Studio sulla funzione neuroendocrino-immunitaria di Cistanche Deserticola e dei suoi prodotti per la cottura a vapore del vino di riso nel modello di ratto indotto da glucocorticoidi

Contatto: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Bonan Liu, Ji Shi, Zhe Li, Chao Zhang, Pengpeng Liu, Wei Yao e Tianzhu Jia

1 School of Pharmacy, Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, Dalian 116600, Cina

2 Il secondo ospedale della Dalian Medical University, Dalian 116600, Cina

Astratto

La dimora nel desertoCistanche alle erbeè stato registrato per la prima volta nello "Shen Nong Herbal Classic" ed è elencato come la medicina erboristica di prima qualità in questa pubblicazione. /e La farmacopea cinese registra quei pezzi di Cistanche desertiche(CD) e riso al vaporeCistanche desertiche(WCD) possono essere utilizzati in clinica come i principali tipi di decotti. Dopo essere stato cotto a vapore con vino di riso, vengono potenziati gli effetti antietà e tonificante del rene-yang. In questo studio, abbiamo rilevato il contenuto chimico di Cistanche Deserticola e WCD e il meccanismo farmacologico di rinvigorente carenza di rene-yang nei ratti modello. Scopo. /lo scopo di questo studio era di esaminare gli effetti di Cistanche Deseticola e WCD sul sistema neuroendocrino-Funzione immunitariadi carenza di rene-yang in ratti modello overdose di glucocorticoidi. Materiali e metodi. Sono stati selezionati ratti Sprague Dawley (SD). /e ratti hanno iniettato per via sottocutanea una sospensione acquosa di corticosterone per i ratti modello con sovradosaggio di glucocorticoidi. /e ratti di controllo positivo sono stati sottoposti a sonda gastrica con pillole Jinkuishenqi e dosi alte, medie e basseCistanche Deserticola/sospensioni WCD (rispettivamente 1,646 g/(kg al giorno), 5,48 g/(kg al giorno), 2,74 g/(kg al giorno) e 1,37 g/(kg al giorno); ai gruppi di controllo in bianco (BC) e di controllo modello (MC) è stato somministrato lo stesso volume di acqua distillata di quelli nel gruppo del farmaco per 40 giorni consecutivi alla dose di 1 ml/100 g. Dopo l'ultima somministrazione, il sangue è stato raccolto dall'aorta addominale e i livelli sierici di T, CRH, ACTH, CORT, cortisolo, IL-10, IL-6, IL-2, TNF - e sono stati misurati IFN-c. Sono stati calcolati gli indici d'organo del timo e della milza. L'espressione /e di Bax, Bcl-2, caspase-3, Fas e FasL nella ghiandola surrenale è stata misurata mediante immunoistochimica. /e cambiamenti patologici nella ghiandola del timo e nella ghiandola surrenale sono stati osservati mediante colorazione HE (× 200). I sottoinsiemi di linfociti T nel sangue periferico sono stati rilevati dalla citometria e anche l'espressione dell'mRNA di CaM nei tessuti dell'ipotalamo e dell'ipofisi è stata misurata mediante RT-PCR. Risultati. Rispetto al gruppo MC, i gruppi Cistanche Deserticola e WCD hanno mostrato aumenti di attività, l'indice d'organo del timo e della milza, i livelli sierici di T, CRH, ACTH, CORT, cortisolo, IL-2 e IL -10, il rapporto tra CD4 più /CD8 più e l'espressione di Bcl-2, caspasi-3, Fas, FasL e CaM nel tessuto ipofisario. / eCistanche Deserticolae i gruppi WCD hanno anche mostrato riduzioni dei livelli di IL-6, TNF- e IFN-c nel siero e dell'espressione di CaM mRNA nell'ipotalamo. Conclusioni. Ogni dose di Cistanche Deseticola e WCD potrebbe contrastare l'ormone sessuale disregolato e i fattori immunitari nei ratti modello overdose di glucocorticoidi, migliorando e ripristinando l'efficacia delle cellule nervose ipotalamiche e migliorandoFunzione immunitaria.

