Clonazione genica, identificazione funzionale, analisi strutturale e di espressione della saccarosio sintasi della Cistanche Tubulosa Ⅲ

4 Analisi dell'espressione di CtSus in diverse parti di Cistanche tubulosa e sistema di coltura cellulare sotto stress da siccità

4.1 Analisi dell'espressione di CtSus in diverse parti di Cistanche tubulosa

In vitro, esperimenti di trasformazione di cellule intere e esperimenti di reazione catalitica enzimatica hanno confermato che la proteina codificata dal gene CtSus può catalizzare la sintesi del glucosio UDP. Per esplorare ulteriormente la correlazione tra questo gene e la biosintesi dei composti glicosidici nella Cistanche tubulosa, è stato analizzato il livello di espressione di questo gene in diverse parti della Cistanche tubulosa.

ERBA A CISTANCHE DI ALTA QUALITÀ CON 10-98% ECHINACOSIDE

Echinacoside is the most representative glycoside compound in Cistanche tubulosa, and its content can reach more than 30% of the dry weight of Cistanche tubulosa plants [23]. The research group previously measured the content of echinacoside in different parts of Cistanche tubulosa plants. Specifically, the content of echinacoside in different tissues is as follows: haustoria>underground part>>parte aerea; tra questi, il contenuto di echinacoside nell'haustoria è il più alto.

La PCR quantitativa a fluorescenza in tempo reale è stata eseguita utilizzando cDNA proveniente da diverse parti di Cistanche tubulosa come modelli e i risultati sono stati analizzati con il metodo 2–ΔΔCT ed è stata eseguita l'analisi differenziale. I risultati sono mostrati nella Figura 4A. Il livello di espressione del gene CtSus negli austori era il più alto, 1,5 volte quello della parte aerea, e il livello di espressione nella parte sotterranea era significativamente più alto di quello nella parte aerea, il che è coerente con il modello di accumulo dei glicosidi feniletanoidi rappresentato dall'echinacoside in diverse parti della Cistanche tubulosa.

Figura 4 Livelli di espressione relativi di CtSus in diverse parti di C. tubulosa e cellule in sospensione trattate con PEG6000. A: Livello di espressione relativa di CtSus in diverse parti di C. tubulosa; B: Livello di espressione relativa di CtSus nelle cellule in sospensione di C. tubulosa trattate con PEG6000 in diversi momenti. n=3, 𝑥̅± s.*P ＜ 0,05,***P ＜ 0,001

4.2 Analisi dell'espressione di CtSus in cellule in sospensione di Cistanche deserticola in condizioni di stress da siccità

La ricerca preliminare sul progetto ha dimostrato che lo stress da siccità indotto dal PEG6000 può aumentare significativamente l'accumulo di glicosidi del feniletanolo nelle cellule in sospensione di Cistanche deserticola. Da 3 a 9 giorni dopo l’induzione, il contenuto di echinaceaside è aumentato significativamente. Dal 12° al 15° giorno, il tasso di crescita del contenuto di echinacoside è rallentato e ha raggiunto il valore massimo il 15° giorno. Poi, con l’aumentare del tempo di coltura, il contenuto di echinacoside è aumentato in modo significativo. Il contenuto di fruttoside è gradualmente diminuito [24]. Sulla base di questa ricerca, questo articolo ha utilizzato il cDNA di cellule in sospensione di Cistanche deserticola non trattate e cellule in sospensione di Cistanche deserticola indotte da PEG6000-come modelli per condurre un rilevamento quantitativo tramite PCR con fluorescenza in tempo reale per esaminare il gene CtSus in cellule in sospensione di Cistanche deserticola sotto condizioni di stress da siccità. Cambiamenti nei livelli di espressione. I risultati sono mostrati nella Figura 4B. Nelle cellule in sospensione di Cistanche deserticola indotte con PEG6000, l'espressione di CtSus è aumentata significativamente il 6° giorno dopo l'induzione, ha raggiunto il valore più alto il 9° giorno, per poi tornare allo stesso livello del controllo. Gruppi dello stesso livello. I risultati di cui sopra mostrano che lo stress da siccità può aumentare significativamente l’espressione del gene CtSus nella linea cellulare in sospensione di Cistanche deserticola, che è coerente con il modello di accumulo dell’echinaceaside in condizioni di stress da siccità. Tuttavia, il picco di espressione del gene CtSus appare prima del picco del contenuto di echinaceaside, poiché il donatore di glicosile attivo sintetizzato dalla catalisi di CtSus è un importante precursore richiesto per la reazione di glicosilazione in più fasi nella successiva via biosintetica dell'echinaceaside. , si ipotizza che dopo essere stati sottoposti a stress da siccità, gli organismi mobiliteranno preferenzialmente i geni legati al metabolismo primario per ottenere l'accumulo di donatori attivi, e quindi raggiungere un importante accumulo di prodotti metabolici nel metabolismo secondario.

