Mirare al cancro alla prostata avanzato con le cellule T del recettore dell'antigene chimerico STEAP1 e l'immunoterapia con IL-12 localizzata nel tumore

L'antigene epiteliale transmembrana della prostata 1 (STEAP1) è un antigene della superficie cellulare per il targeting terapeutico nel cancro alla prostata. Qui, riportiamo l'ampia espressione di STEAP1 relativa all'antigene di membrana specifico della prostata (PSMA) nei tumori metastatici letali della prostata e lo sviluppo di una terapia con cellule T STEAP1-diretta dal recettore dell'antigene chimerico (CAR). Le cellule T CAR STEAP1 dimostrano reattività a bassa densità di antigene, attività antitumorale in modelli di cancro alla prostata metastatico e sicurezza in un modello murino knock-in umano STEAP1. La fuga dell'antigene STEAP1 è un meccanismo ricorrente di resistenza al trattamento ed è associato a una ridotta elaborazione e presentazione dell'antigene tumorale. L'applicazione della terapia con interleuchina-12 (IL-12) localizzata nel tumore sotto forma di proteina di fusione con dominio legante il collagene (CBD) e IL-12 combinata con la terapia con cellule T CAR STEAP1 migliora efficacia antitumorale rimodellando il microambiente tumorale immunologicamente freddo del cancro alla prostata e combattendo la fuga dell’antigene STEAP1 attraverso l’impegno dell’immunità dell’ospite e la diffusione dell’epitopo.

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Metastatic prostate cancer represents an incurable disease responsible for over 33,000 deaths per year in the United States1. Prostate cancer is critically reliant on androgen receptor (AR) signaling and thus the suppression of gonadal androgen production through surgical or chemical castration (androgen deprivation therapy) has been a mainstay of treatment for advanced disease. However, metastatic prostate cancer inevitably develops resistance to androgen deprivation therapy and enters a stage called metastatic castration-resistant prostate cancer (mCRPC). mCRPC is currently incurable and is considered the end stage of the disease and is associated with a median overall survival of three years2. In the past decade, multiple therapies including an inhibitor of extragonadal androgen synthesis (abiraterone acetate)3, second-generation AR antagonists (enzalutamide)4, radioactive isotope (radium-223)5, and a prostate-specific membrane antigen (PSMA)-specific radioligand therapy (lutetium Lu 177 via votide tetraxetan)6 have been approved for mCRPC. Each of these agents extends survival on average by several months but long-term remissions are rare. Strategies to reprogram the immune system to combat prostate cancer first gained traction with the clinical approval of the dendritic cell vaccine sipuleucel-T for asymptomatic mCRPC7. More recently, several types of immunotherapies including immune checkpoint inhibitors, a DNA cancer vaccine, antibody-drug conjugates (ADC), T cell engaging bispecific antibodies (T-BsAb), and chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapies have been under active clinical investigation8,9. CARs are synthetic receptors that leverage the potency, expansion, and memory of T cells and can be engineered against virtually any tumor-associated cell surface antigen. The adoptive transfer of CAR T cells has rapidly become an established treatment for hematologic malignancies with exceptional response rates leading to six clinical approvals in the last five years10. In contrast, CAR T cell therapies targeting solid tumors have lagged due to additional challenges related to the lack of bona fide tumor-specific antigens, inhospitable tumor microenvironments, and poor trafficking, persistence, and expansion of CAR T cells11. Despite the challenges observed in driving effective immune responses toward solid tumors, recent early-phase clinical trials investigating CAR T cell therapies targeting PSMA in mCRPC have reported safety and evidence of significant biochemical and radiographic responses12,13. These preliminary results serve to embolden efforts to develop and optimize new CAR T cell therapies for prostate cancer. While PSMA is the preeminent target for therapeutic and diagnostic development in prostate cancer, recent work indicates that PSMA expression may be quite heterogeneous in mCRPC14. Tumor antigen heterogeneity, especially in the context of single antigen-targeted CAR T cell therapies for solid tumors like prostate cancer, is an important barrier to therapeutic efficacy15. Thus, identifying cell surface antigens with broad and relatively homogeneous expression in prostate cancer is imperative. In addition, very few if any tumor-associated antigens demonstrate tumor-restricted expression—most also exhibit low-level expression in normal tissues that could represent liabilities for CAR T cell therapies due to on-target off-tumor toxicities which can lead to devastating consequences including death16. We previously performed integrated transcriptomic and cell surface proteomic profiling of human prostate adenocarcinoma cell lines and identified six transmembrane epithelial antigens of the prostate 1 (STEAP1) as one of the most highly enriched cell surface antigens17. STEAP1 was first described over two decades ago18 and was recognized as being highly expressed in prostate cancer. STEAP1 is strongly expressed in >L'80% dei mCRPC presenta un coinvolgimento osseo o linfonodale19, il 62% dei sarcomi di Ewing20 e numerosi altri tipi di cancro21. STEAP1 appartiene alla famiglia STEAP delle metallo reduttasi che possono formare omotrimeri o eterotrimeri con altre proteine ​​STEAP22. STEAP1 ha un ruolo funzionale consolidato nel promuovere la proliferazione, l'invasione e la transizione epitelio-mesenchimale delle cellule tumorali–26.

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Inoltre, STEAP1 dimostra un'espressione limitata nel tessuto normale27, il che lo rende un bersaglio molto interessante per la terapia antitumorale. Sono stati sviluppati diversi agenti immunoterapeutici per colpire STEAP1, ma nessuno è clinicamente approvato. L'ADC vandor tuzumab ved otin (DSTP3086S), costituito da un anticorpo umanizzato anti-STEAP1 IgG1 legato alla monometilauristatina E, ha dimostrato di avere un profilo di sicurezza accettabile in uno studio clinico di fase I in mCRPC, ma sono state osservate poche risposte tumorali obiettive28. Un T-BsAb che incorpora due domini anti-STEAP1 di legame con l'antigene del frammento (Fab), un frammento variabile a catena singola anti-CD3 (scFv) e un dominio cristallizzabile del frammento (Fc) progettato per mancare di funzione effettrice chiamato AMG 509 è attualmente in fase di valutazione in uno studio clinico di fase I (NCT04221542) in mCRPC29. Recentemente è stato anche segnalato che il T-BsAb bivalente asimmetrico doppio chiamato BC261 dimostra una potente attività antitumorale in più modelli preclinici di cancro alla prostata e sarcoma di Ewing30. Inoltre, è stato dimostrato che un recettore delle cellule T (TCR) ristretto di classe I per l'antigene leucocitario umano (HLA) specifico per un peptide STEAP1 inibisce la crescita locale e metastatica del sarcoma di Ewing in un modello di xenotrapianto preclinico dopo trasferimento adottivo di cellule T transgeniche31. In questo studio, eseguiamo un'analisi comparativa dell'espressione relativa di STEAP1 e PSMA nel mCRPC letale per studiare l'utilità di prendere di mira STEAP1 nell'attuale era della teranostica PSMA. Progettiamo e screening CAR STEAP1 di seconda generazione per l'attivazione delle cellule T antigene-specifiche e la citolisi delle cellule bersaglio per produrre un candidato principale per un'ulteriore caratterizzazione. Determiniamo la specificità funzionale dell'epitopo delle cellule T CAR STEAP1 e profiliamo l'espansione e l'immunofenotipo dei prodotti delle cellule T CAR STEAP1 da più donatori. Stabiliamo quindi la potenza e la sicurezza preliminare della terapia con cellule T CAR T STEAP1 in modelli preclinici rilevanti di cancro alla prostata, ma osserviamo la perdita ricorrente dell'espressione dell'antigene STEAP1 come meccanismo di resistenza al trattamento. Per superare questo problema, valutiamo la somministrazione concomitante di CBD-IL-12 che rimodella il microambiente tumorale immunosoppressore del cancro alla prostata e attiva l'immunità endogena per ampliare le risposte antitumorali. Collettivamente, questi studi forniscono una forte motivazione per la traduzione clinica della terapia con cellule T CAR STEAP1 negli uomini con mCRPC e guidano le strategie per superare potenziali meccanismi di resistenza terapeutica.