introduzione

Cistanche desertiche, che è chiamato "ginseng del deserto", è una medicina tradizionale cinese che è stata usata per secoli come erba tonica yang per rinvigorire i reni e rafforzare lo yang [1]. Otto specie e una variazione di Cistanche Herba sono state registrate in Cina e solo Cistanche deserticola YC Ma e Cistanche tubulosa (Schenk) Wight sono registrate nella farmacopea cinese [2]. Studi farmacologici hanno dimostrato che Cstanches Herba ha mostrato azione neuroprotettiva [3], immunomodulante [4], cardioprotettiva [5], antifatica [6], antinfiammatoria [7], epatoprotettiva [8], antiossidante [9], antibatterica [10], lassativa [11] ed effetti antitumorali [12]. L'ampio spettro di attività biologiche riportate di questo genere è stato attribuito alla composizione fitochimica complessa e varia. Cistanche deserticola contiene glicosidi feniletanoidi, iridoidi, polisaccaridi [13], ecc. Il contenuto di glicosidi feniletanoidi è il più alto nei materiali medicinali originali [14]. La lavorazione della Materia Medica cinese (CMM) è una tecnica farmaceutica tradizionale per soddisfare i diversi requisiti per il trattamento, la dispensazione e la preparazione secondo la teoria della medicina tradizionale cinese. Questi prodotti trasformati sono denominati pezzi di decotto, che vengono utilizzati nelle cliniche. /e gli obiettivi del trattamento sono aumentare l'efficacia e/o ridurre la tossicità dei farmaci grezzi. La farmacopea cinese del 2015 ha registrato che le fette spesse di Cistanche (CD) e le Cistanche al vapore di riso (WCD) potevano essere utilizzate come pezzi di decotto nella clinica. Il nostro gruppo di ricerca ha dimostrato che l'effetto lassativo è stato alleviato e gli effetti tonificanti antietà e yang del rene sono stati migliorati dopo che Cistanche è stato cotto a vapore con vino di riso [15].

La funzione dell'asse ipotalamo-ipofisi-surrene-timo (HPAT) è disordinata nella sindrome da carenza di rene-yang [16]. I pazienti con carenza di rene-yang hanno anche una vasta disfunzione immunitaria. La disfunzione dell'asse HPA è strettamente correlata all'immunodeficienza. La teoria della rete neuroendocrino-immune (NEI) mostra che i sistemi immunitario e neuroendocrino condividono molti ligandi e recettori [17] e l'ipotalamo è considerato il perno per collegare il neuroendocrino con il sistema immunitario.

In questo studio, abbiamo replicato la carenza di rene-yang in ratti modello con iniezione di corticosteroidi esogeni ed abbiamo esplorato il meccanismo della carenza di rene-yang in risposta a diversi prodotti trasformati di Cistanche deserticola dal punto di vista endocrino-Funzione immunitaria.

Materiali e metodi

Materiali e reagenti.

Cistanche deserticheè stato raccolto da Alashan Neimenggu nel 2019.5 e identificato come i gambi carnosi essiccati di Cistanche deserticola YC Ma dal Prof. Yanjun Zhai (Scuola di Farmacia, Università di Medicina Tradizionale Cinese di Liaoning, Cina). I campioni di voucher sono stati conservati presso il Liaoning Processing Engineering Technology Center.

I composti standard di un jugol sono stati acquistati da Chengdu Pure Chem-Standard Co., Ltd. (Chengdu, Cina); il cistanoside F, l'echinacoside, il cistanoside A e l'iso-acteoside sono stati acquistati da Must Company (Cina del Sichuan); acteoside è stato acquistato da Dalian Meilun Bio. Co., Ltd. (Dalian, Cina). L'acetonitrile e il metanolo di grado MS sono stati acquistati da Merck KGaA (Darmstadt, Germania). L'acido formico di grado HPLC è stato acquistato da Merck KGaA (Darmstadt, Germania). Il vino di riso è stato acquistato da Zhejiang Brand Tower Shaoxing Wine Co., Ltd. (Zhejiang, Cina).

Corticosterone (CAS: 50-22-6, purezza > 98 percento, TCI Shanghai Development Ltd. Co.), chinkuei shin chewan pills (Beijing Tongrentang Technology Development Co., Ltd.), ratto ACTH, CRH, T, IL{{ 2}}, IFN-c, TNF-, IL-2 e IL{6}} kit di rilevamento ELISA sono stati acquistati da Nanjing Jian cheng Co., Ltd. /e kit ELISA per cortisolo di ratto è stato fornito da BOSK Co. ., anticorpo di ratto CD4, anticorpo CD8a (n. 561833 e 559976), lisato di globuli rossi (Solarbio, R1010), soluzione tampone PBS (Solarbio, P1020-500), TRIzol (MAN0001271), CaM e -actina a monte e i primer a valle sono stati forniti dal Guangzhou Invitrogen Co. Reverse Transcription Kit (n. RR037A) e il cDNA Synthesis Kit (n. 10000068167) sono stati forniti da Bole Life Medicine Products (Shanghai) Co., Ltd. Cloroformio, isopropanolo, 75 percento di etanolo, e la soluzione di uretano erano tutti analiticamente puri e prodotti da Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. L'acqua ultrapura è stata prodotta dal sistema Milli-Q (18,2 MΩ, Millipore, MA, USA).