5 Studio sulla struttura tridimensionale della proteina CtSus e analisi dei principali siti attivi

Sulla base della funzione di CtSus nel catalizzare la produzione del donatore di glicosil UDP-glucosio, è stata ulteriormente studiata la base strutturale dell'attività catalitica di CtSus. Lo strumento online SOPMA è stato utilizzato per prevedere la struttura secondaria della proteina. I risultati hanno mostrato che la struttura secondaria di CtSus conteneva il 55,28% di eliche, il 25,47% di bobine casuali, il 12,80% di filamenti estesi e il 6,46% di spire (Figura 5A), indicando che le eliche sono le unità strutturali secondarie più importanti nella proteina CtSus, seguiti da bobine casuali, che rappresentano anche una grande percentuale della proteina. Fili e spire estesi sono distribuiti in tutta la proteina. Secondo gli studi esistenti, la saccarosio sintasi esiste solitamente sotto forma di tetramero, che è considerata la sua forma attiva. Pertanto, questo documento ha utilizzato ulteriormente AlphaFold2 per prevedere la struttura della proteina CtSus e ha ottenuto la sua struttura tridimensionale dei tetrameri proteici. Il confronto del database PDB (Protein Data Bank) ha rilevato che la somiglianza di sequenza tra Arabidopsis thaliana saccarosio sintasi AtSus1 (PDBID 3S28) e CtSus può raggiungere il 77,93%. La struttura CtSus prevista è stata confrontata con la struttura tridimensionale AtSus1 e il valore di deviazione quadrata media (RMSD) dopo la sovrapposizione proteica era 1,11 Å, indicando che le strutture spaziali dei due sono altamente coerenti (Figura 5B).

Figura 5 Indagine strutturale di CtSus. A: struttura secondaria prevista di CtSus utilizzando SOPMA. Blu: elica; Viola: bobina casuale; Rosso: filo esteso; Verde: foglio. B: Allineamento della struttura tridimensionale di AtSus1 (in colore blu) e CtSus (in colore verde). Entrambi sono stati mostrati come tetramero.C: residui chiave nella tasca di legame del substrato di AtSus1 (in colore blu) e CtSus (in colore verde con residui etichettati); D: allineamento delle conformazioni leganti di UDP e fruttosio in AtSus1 (in colore blu) e CtSus (in colore verde); E: Interazioni tra UDP e CtSus mostrate nel diagramma 2D analizzato da Discovery Studio Client

La struttura del complesso cristallino proteina-ligando riportata di Arabidopsis AtSus1 con UDP e fruttosio (PDBID3S29) è stata utilizzata come modello [16] per analizzare la modalità di legame di CtSus con UDP e fruttosio. I risultati dell'aggancio molecolare sono mostrati nella Figura 5C. Si può osservare che le tasche di legame del substrato di AtSus1 e CtSus sono molto simili in termini di tipo di amminoacido, distribuzione spaziale e configurazione, e la sovrapposizione è elevata, dimostrando che la sequenza della saccarosio sintasi è altamente conservata nelle piante. Le conformazioni dei due ligandi, UDP e fruttosio, nella tasca di legame del substrato proteico, sono mostrate nella Figura 5D. La conformazione più vantaggiosa del docking molecolare di UDP e CtSus si sovrappone bene alla conformazione di UDP nel complesso cristallino AtSus1-UDP, dimostrando l'accuratezza dei risultati del docking molecolare. L'interazione tra UDP e i residui aminoacidici chiave nella tasca di legame del substrato proteico è mostrata nella Figura 5E. UDP e CtSus sono principalmente legati insieme da legami idrogeno e interazioni idrofobiche. I residui aminoacidici chiave nella tasca di legame del substrato includono Leu294, Gly301, Met576, Arg578, Lys583, Gln646, Asn652, Leu677, Thr678 e Glu681.

