFN- e TNF- nelle cellule NK. La citotossicità delle cellule NK è in parte mediata dal rilascio di fattori infiammatori [36]. Inoltre, c'è stata una diminuzione della mortalità delle cellule tumorali K562 e della degranulazione delle cellule NK. Questi risultati sono stati in linea con le nostre aspettative. La rapamicina è un noto farmaco che riduce il tasso metabolico per prevenire l'invecchiamento[37], utilizzato come controllo positivo in questo studio. Risulta in immunosoppressione e aumenta il rischio potenziale di tumore e carico tumorale. Questo onere è stato confermato nei modelli murini di cancro al seno [38]. Non è noto se il calcitriolo mostri effetti simili alla rapamicina. Dovrebbero essere eseguiti più studi sugli animali e clinici per verificare i loro effetti nel corpo umano.

Infine, abbiamo studiato gli effetti del calcitriolo sulla senescenza antiossidante. Il resveratrolo, un noto farmaco antietà, può sottoregolare il percorso NF-κB attivando l'asse SIRT1/PERK. Questa downregulation ha anche dimostrato di essere benefica nei disturbi neurodegenerativi e nelle malattie cardiovascolari [39]. La deacetilazione di SIRT1 è associata al controllo metabolico e alla biogenesi mitocondriale. In questo tipo di regolazione, livelli elevati di SIRT1 possono promuovere l'accumulo di coattivatore gamma del recettore attivato dal proliferatore del perossisoma -1 alfa (PGC-1) nel nucleo, che si traduce nella trascrizione dei geni necessari per funzione mitocondriale [40]. Inoltre, SIRT1 sopprime il bersaglio dei mammiferi della via di segnalazione della rapamicina (mTOR), che può proteggere i nervi e resistere all'invecchiamento cerebrale nei topi [41]. In questo studio, abbiamo identificato un percorso normativo simile per il calcitriolo. Il calcitriolo ha attivato SIRT1 tramite VDR e ha sollevato l'asse SIRT1/pERK.

Inoltre, abbiamo scoperto che il calcitriolo sovraregolava l'espressione di SIRT1-∆Exon8. Le sollecitazioni sono note come fattore di sovraregolazione di SIRT1-∆Exon8. Sebbene SIRT1-∆Exon8 stesso mostri una ridotta attività di deacetilazione di p53, esercita un effetto di deacetilazione additivo su p53 quando espresso insieme a SIRT1 a lunghezza intera [42]. Questo effetto indicava la funzione anti-apoptotica del calcitriolo sulle cellule NK. Tuttavia, il ruolo di SIRT1-∆Exon8 nei percorsi legati all'età resta da comprendere meglio. Poiché il declino di SIRT1 potrebbe essere dovuto al danno ossidativo [43], abbiamo stabilito un modello di cellule NK con invecchiamento acuto in vitro utilizzando H2O2. L'invecchiamento ossidativo indotto da H2O2 ha aumentato l'espressione di TIM3 e l'attività della -galattosidasi nelle cellule NK. Abbiamo scoperto che il calcitriolo ha resistito al danno ossidativo e ha mantenuto l'attività mitocondriale e la vitalità cellulare delle cellule NK prevenendo l'apoptosi cellulare. Tuttavia, il calcitriolo non è stato ancora identificato come farmaco anti-invecchiamento nella medicina clinica poiché sono necessarie ulteriori prove sugli effetti anti-invecchiamento di questo farmaco in vivo. In sintesi, abbiamo fornito prove preliminari per implicare gli effetti anti-invecchiamento del calcitriolo sulle cellule NK in vitro. Riteniamo che gli effetti di questo farmaco debbano essere ulteriormente esplorati in futuri studi clinici e su animali.

5. conclusione

In questo studio, abbiamo dimostrato ileffetti antietàdi calcitriolo sulle cellule NK. Il calcitriolo ha invertito l'espressione dibiomarcatori di invecchiamentosulle cellule NK. Ha rallentato l'amplificazione delle NK e le ha mantenute in fase G1. Inoltre, il calcitriolo ha inibito il rilascio di citochine infiammatorie e la degranulazione down-regolata delle cellule NK. L'attivazione dell'asse SIRT1-∆Exon8 e VDR/SIRT1/pERK da parte del calcitriolo potrebbe essere il meccanismo principale dell'effetto antietà del calcitriolo sulla base di quanto sopra. Infine, il calcitriolo ha resistito alla senescenza ossidativa delle cellule NK in vitro. Ulteriori studi dovrebbero concentrarsi sulla ricerca clinica e sugli animali.

Punti salienti

(1) Il calcitriolo ha diminuito l'espressione di biomarcatori correlati all'invecchiamento tra cui CD16, TIM3, PD-1, KIR e ha aumentato l'espressione di NKG2A delle cellule NK. (2) Il calcitriolo è stato in grado di inibire la proliferazione delle cellule NK e di arrestarle nella fase G1. (3) Il calcitriolo ha ridotto il rilascio dei principali fattori infiammatori come IL-5, IL-13, IFN- e TNF- delle cellule NK.(4) L'effetto anti-invecchiamento del calcitriolo sulle cellule NK può essere raggiunto attraverso il percorso del segnale Sirt1- pERK.

Ringraziamenti Vorremmo ringraziare tutti i membri dello staff del nostro gruppo per il loro supporto e il Comitato per l'innovazione scientifica e tecnologica di Shenzhen per il loro sostegno finanziario a questo studio.

Finanziamento Questo lavoro è stato sostenuto finanziariamente dal Comitato per l'innovazione scientifica e tecnologica di Shenzhen (JCYJ20170412155231633), Fondo per la costruzione della disciplina medica chiave di Shenzhen (n. SZXK062), Chengdu Wecistanche Biotech e il progetto di medicina Sanming a Shenzhen (n. SZSM202011010); Comitato per l'innovazione scientifica e tecnologica di Shenzhen [JCYJ20170412155231633]; Fondo per la costruzione della disciplina medica chiave di Shenzhen [n. SZXK062]; Progetto di medicina Sanming a Shenzhen [n. SZSM202011010].

Approvazione etica Tutte le procedure sono state approvate dal comitato etico dell'ospedale popolare di Shenzhen Luohu (ZLNK 12/2019, Shenzhen, Cina). È stato ottenuto il consenso informato per la sperimentazione con campioni umani.

Dichiarazione di divulgazione Tutti gli autori hanno approvato l'invio di questo manoscritto. Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti noti o relazioni personali che potrebbero aver influenzato il lavoro riportato in questo lavoro.

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