Strumenti sperimentali

Un marcatore enzimatico (Thermo, modello 3530911931), lavapiastre automatica (modello HBS- 4009), misuratore di forza push-pull con display digitale (modello VICTOR- 50N), centrifuga di congelamento ad alta velocità (modello Sigma 3k15 ), ultramicrospettrofotometro (modello B-50Q), amplificatore genico (modello L96G), PCR quantitativa a fluorescenza in tempo reale (modello StepOne), citometro a flusso (modello AC66051710132), microtomo di paraffina (modello Laika), microscopio (Olympus , modello BS-53) e uno strumento per acqua pura (modello F7JA36507).

Preparazione di campioni per UPLC-Q-TOF-MS ed esperimenti farmacologici.

Il WCD è stato elaborato dallo stesso lotto di Cistanche deserticola nel nostro laboratorio. Per la preparazione del WCD, pezzi CD secchi (5 mm di spessore) (100 g) sono stati infusi con vino di riso (30 ml), cotti a vapore ad alta pressione (1,25 kPa) per 4 ore e quindi essiccati a 55 gradi.

Le polveri grossolane di CD e WCD sono state immerse in 10 volte 95 percento di etanolo per 0,5 ore, estratte a riflusso 3 volte ogni volta per 1 ora e filtrate e i filtrati di 3 volte sono stati combinati. /e etanolo è stato recuperato a pressione ridotta e l'estratto è stato ottenuto per la somministrazione. /e estratto (1 ml) è stato aggiunto al 50 percento di metanolo, portando il volume totale a 20 ml e conservato a 4 gradi per l'analisi del contenuto.

UPLC-QqQ-MS Condizioni per l'analisi di estratti di CD e WCD

Per eseguire l'acquisizione e l'elaborazione dei dati è stato utilizzato il sistema UPLC-MS/MS con il software MassLynx 4.1 Analyst. /e colonna analitica era una Acquity UPLC BEH C18 (1{{10}}0 mm × 2,1 mm, 1,7 μm) a una temperatura di 40 gradi C. /e la fase mobile era 0,1 percento di soluzione acquosa di acido formico (A) e acetonitrile contenente lo 0,1 percento di acido formico (B). /e gradiente di eluizione era 0.00–1.00 min con 3 percento B, 1,01–2.00 min con 3 percento –11,5 percento B, 2,01–3.{{ 29}} min con 12% B, 3,01–4.00 min con 15% B, 4,01–5.00 min con 20% B, 5,01–6.00 min con 22% B, 6,01–8.00 min con 25% B e 8,01–9.00 min con 10% B. La velocità di flusso /e era di 0,3 ml/min e il volume di iniezione era 1,0 ml.

Lo spettrometro di massa a triplo quadruplo di Waters (Xevo TQD, Waters Corp., Milford, MA, USA) dotato di una sorgente di ionizzazione elettrospray (ESI) è stato utilizzato nella modalità a ioni negativi. /e il gas di desolvatazione era azoto con una portata di 500 L/h ad una temperatura di 250 gradi. Tutti i composti rilevati sono stati misurati nella modalità di monitoraggio delle reazioni multiple (MRM); La tabella 1 mostra i parametri energetici e la tabella 2 mostra le curve di calibrazione per i componenti analizzati.

Preparazione di sostanze di riferimento

Tubuloside A (3,02 mg), echinacoside (3,00 mg), 2′-acetilatteoside (2,34 mg), acteoside (2,45 mg), isoacteoside (0,61 mg), cis tanoside F (2,14 mg), salidroside (3,39 mg), acido geniposidico (2,84 mg), ajugol (1,58 mg) e catalpol (2,39 mg) sono stati sciolti in metanolo per preparare una soluzione madre. /e soluzione madre è stata diluita con metanolo per ottenere le concentrazioni appropriate per le soluzioni standard di lavoro. Tutte le soluzioni preparate sono state conservate a 4 gradi prima dell'uso.

Preparazione e raggruppamento di modelli animali

Ratti maschi SD (180–220 g) sono stati acquistati da Liaoning Chang sheng Biotechnological Co., Numero permesso per animali: SCXK (Liao) 2015–0001. Tutti i ratti sono stati mantenuti con libero accesso a cibo e acqua a 25 gradi e un'umidità relativa del 30-50 percento. Gli animali sono stati alloggiati per 7 giorni prima degli esperimenti.

