Studio sull'effetto dell'acteoside (un ingrediente attivo nella cistanche deserticola) sul NAFLD inducendo l'autofagia
Feb 24, 2025
Astratto:
Obiettivo:Per esplorare la funzione che induce l'autofagia dell'acteoside di ingredienti attivi (ACT) nella cistanche deserticola e il suo effetto sulla malattia epatica grassa non alcolica (NAFLD).
MetodiPer prendere l'echinacoside e agire come oggetti di ricerca, 1 0 0 μmol/L ACT e Echinacoside (ECH) sono stati combinati con la bleomicina di inibitore autofagico-lisosoma A1 per il trattamento di intervento. L'immunoblotting della proteina è stata utilizzata per rilevare il livello di espressione relativa del marcatore autofagico marcatore di microtubulo associato alla proteina 1 catena leggera 3 (LC 3- II). Le cellule HEPG2 sono state intervenute con diverse concentrazioni di ACT in vitro e la vitalità cellulare è stata rilevata usando il metodo del sale di tetrazolio. L'intervento in vitro delle cellule HepG2 con diverse concentrazioni di ACT combinate con la balofloxacina A1 e il rilevamento di livelli di espressione della proteina LC {{9 {9}}} ii usando la tecnologia immunoblottica della proteina. Un modello NAFLD costruito in vitro con intervento farmacologico è stato usato per colorare le goccioline lipidiche usando il metodo di colorazione O olio rosso e rilevare i livelli di trigliceridi intracellulari. Osservare la localizzazione di proteine LC3 e goccioline lipidiche attraverso la tecnologia di immunofluorescenza. I risultati della legge possono indurre significativamente l'autofagia nelle cellule Hepg2 e il livello di espressione della proteina LC 3-} II è significativamente aumentato rispetto al gruppo di controllo (trattato con ACT da solo) (1.36 ± 0. 11, 0. 28 ± 0. {{3 {32}} rispettivamente), con significato statistico (p0.05). 50 μmol/L agiscono in modo significativamente indotto l'autofagia nelle cellule HepG2 e il livello di espressione della proteina LC 3-} II è stato significativamente aumentato (rispettivamente 1,83 ± 0,53, 0,35 ± 0,18). Il livello TG delle cellule HEPG2 nel gruppo di intervento ACT (19,11 ± 1,68) era significativamente inferiore a quello nel gruppo modello di cellule NAFLD in vitro (34,15 ± 1,90) e le differenze erano statisticamente significative (P<0.05). The number of positive lipid droplets in HepG2 cells in the ACT intervention group decreased significantly, and the number of autophagosomes inside the cells increased significantly, showing clear co localization with lipid droplets in space. Conclusion Cistanche deserticola ACT has significant autophagy induction ability, and it may have potential preventive and therapeutic effects on NAFLD.
Parole chiave:Malattia epatica grassa non alcolica;Cistanche deserticola;Acteoside; Autofagia
TCM Herb Cistanche per il trattamento della malattia epatica grassa non alcolica (NAFLD)
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Negli ultimi decenni, grasso analcolicomalattia epatica(NAFLD) è diventato il più comuneMalattia epatica cronica, con una prevalenza globale di circa il 25% della popolazione adulta ed è considerata strettamente correlata alla sindrome metabolica [1]. Sebbene la probabilità di complicanze legate al fegato nei pazienti NAFLD sia inferiore al 10%, NAFLD è un fattore di rischio per malattie legate al fegato come la cirrosi e il carcinoma epatico primario, che impone un enorme onere economico per i pazienti [2-5]. Nonostante la crescente attenzione prestata a NAFLD, NAFLD come importante malattia cronica non ha ricevuto sufficiente attenzione. Pertanto, un'ulteriore comprensione approfondita della patogenesi del NAFLD e la ricerca di strategie di trattamento efficaci sono diventate problemi urgenti da risolvere [6-7].
Studi recenti hanno dimostrato che l'autofagia cellulare svolge un ruolo importante nella fisiologia e nella patologia del fegato [8]. La disfunzione o la disregolazione dell'autofagia sono associate a una varietà di malattie epatiche comeMalattia epatica correlata all'alcol[9], NAFLD [10], steatoepatite non alcolica [11] e carcinoma epatocellulare [12]. Le caratteristiche patologiche del NAFLD sono una deposizione eccessiva di trigliceridi (TG) e altre goccioline lipidiche neutre (LD) negli epatociti sotto stimolazione non alcolica. Per il fegato, i due percorsi principali che regolano il catabolismo di questi LD sono lipolisi e autofagia.