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Risultati

STEAP1 è ampiamente espresso nei tessuti mCRPC refrattari al trattamento

We first set out to determine the pattern and extent of STEAP1 expression relative to PSMA in advanced metastatic prostate cancer. We performed immunohistochemical (IHC) staining on a duplicate set of tissue microarrays consisting of 121 metastatic tumors (each with up to three cores represented) collected from 44 men with lethal mCRPC patients collected by rapid autopsy between the years 2010 and 2017 through the University of Washington Tumor Acquisition Necropsy Program32 (Fig. 1a). Plasma membrane staining for STEAP1 and PSMA in each tissue was scored by a research pathologist and semiquantitative H-scores were determined based on the staining intensity (Supple mentary Fig. 1a) multiplied by the percentage of cancer cells staining at each intensity (Supplementary Fig. 1b). By implementing a minimal staining threshold with an H-score cut-off of 30, we found that 87.7% of evaluable matched mCRPC tissues (100 of 114) demonstrated staining for STEAP1 compared to only 60.5% (69 of 114) for PSMA (Fig. 1b). In addition, 28.1% of mCRPC tissues (32 of 114) showed STEAP1 but not PSMA staining (Fig. 1b, c) whereas only 0.9% (one of 114) exhibited PSMA but not STEAP1 staining. Based on these results, we used a linear mixed statistical model to determine that the odds of non-zero (H-score >{{0}}) la colorazione era 22-volte (95% CI 6-173) più alta per STEAP1 che per PSMA e le probabilità di un punteggio H maggiore o uguale a 3{{ 27}} sono 84-volte (95% CI 30-317) più alti per STEAP1 che per PSMA. Il punteggio H medio STEAP1 nell'osso (193; IC 95% da 171 a 215) era significativamente più alto rispetto alle metastasi linfonodali (differenza -48; IC 95% da -21 a -76; p < 0.001) e significativamente più alto rispetto alle metastasi viscerali (differenza -59; IC 95% da -42 a -77; p <0,001). Non è stata riscontrata alcuna differenza significativa tra il punteggio H medio STEAP1 nelle metastasi linfonodali rispetto alle metastasi viscerali (differenza 11; IC 95% da -16 a 39; p=0.4) (Figura 1c supplementare). Abbiamo anche osservato diversi casi con espressione eterogenea di PSMA all'interno dei nuclei (Fig. 1d) che è coerente con un recente rapporto sull'eterogeneità intratumorale del PSMA nelle biopsie mCRPC14. L'analisi a livello di paziente utilizzando una soglia media del punteggio H maggiore o uguale a 30 e il test di McNemar ha rivelato che il 95% dei pazienti valutabili (42 su 44) aveva tumori con espressione STEAP1 mentre il 68% (30 su 44) era positivo per PSMA (Figura 1d supplementare). Per studiare i modelli di eterogeneità inter-paziente e intra-paziente associati all'espressione STEAP1 e PSMA, abbiamo utilizzato i punteggi H STEAP1 e PSMA per valutare i punteggi di diversità ipergeometrica, Simpson e Shannon. Abbiamo osservato due modelli di espressione STEAP1 (Fig. 1e) con il 68% (30/44) di pazienti che mostravano espressione STEAP1 in tutti i siti metastatici (STEAP1 elevato) e il 32% (14/44) di pazienti che mostravano siti metastatici con e senza espressione STEAP1 (STEAP1 eterogeneo). Non è stato identificato alcun paziente in cui tutti i tessuti metastatici mancassero di espressione STEAP1. Un'analisi simile per l'espressione di PSMA nella stessa coorte ha rivelato il 45% (20/44) di pazienti con elevata espressione di PSMA, il 32% (14/44) con espressione di PSMA eterogenea e il 23% (10/44) senza espressione di PSMA. Sulla base della sottoclassificazione molecolare dei tessuti mCRPC utilizzando AR e l'espressione del marcatore neuroendocrino sinaptofisina (SYP) valutata dall'IHC, la maggior parte dei pazienti con espressione STEAP1 e PSMA elevata o eterogenea presentava cancro alla prostata AR-positivo (AR+/SYP- o AR+/SYP+) mentre quelli senza espressione di PSMA avevano un cancro alla prostata AR-null (AR-/SYP+ o AR-/SYP-). Abbiamo identificato una correlazione positiva tra l'espressione di STEAP1 e AR (p <0,001) mediante un modello misto lineare adattato con effetto casuale nei casi rappresentati sul microarray tissutale (Figura 2a, b supplementare) che era previsto dato che STEAP1 è un androgeno -gene regolato33,34. Al contrario, è stata apprezzata una tendenza negativa tra l'espressione di STEAP1 e SYP (Figura 2c supplementare). Questi risultati suggeriscono che, come PSMA35, l'espressione di STEAP1 potrebbe essere persa con la transdifferenziazione neuroendocrina del cancro alla prostata.

Fig. 1 | Comparative analysis of STEAP1 and PSMA in lethal, metastatic castration-resistant prostate cancer (mCRPC). a Characteristics of the mCRPC tissues represented on University of Washington Tissue Acquisition Necropsy Tissue Microarray 92 (UW TAN TMA92). b Contingency table showing the frequency of mCRPC tissues with STEAP1 or PSMA IHC staining above or below an H-score threshold of 30. Micrographs of select mCRPC tissues after STEAP1 and PSMA IHC staining to highlight the (c) absence of PSMA but the presence of STEAP1 expression and (d) intratumoral heterogeneity of PSMA expression but not STEAP1. Scale bars = 50 µm. For panels (c, d) n = 332 mCRPC cores were immunostained for STEAP1 and PSMA. e Dot and box plot showing the distribution of STEAP1 (top) and PSMA (bottom) H-scores in 44 patients from the UW TAN TMA92 cohort. Each dot represents a tumor specimen/core (n = 319 cores for PSMA and 333 cores for STEAP1) and the color indicates the molecular subtype: AR+/SYP+ (red), AR+/SYP− (green), AR−/SYP+ (yellow) and AR−/SYP− (purple). Gray rectangles show interquartile ranges spanning the 25th to the 75th percentiles of PSMA H-scores from each patient. Bar plots (on the right) summarize the frequencies of patients classified based on STEAP1 and PSMA expression as no expression (all cores with H-score ≤30, light grey), heterogeneous expression (at least one core with H-score ≤30 and H-score >30, mid grey) and high expression (all cores with H-scores >30, grigio scuro). I dati di origine sono forniti nel file dei dati di origine.

Svilupparesviluppo di un potente CAR STEAP1 antigene-specifico

Data l'espressione diffusa di STEAP1 nell'mCRPC in stadio avanzato e il suo ruolo funzionale segnalato nella progressione del cancro27,36,37, abbiamo successivamente iniziato a progettare un CAR lentivirale di seconda generazione specifico per STEAP1-. Abbiamo utilizzato il backbone lentivirale pCCL-c-MNDU3-X38 che è stato ampiamente utilizzato per la terapia genica con cellule staminali ematopoietiche39 e l'espressione CAR nelle cellule T guidate dal promotore interno MNDU3 ha dimostrato di essere superiore a quella ottenuta con un Promotore EFS40. È stato favorito un dominio costimolatorio 4-1BB a causa della sua associazione con la formazione di memoria delle cellule T e la persistenza prolungata41 ed è stato introdotto un dominio transmembrana CD28 poiché è stato dimostrato che riduce la soglia dell'antigene per 4-1BB di seconda generazione Attivazione delle cellule CAR T42. Abbiamo incorporato l'scFv completamente umanizzato derivato da vandor tuzumab vedotin, un ADC mirato a STEAP1 il cui sviluppo è stato interrotto dopo uno studio clinico di fase I28. Questo scFv è una variante umanizzata dell'anticorpo monoclonale murino (mAb 120.545) originariamente sviluppato da Agensys, Inc. che dimostra un'affinità di 1 nM nei test di legame cellulari43. Per ottimizzare potenzialmente l'attività CAR, abbiamo implementato tre diverse lunghezze di cerniera/distanziatore, tra cui corta (cerniera IgG4), media (cerniera IgG4-CH3) e lunga (cerniera IgG4-CH2- CH3). Il lungo distanziatore è stato progettato con mutazioni 4/2- NQ precedentemente descritte44 nel dominio CH2 per prevenire il legame del recettore Fc-gamma e la morte cellulare indotta dall'attivazione che si verifica con il trasferimento adottivo di cellule T CAR con distanziatore lungo in topi immunodeficienti. I tre CAR candidati sono stati clonati nel vettore lentivirale (Fig. 2a) che co-esprime anche il recettore troncato del fattore di crescita epidermico (EGFRt) come marcatore di trasduzione. I lentivirus sono stati generati e utilizzati per trasdurre cellule T umane CD4 e CD8 arricchite da cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) di donatori umani raccolte dalla aferesi. Le cellule T CAR CD4 e CD8 espanse sono state immunofenotipizzate (Figura 3a supplementare) e ricostituite in prodotti cellulari di una composizione definita con un normale rapporto CD4/CD8 per valutare le loro attività funzionali. Per controllare l'espressione di STEAP1 in modo isogenico, ci siamo concentrati sulla linea cellulare di cancro alla prostata umana 22Rv1 che dimostra l'espressione nativa di STEAP1 e abbiamo eseguito l'eliminazione di STEAP1 (ko) mediante editing del genoma CRISPR/Cas9. Abbiamo quindi generato una linea di salvataggio STEAP1 dal 22Rv1 STEAP1 ko mediante trasduzione con un lentivirus che esprime STEAP1 (Fig. 2b). Queste linee sono state quindi utilizzate per selezionare le tre cellule T CAR T STEAP1 con spaziatore corto, medio e lungo in test di co-coltura con una lettura del rilascio di interferone-gamma (IFN-) come indicatore dell'attivazione delle cellule T. Solo le cellule T CAR T STEAP1 con spaziatore lungo (di seguito chiamate cellule T CAR STEAP 1- BBζ) hanno dimostrato il modello antigene-specifico previsto del rilascio di IFN, mentre le cellule T CAR T STEAP1 con spaziatore corto e medio no (Fig. 2c , Figura supplementare 3b, c). Inoltre, le cellule T CAR T STEAP1-BBζ hanno mostrato una sostanziale citolisi dose-dipendente delle cellule 22Rv1 rispetto alle cellule T non trasdotte (Fig. 2d) e hanno dimostrato un relativo risparmio delle cellule ko 22Rv1 STEAP1 (Fig. 2e). Studi simili sono stati poi condotti sulla linea cellulare di cancro alla prostata umana DU145 che manca di espressione nativa di STEAP1 ma è stata progettata per esprimere STEAP1 (DU145 STEAP1) mediante trasduzione lentivirale (Figura 4a supplementare). In questo contesto, l'attivazione delle cellule T CAR T STEAP1-BBζ è stata osservata solo in co-colture con cellule DU145 STEAP1 e non con cellule DU145 parentali (Figura 4b supplementare). L'attività citolitica è stata apprezzata solo con cellule T CAR STEAP1- BBζ e non con cellule T non trasdotte in co-colture con cellule DU145 STEAP1 (Figura 4c supplementare). Successivamente abbiamo analizzato un pannello più ampio di linee cellulari di cancro alla prostata umana per caratterizzare la loro espressione nativa STEAP1 mediante analisi immunoblot. Le linee cellulari con espressione/attività AR nota (LNCaP, 22Rv1, VCaP e LNCaP95) hanno mostrato livelli variabili di espressione STEAP1 mentre le linee cellulari AR-null (PC3, DU145, MSKCC EF1 e NCI-H660) non sembravano esprimere livelli rilevabili di STEAP1 (Fig. 2f). Abbiamo proceduto a eseguire co-colture di STEAP1-BBζ CAR T con queste linee per convalidare ulteriormente la loro attivazione antigene-specifica basata sul rilascio di IFN (Fig. 2g). Tuttavia, abbiamo osservato una scoperta discordante in quanto la linea PC3, che non mostrava alcuna espressione apparente della proteina STEAP1 (Fig. 2f), induceva un'attivazione sostanziale delle cellule T CAR STEAP1-BBζ. La letteratura precedente suggeriva che STEAP1 fosse espresso nella linea cellulare PC3 a bassi livelli45. Infatti, l'esposizione prolungata all'immunoblot ha rivelato una banda che suggerisce la presenza di un'espressione molto bassa di STEAP1 (Fig. 2h). Per confermare se l'attivazione delle cellule T CAR T STEAP1-BBζ fosse dovuta a questa espressione minore di STEAP1 nelle cellule PC3, abbiamo generato tre sottolinee PC3 STEAP1 ko (Fig. 2h) e abbiamo nuovamente eseguito co-colture con STEAP{{133} } Cellule T CAR BBζ. STEAP1 ko nella linea PC3 ha portato all'abrogazione dell'attivazione delle cellule T CAR T STEAP1-BBζ CAR (Fig. 2i), convalidando ulteriormente la specificità e fornendo prova della sensibilità delle cellule T CAR T STEAP1-BBζ CAR a bassi condizioni di densità dell'antigene.

