La swertiajaponina inibisce la pigmentazione della pelle mediante doppi meccanismi per sopprimere la tirosinasi, parte 1

ASTRATTO

Molti composti sbiancanti per la pelle prendono di mira la tirosinasi perché catalizza due fasi limitanti la velocità nella sintesi della melanina. Sebbene siano attualmente disponibili molti inibitori della tirosinasi per scopi di sbiancamento della pelle, sono riportati anche effetti avversi indesiderati. Pertanto, sono stati compiuti numerosi sforzi per sviluppare inibitori della tirosinasi più sicuri da prodotti naturali. In linea con questo, abbiamo testato cinquanta flavonoidi, un gruppo di antiossidanti naturali e chelanti di metalli, e selezionato la swertiajaponina come il più forte inibitore della tirosinasi negli esperimenti senza cellule. Swertiajaponin non ha mostrato citotossicità nelle cellule B16F10, HaCat e Hs27 e ha mostrato una forte attività antiossidante negli esperimenti che utilizzano il sistema senza cellule e le cellule B16F10. Ha marcatamente inibito l'accumulo di melanina indotta da MSH o UVB nelle cellule B16F10 e ha soppresso la pigmentazione della pelle in un modello di pelle umana. Come meccanismi sottostanti, le analisi del grafico in silico e Lineweaver-Burk hanno mostrato che la swertiajaponina può legarsi direttamente e inibire l'attività della tirosinasi formando più legami idrogeno e interazioni idrofobiche con la tasca di legame della tirosinasi. Inoltre, i risultati del western blotting hanno indicato che la swertiajaponina ha inibito la segnalazione MAPK/MITF mediata dallo stress ossidativo, portando a una diminuzione del livello della proteina tirosinasi. Insieme, la swertiajaponina sopprime l'accumulo di melanina inibendo sia l'attività che i livelli di espressione proteica della tirosinasi. Pertanto, sarebbe un nuovo additivo per i cosmetici sbiancanti.

Parole chiave

swertiajaponina; melanogenesi; pigmentazione; pelle umana; tirosinasi

INTRODUZIONE

La pelle è un sito importante in cui si accumulano i pigmenti di melanina. La sintesi e l'accumulo di melanina si verificano come meccanismo protettivo contro l'irradiazione ultravioletta (UV). Pertanto, le persone con la pelle nera sono a minor rischio di tumori della pelle rispetto a quelle con la pelle chiara perché sono protette dagli effetti mutageni dei raggi UV [1]. Tuttavia, la melanogenesi incontrollata è strettamente associata a disturbi della pigmentazione tra cui melisma, lentiggini e lentiggini senili [2]. Inoltre, alterazioni anomale del colore della pelle provocano problemi estetici sfavorevoli e alla fine degradano la qualità della vita. Pertanto, la prevenzione della melanogenesi anormale ha attirato una notevole attenzione per lo sviluppo di cosmetici per lo sbiancamento della pelle [3-5].

Il melanocita è il principale tipo di cellula che sintetizza la melanina nell'epidermide della pelle. Dopo la sintesi, i melanociti trasferiscono la melanina ai cheratinociti attraverso i dendriti, portando alla pigmentazione della pelle. La melanina può essere sintetizzata dalla L-tirosina attraverso processi di idrossilazione e ossidazione, in cui una tirosinasi multifunzionale contenente rame svolge un ruolo fondamentale nella sintesi della melanina. La tirosinasi catalizza due passaggi limitanti la velocità nella sintesi della melanina; l'idrossilazione del micofenolato della L-tirosina a 3,4-diidrossi-L-fenilalanina (L-DOPA) e l'ossidazione della L-DOPA a DOPA chinino [6, 7]. Di conseguenza, l'inibizione della tirosinasi è una buona strategia per illuminare la pelle, ma la citotossicità e la mancanza di stabilità hanno limitato l'applicazione di vari inibitori della tirosinasi nel campo dei prodotti medici e dei cosmetici. Pertanto, sono stati compiuti sforzi incessanti per trovare inibitori della tirosinasi più sicuri con maggiore stabilità e selettività da fonti naturali.

Per trovare composti per effetti sbiancanti migliori e più sicuri per la pelle, abbiamo testato cinquanta flavonoidi disponibili naturalmente per i loro effetti inibitori sulla tirosinasi e selezionato swertiajaponin come il più forte inibitore della tirosinasi. Abbiamo ulteriormente studiato il suo effetto sulla pigmentazione della pelle utilizzando modelli cellulari e di pelle umana con vari test biologici e analisi in silico.

Cistanche è un'erba comune conosciuta come "l'erba miracolosa che prolunga la vita". Il suo componente principale è il cistanoside, che ha vari effetti come la promozione della funzione antiossidante, antinfiammatoria e immunitaria. Il meccanismo tra cistanche e sbiancamento della pelle risiede nell'effetto antiossidante dei glicosidi cistanche.