Cento ratti sono stati divisi casualmente in 1{{30}} gruppi: gruppo di controllo in bianco (BC), gruppo di controllo modello (MC), gruppo di controllo positivo (PC), gruppo di controllo del vino di riso (WC), CD gruppo ad alto dosaggio (CD-HD), gruppo CD a dosaggio medio (CD-MD), gruppo CD a basso dosaggio (CD-LD), gruppo WCD ad alto dosaggio (WCD-HD), gruppo WCD a dosaggio medio (WCD-MD ) e il gruppo WCD a basso dosaggio (WCD-LD). /e le dosi di CD-HD/WCD-HD, CD-MD/ WCD-MD e CD-LD/WCD-LD erano 5,48 g/(kg ∙ d), 2,74 g/ (kg ∙ d) e 1,37 g /(kg ∙ d), rispettivamente. La dose /e per il gruppo PC era 1,646 g/(kg ∙ d) e per il gruppo WC, 1 ml/100 g per 40 giorni. /e 6° giorno dopo la somministrazione, ai ratti è stata iniettata per via sottocutanea la sospensione acquosa di corticosterone (corticosterone più 0,1 percento di dimetilsolfossido più 0,1 percento di Tween-80 più 0,9 percento di sodio cloruro) ad eccezione del gruppo BC [18]. /e la concentrazione di corticosterone era di 5 g/l e la dose era di 0,1 ml/100 g. /e ai ratti del gruppo BC è stata somministrata soluzione salina normale più 0,1 percento di dimetilsolfossido più 0,1 percento di Tween- 80 più 0,9 percento di cloruro di sodio per iniezione alla stessa dose.

Determinazione delle funzioni dell'asse HPA

Test di peso, temperatura e potenza di tenuta:Un test del peso è stato eseguito ogni 3 giorni e la temperatura è stata misurata ogni 6 giorni. durante l'esperimento. Il 39° giorno, la forza massima dell'arto posteriore è stata misurata con un misuratore di presa. /e ratti sono stati posti su piattaforme lisce, facendo afferrare il palo con l'arto posteriore. /i topi afferreranno istintivamente qualsiasi oggetto per evitare di spostarsi all'indietro quando la coda viene tirata fino a quando la forza di trazione non supera la presa. Quando il topo ha perso la presa, il preamplificatore potrebbe registrare automaticamente la massima forza di presa.

Determinazione del livello di T, CRH, ACTH, CORT e cortisolo nel siero: un'ora dopo l'ultima somministrazione, i ratti sono stati anestetizzati mediante iniezione intraperitoneale di una soluzione di uretano (20 g/100 mL). /it, i campioni di sangue sono stati raccolti, centrifugati a 3500 r per 15 minuti per ottenere il siero e conservati a -20 gradi. Le concentrazioni di T, CRH, ACTH, CORT e cortisolo sono state misurate con kit ELISA di ratto secondo le istruzioni del produttore.

Osservazioni al microscopio: la struttura morfologica del tessuto della ghiandola surrenale è stata osservata mediante colorazione HE. Il tessuto surrenale è stato fissato in paraformaldeide al 10%, disidratato in etanolo, reso trasparente da una soluzione di xilene, incorporato con metodi convenzionali, tagliato a fette spesse 4 μm, decerato con una soluzione di xilene, idratato con il gradiente di etanolo e quindi colorato con ematossilina ed eosina soluzione colorante. Dopo essere stata resa trasparente con xilene, la lastra è stata sigillata con gomma neutra e osservata al microscopio.

Colorazione immunoistochimica dell'espressione proteica Bax, Bcl-2, Caspase-3, Fas e FasL nella ghiandola surrenale

Le sezioni surrenali di ratto fissate in formalina e incluse in paraffina sono state deparaffinate e reidratate dopo essere state tagliate a uno spessore di 4 μm. Per il blocco dell'attività della perossidasi endogena, le sezioni sono state preincubate in blocco di perossido di idrogeno per 10 min. Le sezioni sono state immerse in 0,01 M citrato (pH 6,0) e riscaldate fino all'ebollizione. Il processo /e è stato ripetuto dopo 5–10 min. Dopo il raffreddamento, le sezioni sono state lavate con PBS (pH 7,2–7,6) 1–2 volte, lasciate a temperatura ambiente per circa 5 minuti e lavate con PBS (pH 7,2–7,6) 2–3 volte. /e Una soluzione bloccante di BSA al 5 percento è stata aggiunta a temperatura ambiente e il liquido in eccesso sulla sezione è stato scosso via 20 minuti dopo. Anticorpi primari diluiti specifici per Fas/FasL, Bcl-2/Bax e caspasi-3 (1:100 diluiti con PBS) sono stati aggiunti e incubati a 37 gradi per 1 ora o 4 gradi durante la notte. Le sezioni /e sono state lavate 2–3 volte con PBS (pH 7,2–7,6). /it, è stato aggiunto IgG anti-topo di capra biotinilato e le sezioni sono state asciugate a 20–37 gradi per 20 minuti e lavate con PBS (pH 7,2–7,6) 4 volte per 5 minuti. Dopo un accurato lavaggio in PBS, le sezioni sono state incubate con una miscela di reagenti A e B per 30 min, incubate con PBS per 45 min e infine sviluppate con substrato DAB (DAKO) per 30 min prima di essere leggermente contrastate con ematossilina, disidratate, e montato.