Discussione

La modifica della glicosilazione è uno dei mezzi importanti per migliorare le proprietà fisiche e le attività biologiche dei prodotti naturali o dei precursori di farmaci. Rispetto ai metodi chimici tradizionali, la modificazione della glicosilazione enzimatica presenta i vantaggi di condizioni di reazione blande, forte selettività e rispetto dell'ambiente. Tuttavia, la reazione di glicosilazione della glicosiltransferasi richiede una grande quantità di donatori di zucchero UDP, che sono costosi e difficili da ottenere, con il risultato che le glicosiltransferasi non possono essere ampiamente utilizzate nella produzione industriale. La saccarosio sintasi può catalizzare la reazione reversibile: saccarosio + UDP ⇌ UDP-glucosio + fruttosio e può formare un ciclo rinnovabile UDP-glucosio attraverso una reazione di accoppiamento con la glicosiltransferasi. La Cistanche tubulosa è ricca di una varietà di composti glicosidi di diversi tipi strutturali, rappresentati da composti di glicosidi feniletanolo, suggerendo che la via attiva di sintesi del donatore di glicosil nel suo corpo che coinvolge la saccarosio sintasi ha un forte metabolismo, ma la rilevante saccarosio sintasi delle piante Cistanche non ha stato segnalato. In questo studio, un gene CtSus della saccarosio sintasi è stato clonato per la prima volta da Cistanche tubulosa. La proteina codificata da questo gene contiene il dominio conservato della saccarosio sintasi vegetale. Confrontando la sequenza delle saccarosio sintasi di altre piante, si è scoperto che la somiglianza della sequenza di aminoacidi tra essa e le saccarosio sintasi delle piante dello stesso ordine era superiore al 90%, indicando un alto grado di conservazione della sequenza delle saccarosio sintasi delle piante. L'analisi dell'evoluzione molecolare ha mostrato che CtSus appartiene al ramo della saccarosio sintasi della pianta dicotiledone ed è più strettamente correlato alla saccarosio sintasi PrSus di P. ramosa della famiglia delle Orobanchaceae.

Per esplorare l'attività catalitica di CtSus, questo studio ha combinato la glicosiltransferasi UGT71BD1, la cui attività è stata precedentemente verificata dal gruppo di ricerca, per costruire un sistema di coespressione a doppio plasmide. Attraverso esperimenti catalitici su cellule intere, le condizioni sono state raggiunte senza aggiungere ulteriori donatori di zucchero UDP. Reazione di glicosilazione del composto cumarinico cannella e del composto stilbene resveratrolo. Rispetto al gruppo di controllo, l'aggiunta di CtSus ha aumentato significativamente il tasso di conversione delle reazioni di glicosilazione catalizzate da UGT71BD1-. Su questa base, questo studio ha ulteriormente costruito un plasmide di espressione ricombinante CtSus e ha ottenuto l'espressione solubile della proteina ricombinante in E. coli. In vitro, le reazioni catalitiche enzimatiche mostrano che in presenza di saccarosio e UDP, CtSus può catalizzare la generazione di UDP-glucosio e, dopo aver rimosso il tag di affinità del fattore trigger contenuto nella proteina ricombinante, il prodotto di CtSus catalizza la generazione di UDP -si ottiene il glucosio. Il tasso è stato notevolmente migliorato. La trasformazione della cellula intera e i risultati della reazione catalitica enzimatica in vitro hanno confermato l'attività di CtSus come donatore di zucchero attivo catalitico di saccarosio sintasi UDP-glucosio. Per esplorare ulteriormente la correlazione tra il gene CtSus e la biosintesi dei glicosidi nella Cistanche tuberosum, l'espressione di CtSus in diverse parti della Cistanche tuberosum è stata analizzata mediante esperimenti di PCR quantitativa a fluorescenza in tempo reale. I risultati hanno mostrato che il gene era espresso negli austori di Cistanche tuberosum. Il massimo livello di espressione. La Cistanche deserticola è una pianta parassita e non può ottenere i nutrienti necessari per la crescita e lo sviluppo attraverso la fotosintesi. Pertanto, deve essere parassitario delle radici della pianta ospite e fare affidamento su di essa per ottenere nutrienti per mantenere la crescita. Nelle piante, il saccarosio fornisce principalmente donatori di energia e fonti di carbonio [12]. Tuttavia, il saccarosio non può essere utilizzato direttamente dalle cellule e deve essere ulteriormente decomposto. L'austoria è il ponte che collega la Cistanche deserticola e la pianta ospite e svolge un ruolo fondamentale nel suo processo di crescita. cruciale