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La melanina nella pelle umana è prodotta dall'ossidazione della tirosina catalizzata dalla tirosinasi e la reazione di ossidazione richiede la partecipazione dell'ossigeno, quindi i radicali liberi dell'ossigeno nel corpo diventano un fattore importante che influenza la produzione di melanina. Cistanche contiene cistanoside, che è un antiossidante e può ridurre la generazione di radicali liberi nel corpo, inibendo così la produzione di melanina.

Inoltre, la cistanche ha anche la funzione di promuovere la produzione di collagene, che può aumentare l'elasticità e la lucentezza della pelle e aiutare a riparare le cellule cutanee danneggiate.

Cistanche Phenylethanol I glicosidi hanno un significativo effetto di down-regulation sull'attività della tirosinasi e l'effetto sulla tirosinasi si è dimostrato essere un'inibizione competitiva e reversibile, che può fornire una base scientifica per lo sviluppo e l'utilizzo degli ingredienti sbiancanti in Cistanche.

Pertanto, la cistanche ha un ruolo chiave nello sbiancamento della pelle. Può inibire la produzione di melanina per ridurre lo scolorimento e l'ottusità; e promuovere la produzione di collagene per migliorare l'elasticità e la luminosità della pelle. A causa del diffuso riconoscimento di questi effetti della cistanche, molti prodotti sbiancanti per la pelle hanno iniziato a infondere ingredienti a base di erbe come Cistanche per soddisfare la domanda dei consumatori, aumentando così il valore commerciale di Cistanche nei prodotti sbiancanti per la pelle.

In sintesi, il ruolo della cistanche nello sbiancamento della pelle è cruciale. Il suo effetto antiossidante e l'effetto di produzione di collagene possono ridurre lo scolorimento e l'ottusità, migliorare l'elasticità e la lucentezza della pelle e quindi ottenere un effetto sbiancante. Inoltre, l'ampia applicazione di Cistanche nei prodotti sbiancanti per la pelle dimostra che il suo ruolo nel valore commerciale non può essere sottovalutato.

RISULTATI E DISCUSSIONE

Swertiajaponin è il più forte inibitore della tirosinasi di cinquanta flavonoidi

Di vari composti naturali, i flavonoidi, un gruppo di antiossidanti naturali e chelanti di metalli, sono noti per sopprimere l'attività della tirosinasi a causa della loro capacità di formare complessi rame-flavonoidi [8, 9]. Abbiamo utilizzato cinquanta flavonoidi disponibili in commercio per testare se hanno attività inibitoria contro la tirosinasi dei funghi. L'acido cogico, un noto inibitore della tirosinasi, è stato utilizzato come controllo positivo per schermare migliori inibitori della tirosinasi (Figura 1A-1B). Di conseguenza, il campione numero 40 (swertiajaponin) (Figura 1C) ha mostrato la più forte attività inibitoria contro la tirosinasi rispetto a quella di altri flavonoidi (Figura 1A -1 B e Figura 1 supplementare). Quando l'attività inibitoria è stata ulteriormente esaminata da un esperimento dipendente dalla concentrazione, il valore IC50 dell'acido cogico era 41,26 μM e quello della swertiajaponina era 43,47 μM (Figura 1D), indicando che l'inibizione dell'attività della tirosinasi della swertiajaponina è paragonabile a quella dell'acido cogico a base sugli esperimenti in provetta.

La swertiajaponina non mostra citotossicità in vitro

Swertiajaponin appartiene alla famiglia dei flavonoidi C-glicosidi. Contiene una porzione di carboidrati che è C-glicosidicamente legata a una delle spine dorsali dei flavonoidi (Figura 1C). È stato segnalato come un composto trovato nell'intera erba di Swertia japonica [10]. Sebbene alcuni studi abbiano riportato che la Swertia japonica è utilizzata clinicamente come rimedio per i sintomi gastrointestinali in Giappone [11], sono disponibili pochi studi sulle funzioni biologiche della swertiajaponina. Pertanto, abbiamo esaminato ulteriormente i suoi effetti sulla melanogenesi. Poiché la citotossicità è un problema importante degli inibitori sintetici della tirosinasi, abbiamo testato se la swertiajaponina mostrava tossicità cellulare utilizzando più linee cellulari tra cui HaCat (cheratinociti umani), B16F10 (melanoma di topo) e Hs27 (fibroblasti umani). Swertiajaponin non ha mostrato citotossicità in queste linee cellulari (Figura 2A -2 C).

La swertiajaponina inibisce la melanogenesi nelle cellule B16F10

Abbiamo studiato il suo effetto sulla melanogenesi utilizzando cellule B16F10 pretrattate con acido cogico o swertiajaponina seguite dall'esposizione a UVB o MSH, i più forti induttori melanogenici. Come previsto, l'esposizione a UVB o MSH ha notevolmente aumentato i livelli di melanina nelle cellule B16F10 (Figura 2D-2F) e il trattamento con swertiajaponina ha ridotto il contenuto di melanina cellulare in modo dose-dipendente dopo l'esposizione a UVB o MSH (Figura 2D{{10 }}F). Negli studi sulle cellule, l'effetto anti-melanogenico della swertiajaponina sembra essere più forte di quello dell'acido cogico (Figura 2E- 2F). Allo stesso modo, il colore del pellet cellulare pretrattato con swertiajaponina prima del trattamento con MSH è stato schiarito rispetto alle cellule trattate con MSH (Figura 2D), indicando che la swertiajaponina inibisce la melanogenesi indotta da UVB o MSH.