Mancanza di reattività crociata di STEAP1-BBζ CAR con Steap1 murino e STEAP1B umano

benefici dell'integratore di cistance: aumentano l'immunità

Coerentemente con la specificità antiumana di vandor tuzumab vedotin, le cellule T CAR T STEAP1-BBζ non hanno dimostrato reattività crociata con Steap1 del topo (Figura 4a, d, e supplementare). Tuttavia, abbiamo utilizzato questa opportunità per ricostituire individualmente i tre domini extracellulari STEAP1 umani (ECD) sul mouse Steap1 (Figura 4f supplementare) per determinare quali ECD sono fondamentali per il riconoscimento degli epitopi da parte delle cellule T CAR T STEAP1-BBζ. Sono stati eseguiti esperimenti di co-coltura con cellule T CAR STEAP1-BBζ e cellule DU145 progettate per esprimere Steap1 di topo con sostituzione individuale di ECD di topo con ECD umani. Abbiamo scoperto che l'ECD2 STEAP1 umano ma non l'ECD1 o l'ECD3 era associato all'attivazione delle cellule T CAR T STEAP1-BBζ (Figura 4g supplementare). È interessante notare che lo STEAP1 umano e l'ECD2 Steap1 del topo hanno dimostrato un'omologia del 93,9% (31/33 aminoacidi) (Figura 4h supplementare), indicando che Q198 e/o I209 dello STEAP1 umano sono fondamentali per il riconoscimento produttivo da parte di STEAP1-BBζ Cellule T CAR. È stato dimostrato che Q198 interagisce con il Fab di 120.545 come parte di un hotspot di interazione basato su una struttura recente risolta mediante microscopia elettronica criogenica22. Della famiglia di proteine ​​umane STEAP, STEAP1B ha la maggiore omologia con STEAP145. Sono state identificate tre trascrizioni STEAP1B, di cui tutte dimostrano la completa conservazione della sequenza aminoacidica di STEAP1 ECD2 umano (Figura 5a supplementare). L'algoritmo di previsione consensuale della topologia della membrana TOPCONS46 prevedeva che le sequenze del dominio ECD2 fossero extracellulari nelle tre isoforme della proteina STEAP1B (Figura 5b supplementare) anche se con punteggi di bassa affidabilità per STEAP1B rispetto a hSTEAP1 a causa della mancanza di consenso tra i cinque modelli di previsione della topologia (OCTOPUS, Philius, PolyPhobius, SCAMPI e SPOCTOPUS) utilizzati da TOPCONS (Figura 5c supplementare). Un'analisi precedente utilizzando un altro strumento di previsione della topologia basato su modello Markov nascosto in silico TMHMM47 aveva anche suggerito che questa sequenza potrebbe essere intracellulare piuttosto che extracellulare nelle isoforme 1 e 245 della proteina STEAP1B. Tuttavia, la struttura cristallina di STEAP1B non è stata ancora determinata per dimostrare direttamente queste previsioni. Per valutare funzionalmente se le cellule T CAR T STEAP1- BBζ potrebbero essere reattive anche contro STEAP1B, abbiamo eseguito co-colture utilizzando linee DU145 progettate per esprimere ciascuna delle tre isoforme di STEAP1B. Non abbiamo identificato prove di attivazione delle cellule T CAR T STEAP1-BBζ (Figura 5d supplementare), suggerendo che l'epitopo STEAP1 riconosciuto dalle cellule T CAR T STEAP1-BBζ potrebbe non essere presentato come parte di un ectodomino da STEAP1B nonostante l'apparente omologia di sequenza.

Figura 2|Screening dei recettori dell'antigene chimerico (CAR) 4-1BB di seconda generazione per identificare una guida per la terapia con cellule T CAR STEAP1. uno schema del costrutto lentivirale STEAP1 CAR e della variazione basata su distanziatori corti, medi e lunghi. Ripetizione terminale lunga LTR, regione U3 del virus della leucemia murina Moloney MNDU3, frammento variabile a catena singola scFv, catena leggera variabile VL, catena pesante variabile VH, transmembrana tm, recettore del fattore di crescita epidermico troncato EGFRt, 4/2 NQ {{1{{28 }}}} Mutazioni del dominio CH2 per impedire il legame ai recettori Fc-gamma. b Immunoblot di STEAP1 in cellule parentali 22Rv1, cellule knockout (ko) STEAP1 e cellule ko STEAP1 con salvataggio di STEAP1. c Il test immunoassorbente legato all'enzima IFN (ELISA) risulta da co-colture di cellule T non trasdotte o cellule T CAR T STEAP1-BBζ con ciascuna delle sottolinee 22Rv1 in un rapporto 1:1 a 24 ore (p < 0.001). Vitalità cellulare relativa delle cellule bersaglio (d) 22Rv1 e (e) 22Rv1 STEAP1 ko nel tempo misurata mediante imaging a fluorescenza di cellule vive dopo co-coltura con cellule T CAR STEAP1-BBζ (p < 0,001) o ( a destra) cellule T non trasdotte con rapporti variabili tra cellule effettrici e bersaglio (E: T). f Immunoblot che dimostrano l'espressione di STEAP1 in linee cellulari di cancro alla prostata umano positive al recettore degli androgeni (AR) ma non in linee cellulari di cancro alla prostata AR-negative. g Quantificazione dell'IFN mediante ELISA da co-colture di cellule T non trasdotte o cellule T CAR T STEAP1- BBζ con ciascuna delle linee cellulari di cancro alla prostata umana in (f) in un rapporto 1:1 a 24 ore. h Immunoblot per STEAP1 nelle sottolinee ko 22Rv1, PC3 e PC3 STEAP1. I IFN-quantificazione mediante ELISA da co-colture di cellule T non trasdotte o cellule T CAR T STEAP1- BBζ con ciascuna linea cellulare in (h) con un rapporto 1:1 a 24 ore (p < 0,001). Per i pannelli (c–e, g e i) sono stati utilizzati n=4 replicati biologici per condizione e le barre di errore rappresentano la media con SEM. Il pannello (b, f, h) mostra i risultati rappresentativi di n=3 repliche biologiche. GAPDH è stato utilizzato come controllo del caricamento delle proteine. Per i pannelli (c) e (i), è stata utilizzata l'ANOVA a due vie con i test di confronto multiplo di Sidak. Per i pannelli (d) ed (e), è stata utilizzata l'ANOVA a due vie con il test dei confronti multipli di Tukey. I dati di origine sono forniti nel file dei dati di origine.