La via di lipolisi è regolata da lipasi neutre citoplasmatiche, come la lipasi sensibile agli ormoni e la lipasi TG adiposa. Nella corrispondente percorso lipoautofagico, LDS può essere assunto selettivamente reclutando direttamente le proteine correlate all'autofagia per formare autofagosomi, e quindi gli LD incapsulati dagli autofagosomi vengono ulteriormente erogati ai lisosomi e decomposti dalla lipasi acida nei lisosomi. Pertanto, l'attivazione di lipoautofagia negli epatociti è diventata una strategia efficace per la prevenzione e il trattamento del NAFLD.
La cistanche deserticola è una preziosa medicina di erbe cinesi che è stata ampiamente utilizzata nella pratica clinica nelle formule tradizionali di medicina cinese. Allo stesso tempo, è stato a lungo utilizzato come integratore di alimenti naturali. La cistanche deserticola contiene una varietà di ingredienti bioattivi, il più importante dei quali è la cistanche deserticola feniletanolo glicosidi. Come rappresentanti di glicosidi feniletanoidi, l'echinacoside (ECH) e la verbastro (ACT) sono stati segnalati per avere molte importanti attività biologiche, come la protezione antiossidante, neuroprotettiva, immunomodulatoria e epatica [13]. In termini di protezione epatica, gli studi hanno scoperto che ECH può proteggere il fegato riducendo i mediatori infiammatori, inibendo la trasformazione del fattore di crescita e riducendo il livello di espressione dei geni correlati alla fibrosi epatica. La legge ha un significativo effetto protettivo sul danno epatico indotto da chimico e farmaco, come alcol, tetracloruro di carbonio e lipopolisaccaride. ACT riduce lo stress ossidativo causato da sostanze chimiche tossiche, rimuove l'ossigeno reattivo accumulato nel fegato e riduce la concentrazione di malondialdeide. Allo stesso tempo, aumenta significativamente l'attività del superossido di superossido epatico e una riduzione del contenuto di glutatione e migliora significativamente il danno istopatologico epatico e l'apoptosi. Tuttavia, non esiste un rapporto di letteratura rilevante sul fatto che i glicosidi feniletanoidi della cistanche deserticola siano coinvolti nel processo di autofagia nell'esercizio della protezione epatica. Sulla base di questo, questo studio ha utilizzato metodi di biologia cellulare convenzionale e un modello di cellule in vitro per esplorare preliminariamente l'effetto che induce l'autofagia dei glicosidi feniletanoidi deserticola cistanche per lo sviluppo scientifico per lo sviluppo di farmaci futuri.
1 Materiali e metodi
1.1 Materiali
1.1.1 Le materie di ricerca ECH e ACT sono state utilizzate come materie di ricerca.
1.1.2 Materiali Le cellule HepG2 sono state acquistate da Wuhan Punosai Life Science Co., Ltd., ECH (numero batch: B21209) e ACT (numero batch: B20715, purezza HPLC maggiore o uguale al 98%) acquistati da Shanghai Yuanye Biological Company, DMEM High GLUCOSE Medium (Batch Numero: SH30243.01). were purchased from HyClone Company, USA, fetal bovine serum (batch number: 04-002-1A) was purchased from BI Company, Israel, penicillin/streptomycin (batch number: SV30010.01) was purchased from Hyclone Company, USA, MTT (batch number: M8180) powder was purchased from Solebao Company, Beijing, China, TG (batch Numero: BC0625) Il kit di rilevamento è stato acquistato da Solebao Company, Pechino, Cina, Oil Red O (numero di lotto: O 0625-100 g), dimetilsolfossido (numero di lotto: BCBZ1685) sono stati acquistati da Sigma-Aldrich, USA; L'inibitore autofagico-lisosoma Bafilomicina A1 (BAFA1, numero di lotto: TLRL-BAF1) è stato acquistato da Invitrogen, USA; L'attivatore autofagico Rapamicina (numero di lotto: S17098) è stato acquistato da Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd., Cina; Proteina 1 associata al microtubulo 1 catena leggera 3 (LC3, numero di lotto: l7543, specie: coniglio, rapporto diluizione: 1: 1 000) e -actina (numero di lotto: ZRB1312, specie: coniglio, rapporto diluizione: 1: 5 000) Gli antibodie sono stati acquistati da Sigma-Alcrich, USA; Anticorpo secondario marcato con perossidasi di rafano (numero di lotto: 4010-05, Specie: anti-rabbit di capra, rapporto di diluizione: 1: 1 000) è stato acquistato da Southern Biotech, Alexa Company, Alexa FluoRed Fluorescente Anticorpo secondario (Numero di lotto: 43328, Waveling Raiugh: 1: 1000). Sigma-Aldrich Company, USA e BODIPY 493/501 (numero di lotto: D3922) è stato acquistato da Invitrogen Company, USA.