[25], quindi l'elevata espressione di saccarosio sintasi negli austori di Cistanche deserticola è ragionevole. L'elevata espressione di CtSus negli austori è anche coerente con il grande modello di accumulo di glicosidi feniletanoidi negli austori. Inoltre, attraverso l'analisi PCR quantitativa a fluorescenza dei cambiamenti nei livelli di espressione del gene CtSus nelle cellule in sospensione di Cistanche deserticola in diversi momenti sotto stress da siccità, si è scoperto che lo stress da siccità può aumentare significativamente l'espressione dei geni CtSus nella linea cellulare in sospensione, che è compatibile con l'echinaceaside. Il modello di accumulo nelle linee cellulari in sospensione sotto stress da siccità è coerente. I risultati di cui sopra suggeriscono che CtSus è coinvolto nella via biosintetica dei glicosidi feniletanoidi rappresentati dall'echinacea in Cistanche tulipis in vivo. È una delle tante vie biosintetiche. La reazione di glicosilazione della prima fase fornisce il donatore di glicosile attivo UDP-glucosio. In breve, questo studio

Lo studio ha identificato un nuovo gene della saccarosio sintasi nella Cistanche deserticola, che ha consentito la sintesi enzimatica in vitro di donatori di glicosile attivi e ha fornito nuovi elementi genetici per la costruzione di batteri ingegnerizzati per la biosintesi dei glicosidi della Cistanche deserticola.

Contributi dell'autore: Tian Weisheng è stato responsabile dell'analisi bioinformatica, dell'analisi dell'espressione, dell'analisi dell'attività enzimatica e della scrittura della prima bozza del gene CtSus; Yan Yaru era responsabile dello screening e della clonazione dei geni; Cui Xiaoxue e Huang Wenqian hanno partecipato all'analisi bioinformatica e all'analisi dell'espressione; Wang Yingxia e Zhao Saijing hanno partecipato alla costruzione del vettore e all'analisi dell'attività enzimatica; Li Jun e Shi Shepo hanno guidato principalmente l'analisi dell'attività enzimatica e l'analisi dell'espressione; Tu Pengfei e Liu Xiao erano responsabili della progettazione dell'idea del documento, della guida degli esperimenti e della scrittura e revisione del documento. Tutti gli autori hanno partecipato alla revisione del documento.

Riferimenti

[1] Canzone ZH, Lei L, Tu PF. Progressi nella ricerca sull'attività farmacologica nelle piante di CistancheHoffing. e il collegamento [J]. Chin Tradit Herb Drugs (中草药), 2003, 34: 113-115.

[2] Liu WJ, Liu Y, Canzone QQ, et al. Confronto dei chemomi tra Cistanchetubulosa coltivata e selvatica mediante spettroscopia ¹H-NMR [J]. Cina J Chin Mater Med (中国中药杂志), 2018, 43:3506-3512.

[3] Canzone Y, Zeng K, Jiang Y, et al. Cistanches Herba, da specie in via di estinzione a grande marchio della medicina cinese [J]. Med Res Rev, 2021, 41: 1539-1577.[4] Liu Y, Wang H, Yang M, et al. I polisaccaridi della Cistanche deserticola proteggono le cellule PC12 dal danno indotto da OGD/RP [J]. Biomed Pharmacother, 2018, 99: 671-680.

[5] Yin Y, Huang J, Gu X, et al. Evoluzione degli enzimi di interconversione nucleotidi-zuccheri vegetali [J].PLoS One, 2011, 6: e27995.

[6] Bar-Peled M, O'Neill MA. Formazione, interconversione e recupero dello zucchero nucleotidico vegetale mediante riciclo dello zucchero [J]. Annu Rev Plant Biol, 2011, 62: 127-155.

[7] Guo H, Li L, Wang PG. Caratterizzazione biochimica dell'UDP-GlcNAc/Glc4-epimerasi di Escherichia coli O86:B7 [J]. Biochimica, 2006, 45: 13760-13768.

[8] Dong S, Chesnokova ON, Turnbough CL Jr, et al. Identificazione dell'epimerasi UDP-N-acetilglucosamina4- coinvolta nella glicosilazione delle proteine ​​dell'esosporio nel Bacillus anthracis [J]. J Bacteriol,2009, 191: 7094-7101.

[9] Li LN, Kong JQ. Identificazione a livello del trascrittoma dei geni della saccarosio sintasi in Ornithogalumcaudatum [J]. RSC Annuncio, 2016, 6: 18778-18792.

[10]Schmölzer K, Gutmann A, Diricks M, et al. Saccarosio sintasi: una glicosiltransferasi unica per lo sviluppo del processo di glicosilazione biocatalitica [J]. Biotechnol Adv, 2016, 34: 88-111.[11]Cardini CE, Leloir LF, Chiriboga J. La biosintesi del saccarosio [J]. J Biol Chem, 1955,214: 149-155.