Determinazione delle funzioni immunitarie

Calcolo dell'indice degli organi immunitari:Un'ora dopo l'ultima somministrazione, i ratti sono stati anestetizzati mediante iniezione intraperitoneale di soluzione di uretano (20 g/100 mL), quindi la milza e il timo sono stati rimossi e pesati immediatamente in una cappa sterile. I coefficienti di peso della milza o del timo ( percentuale ) della milza o del peso del timo (mg)/peso corporeo (g).

Risultati sperimentali

Analisi UPLC-QqQ-MSA:Per ottenere la migliore separazione, forma del picco e un breve tempo di analisi, nel nostro esperimento preliminare sono state studiate le condizioni cromatografiche tra cui colonna, fase mobile e programma di gradiente. /e cromatogrammi tipici con modalità MRM sono presentati in Figura.Dalla tabella 4, abbiamo potuto vedere che il contenuto di glicosidi feniletanolo in WCD è aumentato rispetto a quelli di CD, in particolare per echinacoside e acteoside, mentre il contenuto di iridoidi è diminuito in WCD.

Regolazione per la funzione dell'asse HPA: i ratti del gruppo MC e dei gruppi sperimentali hanno mostrato sintomi di carenza di rene-yang gradualmente dopo la somministrazione di corticosterone. /e sintomi, come perdita di peso, ipotermia, perdita di lucentezza dei capelli, calo dello spirito, ritardo nella risposta, significativa diminuzione del consumo di acqua e dell'attività, sono notevolmente migliorati nei gruppi CD e WCD. La Figura 2(a) mostra le variazioni di peso. /e il peso di ciascuno dei gruppi di farmaci è aumentato, specialmente nei gruppi CD-HD e WCD-HD. L'aumento di peso nel gruppo MC è stato il più basso. La figura 2 (b) mostra le variazioni di temperatura, che era la più bassa nel gruppo MC, e la temperatura è aumentata nei gruppi WCD-HD, WCD-MD e WCD-LD.

Livelli di T, CRH, ACTH, CORT e Cortisolo: la Figura 3 mostra che, rispetto a quelli del gruppo BC, i livelli di T, CRH, ACTH e CORT nel siero di ratto sono diminuiti (P ​​<0. 01)="" e="" il="" livello="" di="" cortisolo="" è="" diminuito="" (p="">< 0.05)="" nel="" gruppo="" mc.="" rispetto="" a="" quelli="" del="" gruppo="" mc,="" il="" livello="" di="" t="" nei="" gruppi="" wcd-hd="" e="" wcd-md="" è="" aumentato="" (p="">< 0.01),="" il="" livello="" di="" crh="" nel="" wcd-ld,="" wcd-md="" e="" gruppi="" wc="" migliorati="" (p="">< 0.01),="" contenuto="" di="" acth="" aumentato="" nei="" gruppi="" cd-hd,="" wcd-md="" e="" wcd-hd="" (p="">< 0,01),="" livello="" cort="" aggiornato="" in="" i="" gruppi="" cd-md,="" wcd-md="" e="" wcd-hd="" (p=""><0,01) e="" aumentato="" nei="" gruppi="" cd="" hd="" e="" wcd-ld="" (p=""><0,05), e="" il="" livello="" di="" cortisolo="" è="" aumentato="" in="" ciascuno="" dei="" gruppi="" di="">

Risultati dell'osservazione al microscopio: il tessuto della ghiandola surrenale può essere suddiviso nello strato corticale e nello strato midollare. Gli strati corticali comprendono gli strati globulari, a fascio e reticolari. Le cellule contengono più lipidi e lo strato midollare è costituito principalmente da cellule di feocromocitoma e una piccola quantità di tessuto fibroso. Come mostrato nella Figura 4, abbiamo scoperto che tutto era normale nel gruppo BC, mentre nel gruppo MC la corteccia surrenale presentava iperplasia evidente, atrofia cellulare e densità crescente. La striscia bulbosa si è ispessita e la zona fascicolare traslucida, la zona reticolare stretta e le cellule più piccole hanno mostrato colorazione irregolare e congestione capillare. Nel gruppo PC, erano visibili i confini corticali e midollari. Le cellule delle bande globulari e del fascio erano disposte in modo uniforme e la struttura morfologica era stata ripristinata. Lo stesso migliore ripristino è stato osservato nei gruppi WCD e gli effetti nel gruppo WCD-MD sono stati migliori di quelli dei gruppi WCD-HD e WCD-LD. La morfologia della ghiandola surrenale nei gruppi CD non era buona come quella dei gruppi WCD.