Caratterizzazione dei prodotti cellulari STEAP1-BBζ CAR T in una serie di donatori

Successivamente abbiamo profilato l'espansione, l'efficienza di trasduzione e l'immunofenotipo dei prodotti cellulari STEAP1-BBζ CAR T utilizzando tre set indipendenti di cellule mononucleari del sangue periferico (PBMC) raccolti da donatori sani. In genere abbiamo osservato un'espansione da 20- a 40-piega delle cellule T CAR T STEAP1-BBζ entro 11 giorni dalla coltura (Figura 6a supplementare). La percentuale di cellule T EGFRt+ CD8 variava dal 24,3 al 54,2% mentre la percentuale di cellule T EGFRt+ CD4 era più alta e variava dal 60,1 al 74,9% nei nostri prodotti di cellule T STEAP1-BBζ CAR (Figura 6b supplementare). Abbiamo esaminato l'espressione dei marcatori di esaurimento delle cellule T PD -1 e LAG -3 nei sottoinsiemi di cellule T CAR T non trasdotte e STEAP 1- BBζ CAR e non abbiamo osservato alcun aumento significativo dell'espressione (Figura 6c supplementare ). Questa scoperta ha suggerito una segnalazione tonica bassa o assente da parte del CAR STEAP1-BBζ, il che è stato incoraggiante poiché la segnalazione costitutiva del CAR può avere un impatto negativo sulla funzione effettrice delle cellule T CAR48. Entrambi i fenotipi delle cellule T della memoria delle cellule staminali (Tscm) e delle cellule T della memoria centrale (TCM) sono stati associati all'efficacia terapeutica della terapia con cellule CAR T poiché promuovono la proliferazione e la persistenza sostenute in vivo49-51. L'immunofenotipizzazione di sottoinsiemi di cellule T CAR T non trasdotte e STEAP 1- BBζ ha dimostrato frequenze più elevate di cellule Tscm rispetto ai sottoinsiemi di cellule T nei PBMC donatori da cui sono stati derivati ​​i prodotti cellulari (Figura 6d supplementare). Questo effetto è probabilmente dovuto all'aggiunta di IL-7 e/o IL-15 ai mezzi di espansione delle cellule T poiché è stato dimostrato che queste citochine preservano e migliorano la differenziazione del Tscm51,52. La nostra analisi ha anche rivelato un arricchimento nelle popolazioni Tcm in particolare nelle cellule T CAR CD8 STEAP1-BBζ (Figura 6e supplementare).

Le cellule T CAR T STEAP1-BBζ dimostrano effetti antitumorali sostanziali in modelli di cancro alla prostata disseminati con espressione nativa STEAP1 stabilita in topi immunodeficienti

Cistanche tubulosa: migliora il sistema immunitario

Come schermo iniziale per l'attività antitumorale in vivo, abbiamo stabilito tumori xenotrapianto sottocutaneo 22Rv1 nei topi maschi NOD scid gamma (NSG). Quando i tumori sono cresciuti fino a circa 100 mm3, i topi sono stati trattati con una singola iniezione intratumorale di cellule T non trasdotte 5 × 106 o di cellule T CAR STEAP1-BBζ. Il trattamento intratumorale con cellule T CAR T STEAP1- BBζ è stato associato a una significativa inibizione della crescita tumorale che era statisticamente significativa entro il giorno 18 di trattamento (Fig. 3a). I topi sono stati sacrificati il ​​giorno 25 e i tumori residui dei topi trattati con cellule T CAR STEAP1-BBζ hanno mostrato ampie aree di detriti necrotici e regioni di tumore vitale sono state infiltrate con CD3+ STEAP1-BBζ Cellule CAR T (Figura 7a supplementare). L'espressione di STEAP1 è stata conservata nei tumori tra i gruppi di trattamento (Figura 7b supplementare). Abbiamo trasdotto cellule 22Rv1 con lentivirus per rafforzare l'espressione della luciferasi (Luc) della lucciola e cellule 106 22Rv1-fLuc sono state iniettate nelle vene della coda di topi maschi NSG. La colonizzazione metastatica è stata visualizzata mediante imaging di bioluminescenza dal vivo (BLI) dopo due settimane, a quel punto i topi sono stati trattati con una singola iniezione endovenosa di cellule T non trasdotte 5 × 106 o cellule T CAR T STEAP 1- BBζ (Fig. 3b) . BLI seriali hanno rivelato una rapida progressione della malattia nei topi trattati con cellule T non trasdotte mentre quelli che hanno ricevuto cellule T CAR T STEAP1-BBζ hanno dimostrato un ritardo significativo nella progressione del tumore (Fig. 3c, d) e nell'estensione della sopravvivenza (97 giorni contro 31 giorni , p=0.0018 mediante test dei ranghi logaritmici, Fig. 3e). Non vi è stata alcuna differenza significativa nel peso dei topi tra i bracci di trattamento (Figura 7c supplementare). La colorazione IHC dei tumori alla fine dello studio ha mostrato una riduzione significativa dell'espressione STEAP1 (Figura 7d supplementare), indicando che la fuga dell'antigene era un meccanismo di resistenza. Tuttavia, questo era improbabile che fosse il risultato della transdifferenziazione in uno stato di cancro alla prostata variante poiché non abbiamo apprezzato i cambiamenti morfologici, la perdita di espressione di AR e PSMA53 o l'aumento dell'espressione di SYP (Figura 7d supplementare). Per studiare l'impatto globale della perdita di STEAP1 nel cancro alla prostata, abbiamo eseguito la profilazione del trascrittoma delle linee cellulari isogeniche 22Rv1 wildtype (wt), 22Rv1 STEAP1 ko e 22Rv1 STEAP1 ko + linee cellulari di salvataggio che avevamo precedentemente preparato (Fig. 2b). L'analisi dell'espressione genica differenziale confrontando le cellule 22Rv1 STEAP1 ko con le cellule 22Rv1 wt ha identificato ~1700 geni significativamente sottoregolati (FDR inferiore o uguale a 0,05, cambiamento di piega<2) with STEAP1 knockout. Rescue of STEAP1 expression in the 22Rv1 STEAP1 ko cells revealed that ~600 genes were significantly upregulated (FDR ≤ 0.05, fold-change>2) mediante aggiunta di STEAP1 (Figura 8a supplementare). Gene Set Enrichment Analysis (GSEA) ha nominato diversi percorsi biologici che potrebbero essere disregolati dalla modulazione dell'espressione STEAP1. Tra questi spiccano la progressione del ciclo cellulare e molteplici processi metabolici tra cui il ciclo di Kreb e la glicolisi che sono stati arricchiti negativamente dal knockout di STEAP1 e salvati con il ripristino di STEAP1 (Figura 8b supplementare). Abbiamo applicato la firma validata 31-della progressione del ciclo cellulare (CCP)54 ai nostri dati che ha mostrato una significativa sottoregolazione della firma CCP associata al knockout di STEAP1 con un punteggio di −0.8 che è aumentato sostanzialmente a {{ 14}}.5 con il salvataggio dell'espressione STEAP1 (Figura 8c supplementare). Questi dati sono coerenti con una pubblicazione precedente che indicava che il knockdown di STEAP1 nella linea cellulare del cancro alla prostata LNCaP compromette la vitalità e la proliferazione cellulare inducendo l'apoptosi37. Abbiamo anche notato che l'elaborazione e la presentazione dell'antigene era uno dei percorsi KEGG più significativamente de-arricchiti con knockout STEAP1 (Figura 8b supplementare). Abbiamo osservato una significativa downregulation di geni tra cui PSME1 (subunità 1 dell'attivatore del proteasoma) che è un membro del complesso immunoproteasoma, TAP1 (trasportatore 1, membro della sottofamiglia della cassetta legante l'ATP) che è fondamentale per il peptide di classe I del complesso maggiore di istocompatibilità (MHC) complesso di caricamento e diversi geni MHC di classe I e II come MR1 (complesso maggiore di istocompatibilità, correlato alla classe I), HLA-DQ-B1 e HLA-DQB2 (Figura 8d supplementare). Abbiamo studiato ulteriormente i tumori raccolti dai modelli disseminati 22Rv1 trattati con terapia con cellule T CAR T STEAP1- BBζ che hanno dimostrato perdita di antigene (Fig. 3c, Fig. 7d supplementare) mediante analisi del trascrittoma. L'analisi dell'espressione genica differenziale e la successiva GSEA che confrontava i tumori metastatici 22Rv1 dei topi trattati con terapia con cellule T STEAP1-BBζ CAR con quelli trattati con cellule T non trasdotte hanno mostrato un arricchimento negativo dei percorsi coinvolti nell'MHC, nei linfociti citotossici e nell'attivazione delle cellule T ( Figura supplementare 9a, b). Abbiamo anche valutato specificamente l'espressione dei geni MHC di classe I e II e osservato la loro marcata downregulation nei tumori 22Rv1 trattati con terapia con cellule T CAR T STEAP 1- BBζ (Figura 9c supplementare). Questo risultato è stato ulteriormente corroborato da una significativa riduzione della colorazione HLA-A, B, C mediante IHC in questi tumori (Figura 9d supplementare). La potenziale implicazione di questi dati è che il trattamento con la terapia con cellule T CAR T STEAP1-BBζ e la conseguente perdita dell'espressione dell'antigene tumorale STEAP1 nel cancro alla prostata può comportare un'ulteriore resistenza all'immunoterapia attraverso un'alterata elaborazione e presentazione dell'antigene. Abbiamo anche inoculato topi maschi NSG con cellule C4-2B-fLuc mediante iniezione nella vena della coda. C4-2B è una sottolinea di LNCaP55 resistente alla castrazione con una cinetica di crescita più in linea con il tipico cancro alla prostata. Quattro settimane dopo l'iniezione, la colonizzazione metastatica è stata confermata da BLI e i topi sono stati trattati con una singola iniezione endovenosa di cellule T 5 × 106 non trasdotte o cellule T CAR T STEAP1-BBζ (Fig. 3b). Il BLI seriale ha mostrato una risposta completa in tutti i topi che hanno ricevuto cellule T CAR T STEAP1-BBζ entro cinque settimane dal trattamento (Fig. 3f, g). Abbiamo identificato una tendenza all'aumento della perdita di peso nel gruppo di trattamento con cellule T non trasdotte (Figura 10a supplementare) ma questo non era statisticamente significativo. La necroscopia di topi trattati con cellule T CAR T STEAP1-BBζ non ha mostrato alcuna malattia macroscopica e il BLI ex vivo degli organi non ha rivelato alcun segnale (Figura 10b supplementare), suggerendo che questi topi erano probabilmente guariti. Abbiamo identificato la persistenza periferica delle cellule T CAR STEAP1-BBζ alla fine dell'esperimento in base alla presenza di splenociti CD3+ EGFRt+ rilevabili (Fig. 3h).