1.2 Metodi
1.2.1 coltura cellulare
Le cellule HEPG2 sono state coltivate nel mezzo di glucosio ad alto contenuto di aquila di Dulbecco contenente siero bovino fetale al 10%, 100 U/mL di penicillina e 100 ug/ml di streptomicina in un incubatrice di biossido di carbonio da 37 gradi, 5%. Quando la confluenza cellulare ha raggiunto l'85%, sono stati eseguiti sottoculture, placcatura, intervento e altre operazioni.
1.2.2 Rilevazione dell'immunoblotting proteico
1.2.2.1 Atto e trattamento ECH
LC 3- ⅱ Il livello di espressione della proteina nelle cellule HepG2 BAFA1, come inibitore della pompa protonica, può causare la proteina LC 3- ⅱ da aggregare in grandi quantità nelle cellule, amplificando così l'abilità di induzione dell'autofagia. Pertanto, l'uso combinato di BAFA1 può essere utilizzato come sistema di monitoraggio dell'autofagia per valutare la capacità di induzione dell'autofagia. Le cellule HEPG2 nella fase di crescita logaritmica sono state trasferite a piatti di coltura cellulare da 3,5 cm per la coltura durante la notte. 100 μmol/L ACT, ECH e BAFA1 sono stati usati per l'intervento per 12 ore. Le cellule sono state lavate con una soluzione tampone fosfato pre-raffreddata (PBS) e immediatamente lisate nel tampone di lisi della proteina RIPA per 10 minuti. Il surnatante è stato centrifugato e la concentrazione totale di proteine è stata determinata usando un kit di test di concentrazione di proteina di acido bicinchoninico. Dopo la quantificazione con tampone dodecil solfato di sodio, il campione è stato riscaldato a 95 gradi per 10 minuti per denigrare la proteina. Quindi sono stati prelevati 30 ml del campione con una micropipetta ed elettroforizzato su un gel di poliacrilammide.
Dopo l'elettroforesi, la proteina è stata trasferita dal gel a una membrana di nitrocellulosa, bloccata con 1 0% latte durante la notte, incubata con un anticorpo primario specifico a temperatura ambiente per 1 ora, lavato con tampone fosfato contenente Triton allo 0,5% e incubato con un anticorpo specifico a temperatura ambiente per 1 h. Il metodo ECL è stato utilizzato per lo sviluppo del colore. Sono stati impostati come Blank Control Group, Rapamycin Group, Ech Group, ACT Group, Rapamycin+BAFA1 Group, Ech+BAFA1 Group e ACT+BAFA1 Group.
1.2.2.2 Concentrazioni diverse di ACT hanno intervenuto il livello di espressione della proteina LC 3- ⅱ nelle cellule HepG2
Le cellule HEPG2 di fase di crescita logaritmica sono state trasferite a piatti di coltura cellulare da 3,5 cm per la coltura durante la notte e ACT 25, 50 e 100 μmol/L sono stati usati con BAFA1 per il trattamento di intervento per 12 ore e il livello di espressione di LC 3- ⅱ è stato rilevato immunoblotting per proteina. Il gruppo di controllo (gruppo Con, il controllo in bianco), il gruppo di fame (gruppo STA, il trattamento di fame HEPG2), il gruppo ACT 25, 50 e 100 μmol/L e BAFA1 combinati con gruppo ACT 25, 50 e 100 μmol/L sono stati impostati.
1.2.3 Metodo MTT per rilevare il tasso di sopravvivenza delle cellule HepG2 trattate con diverse concentrazioni di ACT per 24 e 48 h
Le cellule HEPG2 nella fase di crescita logaritmica sono state inoculate in una piastra di pozzi 96- con una densità di inoculazione moderata e coltivate in un incubatore per 12 ore. 2 0, 40, 60, 80 e 100 μmol/L ACT per 24 e 48 h. La soluzione MTT 0,5 mg/ml è stata aggiunta in un ambiente scuro e incubata in un incubatore. Dopo 4 ore, il surnatante è stato scartato, sono stati aggiunti 100 μL di dimetilsolfossido a ciascun pozzetto e le cellule sono state scosse a uno shaker a temperatura costante a 37 gradi per 10 minuti. Il valore della densità ottica (OD) a una lunghezza d'onda di 490 nm è stato rilevato da un marcatore enzimatico ed è stato calcolato il tasso di sopravvivenza cellulare.