Immunoistochimica: l'apoptosi neuronale è controllata da molti geni apoptotici e antiapoptotici, principalmente il gene promotore dell'apoptosi Bax e i geni anti-apoptotici della famiglia di geni Bcl-2. Bcl-2 è localizzato negli organelli reattivi che producono ossigeno come i mitocondri, il reticolo endoplasmatico e le membrane nucleari. Bcl-2 ha un impatto limitato sui radicali liberi dell'ossigeno ma può prevenire il danno ossidativo nelle cellule. Bax trasporta dal citoplasma alla membrana mitocondriale, modifica la struttura della membrana mitocondriale e promuove il rilascio del citocromo c e l'induzione dell'apoptosi.

C'era un'espressione nel citoplasma surrenale della proteina Bax e Bcl{{0}}. La colorazione /e ha mostrato tutte le particelle gialle. Rispetto a quella del gruppo BC, la densità ottica media della proteina Bax nel gruppo MC è aumentata in modo significativo (P <{5}}.01). rispetto="" a="" quella="" del="" gruppo="" mc,="" la="" densità="" ottica="" media="" nei="" gruppi="" cd-ld="" e="" wcd-ld="" è="" diminuita="" significativamente="" (p=""><0,01) (figura="" 5="">I risultati hanno dimostrato che CD e WCD potrebbero indurre l'apoptosi nelle cellule infiammatorie e ridurre il danno surrenale promuovendo l'espressione della proteina FasL e legandosi alla proteina Fas, attivando la proteina caspasi{0}} e innescando una cascata di caspasi. L'effetto del gruppo WCD-HD è stato il migliore.

Determinazione della funzione immunitaria

Indice degli organi immunitari

Rispetto a quelli del gruppo BC, il coefficiente del timo e l'indice della milza del gruppo MC sono diminuiti significativamente (P < {{0}}.01).="" rispetto="" al="" gruppo="" mc,="" il="" gruppo="" wcd-md="" presentava="" la="" differenza="" maggiore="" (p=""><0,05). il="" coefficiente="" del="" timo="" era="" quasi="" tornato="" al="" livello="" normale.="" per="" l'indice="" della="" milza,="" i="" gruppi="" wcd="" md,="" wcd-ld="" e="" cd-md="" hanno="" mostrato="" differenze="" significative="" rispetto="" a="" quello="" del="" gruppo="" mc="" (p=""><0,01) (vedi="" figura="" 6).="" pertanto,="" il="" trattamento="" con="" wcd="" e="" cd="" potrebbe="" proteggere="" gli="" organi="" immunitari="" e="" gli="" effetti="" del="" wcd="" erano="">

Rilevazione di sottoinsiemi di linfociti T nel sangue periferico

La percentuale di cellule CD4 più nel quadrante in alto a sinistra e di cellule CD8 più nel quadrante in basso a destra nel BC e ciascun gruppo di farmaci era superiore a quella nel gruppo MC. Rispetto a quello del gruppo BC, il rapporto tra CD4 più /CD8 più è diminuito significativamente nel gruppo MC (P < 0.01).="" rispetto="" a="" quello="" del="" gruppo="" mc,="" il="" rapporto="" di="" cd4="" più="" d8="" più="" è="" aumentato="" significativamente="" nel="" gruppo="" pc,="" nel="" gruppo="" wcd="" e="" nel="" gruppo="" cd-hd="" (p=""><0,01) (figura="" 7).="" determinazione="" del="" livello="" di="" il{="" {12}},="" il-6,="" il-2,="" tnf-="" e="" ifn-c="" nel="">

La Figura 8 mostra che rispetto a quello del gruppo BC, il livello di IL-6, TNF- e IFN-c è aumentato significativamente (P <{4}}.01). livello="" di="" il-10="" e="" il{7}}="" è="" diminuito="" nel="" gruppo="" mc.="" rispetto="" a="" quello="" del="" gruppo="" mc,="" il="" livello="" di="" il-6,="" tnf-="" e="" ifn-c="" è="" diminuito="" e="" il="" livello="" di="" il-10="" e="" il-2="" è="" aumentato="" nel="" siero="" in="" ciascuno="" dei="" gruppi="" di="" farmaci.="" l'effetto="" del="" wcd="" era="" migliore="" dell'effetto="" del="" cd,="" specialmente="" nel="" gruppo="" wcd-md,="" in="" cui="" l'effetto="" era="" vicino="" a="" quello="" del="" gruppo="">

Risultati dell'esperimento di osservazione al microscopio del tessuto del timo

La Figura 9 mostra che nel gruppo BC era presente un gran numero di linfociti. Linfociti e reticolociti erano disposti in modo lasco al centro con timociti rotondi o ovali sparsi. /non c'era necrosi, nessuna infiltrazione di cellule infiammatorie e nessun cambiamento anormale.