Figura 3|Attività antitumorale in vivo della terapia con cellule T CAR T STEAP1-BBζ in modelli di cancro alla prostata con espressione nativa di STEAP1. a Volumi di tumori sottocutanei 22Rv1 in topi NSG (n=4 per il gruppo di cellule T non trasdotte e n=5 per il gruppo di cellule T STEAP1-BBζ CAR) nel tempo dopo una singola iniezione intratumorale di 5 × 106 cellule T non trasdotte o cellule T CAR STEAP{{10}}BBζ con rapporti CD4/CD8 normali. p < 0.0001 nei giorni 20 e 25. Le barre rappresentano la media con SEM. b Schema degli esperimenti di provocazione tumorale per i modelli disseminati 22Rv1 (in alto) e C4-2B (in basso). Luciferasi della lucciola di Luc, imaging di bioluminescenza BLI. c Imaging seriale di bioluminescenza (BLI) di topi NSG innestati con metastasi 22Rv1-fLuc e trattati con una singola iniezione endovenosa di cellule T 5 × 106 non trasdotte o cellule T CAR T STEAP1-BBζ con cellule CD4/ Rapporti CD8 al giorno 0. La X rossa indica topi deceduti. Viene mostrata una scala di radianza. d Grafico che mostra la quantificazione del flusso totale nel tempo dal BLI live di ciascun topo in (c). e Curve di sopravvivenza di Kaplan-Meier dei topi in (c) con significatività statistica determinata dal test log-rank (Mantel-Cox). Per i pannelli (c–e) sono stati utilizzati n=5 topi per condizione. f BLI vivo seriale di topi NSG innestati con metastasi C4-2B e trattati con una singola iniezione endovenosa di 5 × 106 cellule T non trasdotte o cellule T CAR T STEAP1-BBζ con rapporti CD4/CD8 normali il giorno 0. La X rossa indica topi deceduti. Viene mostrata una scala di radianza. g Grafico che mostra la quantificazione del flusso totale nel tempo dal BLI live di ciascun topo in (f). Per i pannelli (f, g) sono stati utilizzati n=4 topi nel gruppo di cellule T non trasdotte e n=5 topi nel gruppo di cellule T CAR T STEAP1-BBζ. h Quantificazione delle cellule T CAR CD3+ EGFRt+ STEAP1-BBζ mediante citometria a flusso da splenociti di topi trattati con cellule T CAR STEAP1-BBζ (n=4) alla fine dell'esperimento il giorno 49. Le barre rappresentano la media. Per il pannello (a), è stata utilizzata l'ANOVA a due vie con il test di confronto multiplo di Sidak. I dati di origine sono forniti nel file dei dati di origine.

Gli studi sulle cellule T CAR T STEAP1 mouse-in-mouse dimostrano l’efficacia terapeutica antitumorale

L'attivazione e l'attività citolitica delle cellule T CAR T STEAP1- BBζ osservate nel contesto di densità antigenica STEAP1 molto bassa (~ 1500 molecole / cellula) della linea cellulare PC3 (Fig. 2g-i, Fig. 11a, b supplementare ) e l'evidenza di attività antitumorale in vivo in un modello di tumore PC3-fLuc disseminato (Figura 11c–e supplementare) ha presentato preoccupazioni circa il potenziale di tossicità fuori dal tumore sul bersaglio. Per valutare la potenziale tossicità in un organismo modello trattabile, abbiamo generato un topo umano knock-in per STEAP1 (hSTEAP1-KI) in cui il gene umano STEAP1 è stato knock-in nel locus del gene Steap1 del topo sullo sfondo C57Bl/6 ( Figura 4a). È stata stabilita una colonia di topi con la genotipizzazione eseguita mediante reazione a catena della polimerasi (PCR) del DNA della coda (Fig. 4b). Sia i topi hSTEAP1-KI omozigoti che eterozigoti non hanno mostrato anomalie fenotipiche o riproduttive apparenti rispetto ai compagni di cucciolata di tipo selvatico. Un'indagine tissutale per l'espressione umana di STEAP1 basata sulla PCR quantitativa di trascrizione inversa (qRT-PCR) è stata eseguita su topi eterozigoti maschi e femmine hSTEAP1-KI (hSTEAP1-KI/ +) e ha rivelato la massima espressione relativa nella prostata, seguito dall'utero e dalla ghiandola surrenale (Fig. 4c). Ulteriori analisi in situ da parte di STEAP1 IHC della prostata maschile hSTEAP1-KI/ + e delle ghiandole surrenali hanno rivelato un'espressione umana di STEAP1 confinata alle cellule epiteliali luminali della prostata (Fig. 4d) e un'espressione nella corteccia surrenale (Fig. 4e) . Una versione murinizzata del CAR STEAP1, chiamata STEAP1-mBBζ CAR, in cui lo spaziatore scFv e IgG4 cerniera-CH2-CH3 sono stati mantenuti ma il dominio transmembrana CD28, dominio costimolatorio 4-1BB e il dominio di attivazione CD3ζ sono stati sostituiti con i loro ortologhi di topo clonati in un costrutto gammaretrovirale (Fig. 4f). Inoltre, il marcatore di trasduzione dell'EGFRt umano è stato sostituito con un CD19 di topo troncato (mCD19t) per ridurre al minimo la potenziale immunogenicità. Abbiamo confermato l'efficiente trasduzione retrovirale delle cellule T arricchite da splenociti di topo (Fig. 4g) e dimostrato la capacità delle cellule T CAR T di topo STEAP1-mBBζ di indurre la citolisi della linea cellulare di cancro alla prostata di topo RM956 progettata per esprimere STEAP1 umano (RM9- hSTEAP1) mediante trasduzione lentivirale (Fig. 4h). L'efficacia in vivo delle cellule T CAR T di topo STEAP1-mBBζ è stata convalidata in un modello di tumore RM9-STEAP1-fLuc disseminato nei topi NSG (Figura 12a supplementare). Una settimana dopo l'iniezione nella vena della coda di cellule RM9-STEAP1-fLuc, i topi sono stati trattati con cellule T di topo 5 × 106 non trasdotte o cellule T CAR di topo STEAP1-mBBζ mediante iniezione nella vena della coda . I topi che hanno ricevuto cellule T di topo non trasdotte hanno dimostrato una progressione incontrollata della malattia, mentre quelli trattati con cellule T CAR T STEAP1-mBBζ hanno mostrato uniformemente una rapida regressione della malattia seguita da una successiva ricaduta dieci giorni dopo (Figura 12b, c supplementare). La terapia con cellule T CAR T STEAP1-mBBζ è stata associata a un beneficio di sopravvivenza statisticamente significativo (22 giorni contro 12 giorni, p=0.0039 mediante log-rank test, Figura 12d supplementare). La perdita di peso era evidente in entrambi i gruppi di trattamento poiché il carico tumorale aumentava prima della morte (Figura 12e, f supplementare). L'analisi degli splenociti di topo raccolti alla necroscopia ha mostrato la persistenza periferica delle cellule T CAR STEAP1-mBBζ con il rilevamento di cellule mCD3+ mCD19t+ fino a 24 giorni dopo il trasferimento adottivo (Figura 12g supplementare). I polmoni sono stati raccolti da topi in entrambi i gruppi di trattamento e l'IHC STEAP1 ha mostrato una perdita di espressione di STEAP1 nelle metastasi polmonari di topi trattati con cellule T CAR T STEAP1-mBBζ (Figura 12h supplementare). Successivamente abbiamo espanso le linee clonali RM9-STEAP1-fLuc per determinare se la fuga dell'antigene tumorale osservata potesse essere il risultato di un'eterogeneità preesistente nell'espressione di STEAP1. L'esperimento è stato ripetuto con un modello di tumore fLuc clonale e disseminato RM9-STEAP1- nei topi NSG (Figura 13a supplementare). In questo contesto, i topi trattati con cellule T CAR STEAP1-mBBζ hanno dimostrato una risposta completa rapida e duratura (Figura 13b-d supplementare). Questi risultati evidenziano la potenza delle cellule T CAR T STEAP1-mBBζ nell'eradicazione del cancro alla prostata STEAP1+ e suggeriscono inoltre che potrebbero essere necessarie strategie terapeutiche aggiuntive per superare la resistenza nei sottogruppi di pazienti con cancro alla prostata avanzato in cui l'eterogeneità di STEAP1 l'espressione è presente (Fig. 1e).