Swertiajaponin inibisce la melanogenesi in un modello di pelle umana

Per confermare che la swertiajaponina sopprime la pigmentazione della pelle negli esseri umani, abbiamo coltivato un'epidermide umana vitale, tridimensionale, ricostituita, costituita da melanociti e cheratinociti umani che sono noti per subire melanogenesi spontanea nel tempo [12]. Abbiamo pretrattato il modello di pelle umana con swertiajaponin per 1 ora e lo abbiamo coltivato nel terreno di mantenimento per 5 giorni. Rispetto al giorno 1, il modello di pelle umana è stato oscurato il giorno 5 e il trattamento con swertiajaponina lo ha impedito in modo dipendente dalla concentrazione (Figura 3A-3B). Allo stesso modo, la colorazione di Fontana-Masson ha mostrato che la swertiajaponina ha ridotto notevolmente i livelli di melanina nell'epidermide (Figura 2C), suggerendo che la swertiajaponina riduce la pigmentazione nell'epidermidemodello di pelle umana.

La swertiajaponina può legarsi e inattivare la tirosinasi

Successivamente abbiamo studiato i meccanismi alla base degli effetti anti-melanogenici mediati dalla swertiajaponina utilizzando cellule B16F10. Poiché la swertiajaponina ha soppresso l'attività della tirosinasi negli esperimenti privi di cellule utilizzando la tirosinasi dei funghi (Figura 1B), abbiamo ipotizzato che si leghi direttamente e disattivi la tirosinasi. Per testare ciò, è stata eseguita la simulazione dell'aggancio proteina-ligando per prevedere l'affinità di legame utilizzando AutoDock Vina. L'affinità di legame prevista tra tirosinasi e acido cogico era -5.4 kcal/mol e l'affinità tra tirosinasi e swertiajaponina era -6.3 kcal/mol (Figure 4A e 4C), suggerendo che la swertiajaponina può legarsi alla tirosinasi con maggiore affinità rispetto all'acido cogico. Per studiare ulteriormente la modalità di legame tra composti e tirosinasi, l'analisi del farmacoforo è stata eseguita utilizzando il software LigandScout 3.1. Mentre l'acido cogico può legarsi alla tirosinasi principalmente tramite legami idrogeno con il residuo ASN260 o GLU256 della tirosinasi (Figura 4B), la swertiajaponina forma più legami idrogeno con i residui HIS85, ASN81, ASN260, HIS244 e ARG268 della tirosinasi e interazioni idrofobiche con MET257, VAL248 e residuo PHE264 della tirosinasi (Figura 4D), che probabilmente spiega la maggiore affinità di legame della swertiajaponina alla tirosinasi.

Poiché un sito di legame predefinito della tirosina è stato applicato come tasca di attracco nella simulazione di attracco proteina-ligando [3], è probabile che la swertiajaponina possa legarsi in modo competitivo alla tirosinasi con la tirosina. Per esaminarlo, è stata eseguita un'analisi Lineweaver-Burk. Con l'aumentare della concentrazione di swertiajaponin, anche i valori Km sono aumentati mentre i valori Vmax erano coerenti (Figura 4E -4 F), indicando che swertiajaponin è un inibitore competitivo della tirosinasi.

Swertiajaponin è un antiossidante che sopprime la segnalazione MITF/tirosinasi indotta da UVB

Sebbene il valore IC50 della swertiajaponina sia simile a quello dell'acido cogico nell'esperimento senza cellule, l'effettiva inibizione della melanogenesi è maggiore nelle cellule trattate con swertiajaponina rispetto alle cellule trattate con acido cogico, indicando che il legame diretto con la tirosinasi potrebbe non essere l'unico meccanismo alla base dell'inibizione mediata dalla swertiajponina della melanogenesi. È ben documentato che le funzioni biologiche dei flavonoidi sono associate ai loro effetti antiossidanti [13]. Pertanto, abbiamo studiato se la swertiajaponina regola lo stress ossidativo mediante saggi di scavenging dell'ossigeno reattivo senza cellule (ROS) e del perossinitrito (ONOO-). Swertiajaponin ha mostrato forti attività di scavenging di ROS e ONOO paragonabili a Trolox e penicillamina, noti rispettivamente inibitori di ROS e ONOO (Figura 5A-5B). Abbiamo inoltre testato se l'attività antiossidante della swertiajaponina fosse mostrata anche nelle cellule B16F10 dopo l'esposizione ai raggi UVB. L'esposizione ai raggi UVB ha aumentato significativamente la produzione di ROS e ONOO, mentre la swertiajaponina li ha diminuiti in modo dipendente dalla concentrazione, suggerendo che la swertiajaponina è un antiossidante (Figura 5C-5D).

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