Il gruppo MC ha mostrato una grande quantità di tessuto di necrosi linfoide, con una disposizione disordinata di linfociti e reticolociti al centro. I timociti rotondi o ovali sono scomparsi, è stata evidente una massiccia degenerazione o necrosi cellulare e si è verificata un'infiltrazione di cellule infiammatorie con alterazioni patologiche anormali.

Nei gruppi CD, le caratteristiche morfologiche dei linfociti erano tornate alla normalità e la disposizione dei linfociti centrali e dei reticolociti era quasi normale. I timociti rotondi o ovali si erano ripresi, ma era rimasto un piccolo numero di linfociti degenerativi o necrotici e di cellule infiammatorie infiltranti.

Nei gruppi WCD e nel gruppo PC, le caratteristiche morfologiche dei linfociti sono state meglio riparate. /e linfociti e reticolociti al centro erano ben allineati, i timociti rotondi o ovali erano quasi normali, ma rimaneva un piccolo numero di linfociti infiltranti e degenerativi.

Espressione genica della proteina CaM

Il valore RQ (CaM mRNA/ -actin mRNA) è stato considerato per esaminare l'espressione di CaM mRNA. L'RQ del gruppo BC era 1. L'espressione dell'mRNA di CaM nell'ipotalamo nel gruppo MC è aumentata significativamente (P <0.01), mentre="" il="" valore="" è="" diminuito="" nel="" wcd-hd,="" gruppi="" wcd-md,="" wcd="" ld="" e="" cd-hd="" (p="">< {{10}}.05)="" (figura="" 10).="" l'espressione="" di="" cam="" mrna="" nell'ipofisi="" nel="" gruppo="" mc="" era="" inferiore="" a="" quella="" nel="" gruppo="" bc="" (p=""><0,01). l'espressione="" nei="" gruppi="" wcd-hd,="" wcd-md,="" wcd-ld,="" cd-hd="" e="" cd-ld="" è="" aumentata="" (p=""><0,05) e="" l'effetto="" nei="" gruppi="" wcd="" era="" migliore="" dell'effetto="" nei="" gruppi="">

Discussione

La farmacopea cinese [2] registra che CD e WCD possono essere utilizzati in clinica come i principali tipi di decotto. Dopo essere stato cotto a vapore con vino di riso, gli effetti antietà e tonificante del rene-yang sono stati potenziati. Attraverso UPLC-QqQ-MS, abbiamo rilevato i cambiamenti quantitativi nella base del materiale chimico durante il processo di cottura a vapore del vino di riso. I glicosidi iridoidi erano instabili e il contenuto di questi glicosidi è diminuito, diventando persino non rilevabile. Anche il contenuto di glicosidi del feniletanolo è cambiato, il che potrebbe indurre cambiamenti nella farmacodinamica e nell'effetto clinico.

Il classico modello di deficienza renale-yang è stato replicato mediante iniezione sottocutanea di corticosterone [19]. Un sovradosaggio di corticosterone potrebbe inibire il segreto del CRH nell'ipotalamo. Nel frattempo, anche il segreto dell'ACTH è stato inibito. /e livello di ormone della corteccia surrenale è diminuito e, quindi, la funzione dell'asse HPA è stata ridotta. L'ipofunzione dell'asse HPA è una caratteristica comune del deficit rene-yang [20]. Quindi i ratti mostrano fenomeni di "esaurimento" ei sintomi sono in accordo con quelli della carenza di rene-yang nella clinica.

Nel gruppo MC, il livello di CRH, ACTH, T e CORT nel siero di ratto è diminuito significativamente (P <{0}}.01). dopo="" essere="" stati="" trattati="" con="" cd="" e="" wcd,="" il="" contenuto="" di="" crh,="" acth,="" t,="" cort="" e="" cortisolo="" è="" aumentato="" in="" una="" certa="" misura="" e="" l'effetto="" di="" wcd-md="" è="" stato="" il="" migliore,="" quasi="" uguale="" a="" quello="" del="" gruppo="" pc.="" questi="" risultati="" hanno="" indicato="" che="" l'equilibrio="" ormonale="" relativo="" nell'asse="" hpa="" era="" stato="" distrutto="" nel="" gruppo="" mc,="" cd="" e="" wcd="" potrebbero="" migliorare="" il="" recupero="" funzionale="" dei="" livelli="" ormonali="" anormali="" dell'asse="" surrenale,="" ma="" l'effetto="" del="" wcd="" era="">