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La terapia con cellule T CAR T STEAP1 è sicura in un modello murino umanizzato STEAP1

Per studiare sia la sicurezza preclinica che l'efficacia della terapia con cellule CAR T STEAP1-mBBζ CAR, abbiamo inoculato topi maschi eterozigoti hSTEAP1-KI con RM singenico e non clonale9-STEAP{{4} }cellule fLuc mediante iniezione nella vena della coda (Fig. 5a). Dopo la conferma della colonizzazione metastatica da parte del BLI circa una settimana dopo, i topi hanno ricevuto ciclofosfamide 100 mg/kg precondizionati mediante iniezione intraperitoneale57. Il giorno dopo, i topi sono stati randomizzati al trattamento con cellule T di topo non trasdotte 5 × 106 o con cellule T CAR di topo STEAP1-mBBζ mediante iniezione nella vena della coda. Tutti i topi che hanno ricevuto cellule T CAR T di topo STEAP1-mBBζ hanno dimostrato una diminuzione del carico tumorale entro la prima settimana dall'inizio del trattamento in base al BLI (Fig. 5b, c). La risposta osservata è stata di breve durata ma ha portato a una modesta estensione della sopravvivenza (21 giorni contro 12 giorni, p=0.0138 mediante log-rank test, Fig. 5d), simile ai risultati del RM non clonale 9-STEAP1-esperimenti fLuc nei topi NSG (Figura 12d supplementare). Non sono state riscontrate tossicità evidenti o morti premature specificamente associate alla terapia con cellule CAR T STEAP1-mBBζ nel topo a questo livello di dose in cui è stata osservata una chiara evidenza di efficacia antitumorale. La perdita di peso è stata associata ad un aumento del carico tumorale ma comune a entrambi i bracci di trattamento (Fig. 5e, f). Per valutare ulteriormente la potenziale tossicità della terapia con cellule CAR T STEAP1-mBBζ, un esperimento simile è stato eseguito in parallelo su topi eterozigoti hSTEAP1-KI portatori di tumori RM9-hSTEAP1 e senza tumori. Topi non portatori di tumore trattati con cellule T non trasdotte o cellule T CAR T STEAP 1- mBBζ non hanno dimostrato alcuna differenza nella sopravvivenza (Figura 14a supplementare) o tossicità grossolana inclusa la perdita di peso corporeo (Figura 14b supplementare). Poiché STEAP1-BBζ CAR è costituito da uno spaziatore IgG4 modificato che potrebbe essere potenzialmente immunogenico, abbiamo valutato la risposta di un anticorpo antiumano di topo (MAHA) raccogliendo sanguinamenti retroorbitari dai topi in questo esperimento. Nessun anticorpo IgG e IgM antiumano è stato rilevato nei sieri dei topi al giorno 8 dopo il trattamento con cellule T CAR T STEAP1-BBζ (Figura 14c supplementare).

È importante sottolineare che i topi eterozigoti hSTEAP1-KI trattati con cellule T CAR STEAP1-mBBζ non hanno dimostrato alcuna evidente disgregazione dei tessuti o aumento dell'infiltrazione di cellule T CD3+ nella prostata (Figura 15a, b supplementare ) o ghiandola surrenale (Figura 15c, d supplementare) rispetto alle loro controparti trattate con cellule T non trasdotte, suggerendo l'assenza di tossicità fuori dal tumore sul bersaglio. I polmoni raccolti alla fine dell'esperimento hanno mostrato espressione umana di STEAP1 nelle metastasi polmonari RM9-hSTEAP1 con eterogeneità regionale nei topi trattati con cellule T di topo non trasdotte (Fig. 5g). D'altra parte, i tumori dei topi trattati con cellule T CAR T di topo STEAP1-mBBζ hanno dimostrato nuovamente un'assenza di espressione di STEAP1 umana (Fig. 5h). Per valutare se la terapia con cellule CAR T murine STEAP1- mBBζ e la perdita di antigene umano STEAP1 possano avere un impatto anche sulla presentazione dell'antigene nei tumori RM9-hSTEAP1, abbiamo eseguito l'IHC per la beta-2-microglobulina murina (B2m ) che è un componente chiave delle molecole MHC di classe I. Abbiamo osservato una significativa downregulation dell'espressione di B2m nei tumori progressivi dopo il trattamento con cellule T CAR T di topo STEAP1-mBBζ rispetto alle cellule T non trasdotte (Figura 15e, f supplementare), coerente con i nostri risultati nel modello 22Rv1.

Figura 4|Creazione di un sistema mouse-in-mouse con un modello murino umano STEAP1 knock-in (hSTEAP1-KI) e STEAP1 CAR murinizzato. a Schema che mostra la strategia di ricombinazione omologa utilizzando un vettore di targeting per inserire gli esoni STEAP1 umani 2–5 nel locus Steap1 del topo sullo sfondo C57Bl/6. Obiettivo di riconoscimento FRT Flippase. b Visualizzazione dei prodotti della PCR dalla genotipizzazione della punta della coda di topi wildtype (+/+), eterozigoti (KI/+) o omozigoti (KI/KI) utilizzando coppie di primer destinate ad amplificare porzioni di alleli wildtype o hSTEAP1-KI . Controllo modello NTC null. Immagine rappresentativa del gel da n=3 esperimenti biologicamente indipendenti. c qPCR per l'espressione umana di STEAP1 normalizzata all'espressione di 18 S in un'indagine di tessuti di topi hSTEAP1-KI/+. n=3 per gli organi specifici del sesso e n=6 per gli organi comuni. Le barre rappresentano la media con SEM. Micrografie fotografiche della colorazione IHC STEAP1 di (d) tessuti prostatici di topi KI/+ (sinistra) +/+ e (destra) e (e) una ghiandola surrenale di un topo KI/+. Barre della scala=50 µm. Per il pannello (d, e) l'immunocolorazione STEAP1 è stata eseguita su n=3 campioni biologicamente indipendenti. f Schema del costrutto STEAP1 CAR murinizzato retrovirale. Virus della leucemia murina MuLV, CD19 troncato di topo mCD19t. g Quantificazione dell'efficienza della trasduzione retrovirale di cellule T di topo attivate da tre esperimenti indipendenti basati sulla frequenza delle cellule CD3+ CD19t+ di topo mediante citometria a flusso (p {{40}}.0003). h Vitalità cellulare relativa delle cellule bersaglio RM9 o RM9-hSTEAP1 nel tempo, misurata mediante imaging a fluorescenza di cellule vive dopo co-coltura in un rapporto 1:1 con cellule T CAR T di topo STEAP1-mBBζ o cellule T non trasdotte (p<0,0001). n=4 repliche biologiche per condizione. Le barre di errore rappresentano la media con SEM. Per il pannello (g), è stato utilizzato il test t di Student a due code non accoppiato con la correzione di Welch. Nel pannello (h), è stata utilizzata l'ANOVA a due vie con il test di confronto multiplo di Sidak. I dati di origine sono forniti nel file dei dati di origine.

Figura 5|Determinazione dell'efficacia e della sicurezza delle cellule T CAR T di topo STEAP1-mBBζ in topi hSTEAP1-KI portatori di cancro alla prostata singenico e disseminato.

La citochina di fusione del dominio di legame del collagene-IL-12 suscita risposte antitumorali attraverso la segnalazione potenziata del recettore delle cellule T e la presentazione dell'antigene

IL{{0}} è una citochina eterodimerica costituita da subunità p40 e p35 che regola le risposte delle cellule T e porta alla produzione di IFN-. Risposte antitumorali sorprendenti associate alla somministrazione sistemica di IL-12 sono state dimostrate in diversi modelli preclinici58,59, ma la traduzione di questo approccio terapeutico nella pratica clinica si è bloccata a causa di tossicità e inefficacia dose-limitanti60-63. Strategie alternative per aggirare questi problemi mirano a localizzare l'IL{{10}} nei tumori, attraverso il rilascio intratumorale o ingegnerizzando proteine ​​di fusione dell'IL-12 per sfruttare le proprietà uniche del microambiente tumorale. Un approccio recentemente descritto è la fusione con il dominio del fattore von Willebrand A3 che funge da dominio di legame del collagene (CBD, Fig. 6a) e consente il legame delle proteine ​​di fusione al collagene esposto nella vascolarizzazione tumorale disordinata64. È stato dimostrato che la terapia sistemica con CBD-IL-12 rimodella i microambienti tumorali di modelli di cancro al seno e melanoma murini immunologicamente "freddi" attraverso una migliore segnalazione dell'IFN e coopera con gli anti-PD{{20}} inibizione del checkpoint immunitario per indurre l'eradicazione del tumore65. Abbiamo chiesto se il CBD-IL-12 potesse essere efficace nel convertire il cancro alla prostata da "freddo" a "caldo" e nell'indurre risposte antitumorali. Tumori sottocutanei, singenici RM9 e Myc-CaP sono stati individuati rispettivamente in topi maschi C57Bl/6 e FVB e i topi sono stati randomizzati al trattamento con veicolo, anti-PD-1 o CBD-IL-12 . La somministrazione sistemica di CBD-IL-12 ha indotto una significativa inibizione della crescita tumorale in entrambi i modelli di tumore singenico RM9 e Myc-CaP che altrimenti rispondevano scarsamente alla terapia anti-PD-1 (Fig. 6b, Fig. 16a supplementare) . Per ottenere ulteriori informazioni sui meccanismi d'azione del CBD-IL-12, abbiamo eseguito l'analisi RNA-seq (scRNA-seq) a cellula singola di tumori RM9 di topi trattati con veicolo o CBDIL-12. I grafici di approssimazione e proiezione del collettore uniforme hanno rivelato una sostanziale riduzione dei compartimenti epiteliali, fibroblastici e cellulari endoteliali del tumore (Figura 16b supplementare) coerente con l'attività antitumorale. La profilazione basata su marcatori di sottoinsiemi di cellule immunitarie innate e adattive (Fig. 6c,d) nei dati scRNA-seq ha identificato un aumento sostanziale delle cellule T CD8+ (7,55 vs 0.76%) , cellule con presentazione incrociata dell'antigene tra cui XCR1+ IRF8+ cellule dendritiche convenzionali di tipo 1 (cDC1, 1,33 vs. 0%), CD86+ INOS2+ macrofagi polarizzati M1 ( 2,26 vs 0%) e monociti/macrofagi CD64+ F4/80+ (29,2 vs 4,43%) nei tumori del gruppo di trattamento CBDIL-12 rispetto al gruppo di controllo con veicolo. Una riduzione dei macrofagi immunosoppressori polarizzati CD163+ CD206+ M2 (0 vs. 0,25%) e dei neutrofili Ly6G+ (0,52 vs. 1,08%) è stata associata anche alla terapia con CBD-IL-12. L'analisi IHC ha confermato che i tumori RM9 trattati con il veicolo generalmente mancavano di cellule T CD8+ mentre quelli trattati con CBD-IL-12 mostravano un'infiltrazione visibilmente significativa di cellule T CD8+ (Figura 16c supplementare) . Le cellule tumorali hanno dimostrato un'espressione arricchita delle subunità del proteasoma e dell'immunoproteasoma Psmb8 e Psmb9 e dei geni del complesso maggiore di istocompatibilità di classe I (MHC I) H2-K1, H2-D1 e B2m, in linea con la sovraregolazione dell'elaborazione dell'antigene e macchinari di presentazione (Fig. 6e, Figura supplementare 16d). Parallelamente, le cellule T hanno mostrato una maggiore espressione genica associata alla segnalazione del recettore delle cellule T e alle interazioni immunoregolatorie tra una cellula linfoide e una cellula non linfoide (Fig. 6f, Fig. 16e supplementare). Le cellule del sistema fagocitico mononucleare (MPS) hanno mostrato un'espressione genica arricchita correlata all'elaborazione e alla presentazione incrociata dell'antigene, nonché alla segnalazione delle citochine (Figura 16f, g supplementare). Questi studi hanno stabilito l'attività antitumorale del CBD-IL- 12 in modelli di cancro alla prostata attraverso la riprogrammazione del microambiente tumorale e il coinvolgimento del sistema immunitario innato e adattivo.