1.2.4 Costruzione in vitro del modello cellulare NAFLD
Un certo peso di acido palmitico (PA) è stato pesato e completamente sciolto in un certo volume di isopropanolo per preparare una soluzione madre da 100 mmol/L Pa, che è stata quindi divisa e conservata in un frigorifero -20 per un uso successivo. La soluzione madre PA è stata diluita a 100 μmol/L usando un terreno di coltura completo ed è stata aggiunta l'albumina sierica bovina senza acidi grassi. Le cellule sono state incubate a 37 gradi per 3 ore per preparare la soluzione di induzione. Le cellule HepG2 nella fase di crescita logaritmica sono state trasferite in un piatto di coltura cellulare da 3,5 cm a una densità adeguata per la coltura durante la notte, quindi la soluzione di induzione preparata è stata utilizzata per l'intervento.
1.2.5 Intervento ACT NAFLD Modello di cellule in vitro TG Rilevamento e colorazione Oil Red O
1.2.5.1 Rilevamento TG
Le cellule HepG2 nella fase di crescita logaritmica sono state trasferite in un piatto di coltura cellulare da 3,5 cm per coltura secondo il gruppo di controllo in bianco, il gruppo di modelli e il gruppo di intervento ACT. Il gruppo modello è stato indotto con una soluzione di induzione di 100 μmol/L Pa e il gruppo di intervento ACT è stato indotto con una soluzione di induzione di 100 μmol/L Pa e 50 μmol/L ACT è stato aggiunto contemporaneamente. Il tempo di intervento era di 24 ore. Gently remove the old culture medium, slowly wash the cell surface with pre-cooled PBS once, add 100 μL/dish of pre-cooled RIPA lysis solution, fully lyse on ice for 15 min, centrifuge at 4 degree and 12 000 r/min for 10 min, collect the supernatant, take 10 μL for enzymatic detection of TG level, take another 10 μL for protein content detection, detect TG according to the Istruzioni del kit TG e infine correggere il livello TG per mg di proteina.
1.2.5.2 Olio rosso O colorazione
Le cellule HEPG2 nella fase di crescita logaritmica sono state trasferite in un piatto di coltura di 3,5 cm coperto con una versamento sterile per la coltura durante la notte. 100 μmol/L Pa ha indotto le cellule per formare goccioline lipidiche. Allo stesso tempo, sono stati aggiunti 50 μmol/L ACT per l'intervento per 24 ore.
I vetrini cellulari sono stati raccolti, lavati 3 volte con PBS pre-raffreddato, fissati con formaldeide a 4% a temperatura ambiente per 10 minuti, lavati la superficie cellulare con PBS, aggiunto la soluzione di lavoro di colorazione Oil Oil Red Oil Red Oil, macchiata a temperatura ambiente al buio per 15 minuti, aspirato la soluzione di colorazione in rosso olio, lavato con la soluzione di guarnizione in doppia guarnizione, con una doppia acqua di guarnizione. e fotografato al microscopio.
1.2.6 Osservazione dell'immunofluorescenza di autofagosomi e goccioline lipidiche dopo il trattamento ACT
Le cellule HEPG2 nella fase di crescita logaritmica sono state trasferite in un piatto di coltura di 3,5 cm coperto con una versamento sterile per la coltura durante la notte. 1 0 0 μmol/L Pa è stato usato per indurre la formazione di goccioline lipidiche nelle cellule. Allo stesso tempo, la legge è stata aggiunta per il trattamento di intervento per 24 ore. Le vetrini cellulari sono state raccolte, lavate 3 volte con PBS pre-raffreddato, fissati a temperatura ambiente per 10 minuti con formaldeide al 4%, permeabilizzato a temperatura ambiente per 15 minuti con un tampone di permeabilizzazione contenente lo 0,1% di saponina, bloccato a temperatura ambiente per 1 ora con siero di capra, incubato a temperatura ambiente per 1 ora con lc 3- Un anticorpo secondario con etichetta fluorescente specifica, incubata a temperatura ambiente e lontano dalla luce per 1 ora. Dopo l'incubazione dell'anticorpo, le vetrini sono state lavate 3 volte con PBS, controcolorate con sonda con goccia lipidica Bodypy 493/503 a temperatura ambiente per 10 minuti, lavati con PBS e sigillati con mezzo di sigillatura anti-fallo, essiccato all'aria al buio, osservato con un microscopio confocale laser e registrato. Sono stati impostati il gruppo di controllo in bianco, il gruppo di trattamento rapamicina e il gruppo di intervento ACT.
1.3 Analisi statistica
SPSS25. 0 Il software statistico è stato utilizzato per l'analisi dei dati. I dati quantitativi sono stati espressi come x ± s. Sono state utilizzate analisi a senso unico della varianza e del test LSD-T. P<0.05 was considered statistically significant.