La modulazione della proporzione dei membri della famiglia Bcl{{0}} è uno dei meccanismi principali con cui Fas/FasL media la via del recettore della morte e la famiglia Bcl-2 regola la via mitocondriale [21]. Il fattore che inibisce l'apoptosi Bcl-2 e i fattori che inducono l'apoptosi, come Bax, appartengono tutti alla famiglia Bcl-2 [22]. L'apoptosi cellulare può essere determinata dal rapporto relativo tra fattori che inibiscono l'apoptosi e fattori che inducono l'apoptosi [23]. I mitocondri avevano la funzione di checkpoint centrali per molte forme di apoptosi [24]. Il presente studio ha dimostrato che CD-MD e WCD potrebbero dedurre l'espressione di Bax e aumentare Bcl-2 per migliorare la carenza di rene-yang. Fas è il principale recettore di morte che induce l'apoptosi mediante legatura con il ligando Fas (FasL) [25]. L'espressione di Fas e FasL nel gruppo MC è aumentata, mentre questa espressione è aumentata significativamente nel gruppo WCD-MD (P <{27}}.01) rispetto="" al="" gruppo="" mc.="" entrambi="" i="" sistemi="" fas/fasl="" e="" bax/bcl-2="" trasducono="" i="" segnali="" apoptotici="" nella="" famiglia="" delle="" caspasi="" [26].="" la="" caspasi-3="" è="" una="" delle="" proteinasi="" fondamentali="" che="" avviano="" l'apoptosi="" cellulare.="" l'attivazione="" della="" caspasi-3="" indica="" che="" l'apoptosi="" entra="" in="" uno="" stadio="" irreversibile="" [27].="" l'espressione="" della="" caspasi-3="" nel="" gruppo="" mc="" è="" aumentata="" e="" aumentata="" in="" modo="" significativo="" nei="" gruppi="" wcd-hd="" e="" wcd-md="" (p=""><>

Carenza diFunzione immunitariaè una delle manifestazioni importanti della carenza di rene-yang [28]. In questo studio, abbiamo riscontrato che l'indice della milza e del timo del gruppo WCD-MD si è ripreso in modo significativo (P < 0.01,="" p="">< 0.{{3{="" {32}}}}5).="" la="" risposta="" immunitaria="" del="" sistema="" immunitario="" è="" regolata="" principalmente="" dai="" sottogruppi="" [29].="" il-2="" è="" il="" fattore="" di="" crescita="" dei="" linfociti="" t,="" secreti="" dai="" linfociti="" t="" e="" dai="" macrofagi,="" partecipa="" alla="" regolazione="" infiammatoria,="" regola="" l'immunità="" e="" aumenta="" la="" resistenza="" alle="" infezioni="" [30].="" livello="" di="" il-2="" nel="" gruppo="" mc="" è="" diminuito="" (p="">< 0,01)="" e="" dopo="" il="" trattamento="" con="" cd="" e="" wcd,="" il="" livello="" di="" il-2="" è="" guarito.="" il-6="" e="" tnf-="" sono="" citochine="" proinfiammatorie.="" livelli="" aumentati="" di="" citochine="" il-6="" e="" tnf="" causano="" squilibri="" delle="" citochine="" e="" aggravano="" l'infiammazione.="" livelli="" di="" il-6="" e="" tnf-="" sono="" aumentati="" nel="" gruppo="" mc,="" mentre="" dopo="" il="" trattamento="" i="" livelli="" di="" il-6="" e="" tnf-="" sono="" diminuiti.="" le="" cellule="" t="" sono="" divise="" in="" cellule="" cd4="" e="" cellule="" cd8="" e="" il="" rapporto="" cd4="" più="" cd8="" più="" può="" essere="" utilizzato="" come="" un="" importante="" indice="" di="" regolazione="" immunitaria="" [31].="" cd4="" plus="" d8="" plus="" nel="" gruppo="" mc="" ovviamente="" è="" diminuito="" (p=""><0,01), mentre="" nei="" gruppi="" wcd="" e="" cd="" hd="" è="" aumentato="" (p=""><>

L'asse HPA è il sistema di regolazione più importante perché regola la secrezione di glucocorticoidi e il sistema endocrino per mantenere la funzione secretoria della corteccia surrenale [32]. La sovraespressione dell'mRNA di CaM nel tessuto dell'ipotalamo era correlata alla carenza di yang renale. CD e WCD potrebbero bloccare i canali del calcio, inibire l'espressione dell'mRNA di CaM nell'ipotalamo e diminuire l'afflusso di calcio, diminuendo così l'attività del complesso Ca2 più ·CaM.

La formazione della carenza di rene-yang ha un processo di sviluppo della malattia cronica. Il rene non è più un concetto puramente anatomico, ed è un termine generico per l'immunità neuroendocrino e il sistema genito-urinario. La rete neuroendocrino-immune (NEI) è un importante sistema di regolazione integrato [33]. CD e WCD possono regolare la funzione dell'asse HPAT e migliorare il recupero della carenza di rene-yang. /questo risultato fornisce la base sperimentale per la prevenzione clinica e il trattamento del deficit renale-yang.

Riferimenti

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