Miglioramento del controllo del tumore con la terapia concomitante con cellule T STEAP1-mBBζ CAR e CBD-IL-12

Successivamente abbiamo ipotizzato che l'ampliamento della risposta immunitaria antitumorale con la terapia con CBD-IL-12 potrebbe migliorare l'efficacia terapeutica della terapia con cellule T CAR T STEAP1-mBBζ nel cancro della prostata combattendo l'eterogeneità dell'antigene tumorale e recuperando l'elaborazione dell'antigene e presentazione. Abbiamo quindi stabilito metastasi singeniche e non clonali RM9-STEAP1-fLuc in topi maschi eterozigoti hSTEAP1-KI e randomizzati al trattamento con 5 × 106 cellule T di topo non trasdotte o cellule T CAR di topo STEAP1-mBBζ mediante iniezione nella vena della coda con o senza terapia settimanale con CBD-IL-12 mediante iniezione nel seno retroorbitario. I gruppi che hanno ricevuto la terapia CBD-IL-12 da sola o in combinazione con la terapia STEAP1-mBBζ CAR T non hanno ricevuto ciclofosfamide linfodepletante (Fig. 7a). BLI seriali hanno rivelato una rapida progressione della malattia nei topi trattati con cellule T non trasdotte e CBD-IL-12 mentre quelli che hanno ricevuto cellule T STEAP1-BBζ CAR in combinazione con la terapia CBD-IL-12 hanno dimostrato un significativo ritardo nella progressione del tumore (Fig. 7b, c). È importante sottolineare che il trattamento combinato con cellule T CAR T di topo STEAP1- mBBζ e CBD-IL settimanale-12 è stato associato a un'estensione statisticamente significativa della sopravvivenza globale rispetto a tutti gli altri gruppi di trattamento (Fig. 7d). L'analisi delle citochine plasmatiche sui sanguinamenti retroorbitari raccolti al giorno 0 e al giorno 8 di trattamento ha mostrato un aumento significativo dei livelli di citochine proinfiammatorie IFN-, TNF-, IL-6 e IL-4 (Fig. 7e, Figura supplementare . 17) nei topi trattati con cellule T CAR STEAP1-mBBζ e CBD-IL-12. I tumori residui sono stati raccolti durante la necroscopia e l'IHC STEAP1 ha mostrato una perdita di antigene nei tumori di topi trattati con cellule T CAR T STEAP1- mBBζ da sole e in combinazione con CBD-IL-12 (Fig. 8a). Inoltre, abbiamo osservato un aumento dell'espressione tumorale B2m (Fig. 8a) associato alla terapia con CBD-IL-12. Anche le cellule T CD3+ erano aumentate (Fig. 8b) in condizioni tumorali sottoposte a terapia con IL-12 ma, sebbene fosse apprezzabile una tendenza, non abbiamo riscontrato un aumento statisticamente significativo delle cellule T intratumorali tra i Gruppi di trattamento STEAP1-mBBζ CAR T cell e gruppi di trattamento combinati STEAP1-mBBζ CAR T cell e CBD-IL-12. Sono stati analizzati i tumori residui, compresi quelli provenienti da topi trattati con cellule CAR T STEAP1-mBBζ CAR e CBD-IL-12, raccolti alla risposta massima al trattamento (nadir) al giorno 10 e agli endpoint compassionevoli per la progressione del tumore (recidiva). dissociati a singole cellule e sottoinsiemi di cellule immunitarie sono stati caratterizzati mediante citometria a flusso multiparametrica (Figura 18 supplementare). In concordanza con i nostri risultati scRNA-seq, il trattamento con CBD-IL-12 da solo o in combinazione con cellule T CAR STEAP1-mBBζ ha portato a un aumento significativo di CD11b+ Ly6C-/+F4/{{68 }} Macrofagi MHC-II + (Fig. 8c, d, Figura 19a supplementare). Le cellule CD11b+ Ly6CF4/80+ MHC-II+ rappresentano macrofagi maturi presentanti l'antigene66 e questa popolazione è stata preferenzialmente arricchita e ha dimostrato un aumento dell'espressione indotta dell'ossido nitrico sintasi (iNOS) come marcatore della polarizzazione proinfiammatoria M1 con CBD-IL{{84} } terapia. Abbiamo anche osservato un'espansione della popolazione cDC1 e una riduzione della popolazione convenzionale di cellule dendritiche di tipo 2 (cDC2) (Fig. 8e, Figura 19b supplementare). cDC1 è stato implicato nell'attivazione delle cellule T citotossiche antitumorali CD8+ e nei potenziali meccanismi di resistenza terapeutica. Non abbiamo trovato alcun segno di migrazione cellulare verso il tumore mentre le cDC2 sono importanti per l'attivazione di una differenza significativa nei rapporti tra KLRG1+ e KLRG1- natural killer delle cellule T CD4+ comprese le cellule Tregs67 . Coerentemente con i risultati di cDC2, cellule nei gruppi di trattamento (Figura 19d supplementare). La profilazione delle frequenze delle Treg CD4+ FOXP3+ ha rivelato una diminuzione delle Treg associate- di F40/80+ Gli eosinofili SiglecF+ sono aumentati mentre Ly6G+ neutralizza con la terapia con CBD-IL-12 (supplementare Figura 19c). È interessante notare che i trofili sono diminuiti con l'aggiunta di CBD-IL-12 a STEAP1-, abbiamo osservato che nei tumori recidivanti dopo la terapia combinata con cellule T CAR T STEAP1-mBBζ mBBζ (Fig. 8f, G). In particolare, nella frequenza di queste terapie con cellule CAR T e CBD-IL-12 si è verificata una diminuzione di cDC1 e i neutrofili associati al tumore sono aumentati con il trattamento con un aumento di Treg, implicando un ridotto priming di CD8 citotossico STEAP{{120 }}cellule T CAR mBBζ rispetto alle cellule T non trasdotte (54 rispetto a cellule T e arricchimento della segnalazione Treg immunosoppressiva pari al 34%), diminuite in condizioni con terapia CBD-IL-12, ma aumentate in caso di recidiva del tumore dopo STEAP combinato Terapia con 1-mBBζ CAR T cell e CBD-IL-12 (dal 19 al 42%). Questi risultati suggeriscono che le proprietà immunosoppressive dei neutrofili associati al tumore possono svolgere un ruolo importante nel mediare la resistenza al trattamento e la progressione del tumore. Nel complesso, queste analisi indicano che il trattamento con CBD-IL-12 riporta l'ambiente tumorale immunosoppressore ostile a uno stato pro-infiammatorio e amplia l'attività antitumorale in combinazione con la terapia con cellule T CAR T STEAP1-mBBζ trasferita adottivamente. Abbiamo ulteriormente eseguito l'analisi del repertorio TCR utilizzando il sequenziamento della catena beta TCR basato su PCR multiplex68 su tumori polmonari raccolti da ciascun gruppo di trattamento alla necroscopia. Abbiamo osservato una diminuzione significativa della clonalità Simpson nei campioni di topi trattati con CBD-IL-12 da solo e in combinazione con la terapia con cellule T CAR T STEAP1-mBBζ, indicativa di un aumento della diversità delle cellule T intratumorali (Fig. 8h). Questi risultati stabiliscono che l'aggiunta di CBD-IL-12 in aggiunta alla terapia con cellule T CAR STEAP1 può essere utile attraverso il rimodellamento del microambiente tumorale del cancro alla prostata, migliorando l'elaborazione e la presentazione dell'antigene e coinvolgendo l'immunità dell'ospite per promuovere la diffusione dell'epitopo.

Figura 6|La terapia sistemica di fusione di citochine con dominio legante il collagene IL-12 (CBD-IL-12) inibisce la crescita del tumore del cancro alla prostata e riprogramma il microambiente immunitario del tumore. uno schema di CBD-IL-12, composto dalle subunità p35 e p40 fuse al CBD dal dominio del fattore di von Willebrand A3. b Volumi di tumori sottocutanei RM9 in topi singenici C57Bl/6 nel tempo con trattamento con veicolo, anti-PD-1 (clone 29 F.1A12) 200 Μg mediante iniezione intraperitoneale ogni 5 giorni, o CBD-IL-12 25 Μg mediante iniezione endovenosa ogni 5 giorni a partire dal giorno 0. n=7 topi nei gruppi trattati con veicolo e CBD-IL-12 e n=8 topi nei gruppi trattati con anti -Gruppo trattato con PD1. p <0,0001 nei giorni 9 e 12. Le barre rappresentano la media con SEM. I valori P sono derivati ​​dall'ANOVA a due vie con il test dei confronti multipli di Dunnett, ns non significativo. c Grafici UMAP (Uniform Manifold Approssimation and Projection) di diversi sottoinsiemi di cellule immunitarie (in alto) dall'analisi RNA-seq (scRNA-seq) su singola cellula di cinque tumori RM9 ciascuno aggregato da topi trattati con veicolo o CBD-IL{{41} }. Grafici UMAP colorati con l'espressione genica di marcatori specifici del sottoinsieme di cellule immunitarie per pan-monociti/macrofagi, macrofagi polarizzati M1 e M2, cellule dendritiche convenzionali di tipo 1 (cDC1), cellule natural killer (NK) e T helper di tipo 1 (Th1) cellule. d Grafici che mostrano la frequenza di specifiche popolazioni di cellule immunitarie (rispetto alle cellule immunitarie CD45 +) identificate mediante analisi scRNA-seq, comprese le cellule T CD4+ e CD8+, Th1 (Infg+ Tbx{ {56}} ) e cellule Th2 (cMAF+ Gata3+ ), monociti/macrofagi Ly6C+/− (Ly6C+/− Adgre1+ ), macrofagi M1 (CD80+ CD{{67} } INOS2+ ), macrofagi M2 (CD163+ Mrc1+ cMAF+ ), cDC1 (XCR1+ IRF8+ ), cellule dendritiche convenzionali di tipo 2 (cDC2 , CD1+ IRF4+ ), cellule dendritiche CD103+ migratorie (Itgae+ ), eosinofili (SiglecF+ ), neutrofili (Ly6G+) e cellule NK (Klrb1c+ Ncr1+ ) nei tumori trattati con veicolo o CBDIL-12. I grafici di Volcano mostrano l'espressione genica differenziale in (e) cellule tumorali e (f) cellule T di tumori RM9 di topi trattati con CBD-IL-12 rispetto a quelli trattati con il veicolo. Modifica della piega FC, tasso di false scoperte FDR. I dati di origine sono forniti nel file dei dati di origine.

Discussione

L’efficacia della terapia con cellule CAR T e di altre terapie mirate basate sul sistema immunitario dipende fortemente dall’espressione coerente dell’antigene su tutte o sulla maggior parte delle cellule che compongono la popolazione tumorale all’interno di un singolo paziente. Tuttavia, l’eterogeneità dell’antigene è pronunciata nei tumori solidi compreso il cancro alla prostata, dove la progressione verso mCRPC e la resistenza al trattamento sono associati all’emergenza di sottotipi di malattia divergenti contrassegnati da distinti programmi trascrizionali-71 ed espressione dell’antigene sulla superficie cellulare. Sebbene la PSMA sia considerata uno dei principali biomarcatori del cancro alla prostata con una significativa sovraespressione riscontrata in tutto lo spettro della progressione della malattia, il nostro lavoro conferma i risultati di una recente pubblicazione14 che indica che l'espressione della PSMA è eterogenea nell'mCRPC letale. Mostriamo che STEAP1 è espresso in modo più ampio rispetto al PSMA in questo contesto, ma non è affatto espresso in modo uniforme ad alti livelli in tutti i tessuti mCRPC. Nessuna singola terapia mirata all’antigene, inclusa la terapia con cellule CAR T, può essere in grado di superare l’eterogeneità preesistente dell’antigene tumorale nell’mCRPC. Pertanto, è di fondamentale importanza accreditare in modo approfondito bersagli terapeutici aggiuntivi come STEAP1 in mCRPC che possono consentire terapie combinatorie che esercitano una pressione terapeutica insormontabile. Questi includono terapie con cellule CAR T con doppio antigene (ad es. PSMA e STEAP1) o strategie multimodali che combinano terapie con cellule CAR T con ADC, T-BsAb o altri trattamenti che promuovono potentemente l'uccisione del tumore antigene-indipendente e-dipendente. Abbiamo progettato una terapia con cellule CAR T mirate STEAP1- che è altamente antigene-specifica e ha localizzato funzionalmente l'epitopo riconosciuto dal CAR nel secondo ECD di STEAP1. Le nostre cellule T CAR T STEAP1-BBζ dimostrano una sostanziale attività antitumorale contro modelli multipli di cancro alla prostata disseminati sia negli studi sull'uomo che sul topo. È importante sottolineare che il nostro STEAP1-BBζ CAR è in grado di indurre l'attivazione delle cellule T e la citolisi delle cellule bersaglio anche in condizioni di bassa densità antigenica, come evidenziato dalla reattività contro il modello di cancro alla prostata PC3. Tuttavia, questa sensibilità delle cellule T CAR STEAP1-BBζ a bassi livelli di espressione di STEAP1 può essere vantaggiosa dal punto di vista del miglioramento dell’efficacia antitumorale, ma potrebbe anche accentuare le passività derivanti dalla tossicità non tumorale sul bersaglio. L'espressione sistemica di STEAP1 è stata precedentemente segnalata come praticamente assente nei tessuti umani normali18,72 ad eccezione della ghiandola prostatica dove è stata descritta l'espressione membranosa nelle cellule epiteliali della prostata27. Per approfondire la sicurezza della terapia con cellule T STEAP1-BBζCAR in ambito preclinico, abbiamo generato un modello murino umanizzato STEAP1. Il modello murino hSTEAP1-KI ha ricapitolato l'espressione umana di STEAP1 nella ghiandola prostatica e ha mostrato espressione nella corteccia surrenale. In modo rassicurante, la terapia con cellule T CAR T STEAP1-BBζ a una dose sufficiente a indurre attività antitumorale non ha portato a evidenti tossicità sistemiche nei topi hSTEAP1-KI, comprese tossicità on-target off-tumorali nei siti di STEAP1 umano espressione. Un meccanismo ricorrente di recidiva e progressione del cancro alla prostata dopo la terapia con cellule T CAR T STEAP1-BBζ nei nostri studi è stata la fuga dell'antigene tumorale. Da un lato, questa scoperta sottolinea la potenza complessiva della terapia con cellule T CAR T STEAP1-BBζ. Tuttavia, non è chiaro se la perdita dell'espressione tumorale di STEAP1 sia dovuta esclusivamente all'eterogeneità intrinseca dell'antigene tumorale o se vi sia anche una downregulation adattativa dell'espressione di STEAP1. Una recente pubblicazione ha mostrato che la metilazione del promotore di STEAP1 modula l'espressione di STEAP1 e la deregolamentazione epigenetica da parte della DNA metiltransferasi e l'inibizione dell'istone deacetilasi era sufficiente per sovraregolare significativamente l'espressione di STEAP173. Il trattamento con inibitori epigenetici in combinazione con la terapia con cellule T CAR STEAP1 potrebbe contemporaneamente migliorare l'espressione tumorale di STEAP1 e riprogrammare le cellule T CAR in stati di differenziazione favorevoli resistenti all'esaurimento74,75, mitigando così la perdita di antigene tumorale e migliorando l'efficacia antitumorale nel cancro alla prostata. Il nostro studio implica anche che STEAP1 svolga un ruolo funzionale nella regolazione della progressione del ciclo cellulare e del metabolismo cellulare nel cancro alla prostata. STEAP1 è unico rispetto agli altri membri della famiglia STEAP (STEAP2, 3 e 4) in quanto manca di un dominio ossidoreduttasi intracellulare22 necessario per l'attività della metalloreduttasi. Di conseguenza, gli omotrimeri STEAP1, ma non gli eterotrimeri con altre proteine ​​STEAP, non hanno la funzione enzimatica di ridurre Fe3+ a Fe2+ e Cu2+ a Cu1+. Se e come il coinvolgimento di STEAP1 negli ioni metallici e nel metabolismo cellulare promuova la progressione del cancro deve ancora essere determinato ed è meritevole di ulteriori indagini. Il microambiente tumorale immunologicamente “freddo” del cancro alla prostata rappresenta una delle principali barriere all’efficacia delle immunoterapie antitumorali. Ad esempio, studi esplorativi associati a uno studio clinico di fase I sulla terapia con cellule T PSMA CAR corazzate per esprimere il recettore del fattore di crescita trasformante dominante negativo (TGF R-DN) in mCRPC hanno mostrato che l'espressione di molecole di segnalazione immunosoppressive nel microambiente tumorale aumenta dopo l'infusione di CAR T13. Nei nostri studi, una scoperta fondamentale è stata l'associazione tra la perdita dell'espressione di STEAP1 e la downregulation dell'elaborazione e della presentazione dell'antigene, sia nelle cellule knockout STEAP1 che nei tumori con perdita di antigene STEAP1 dopo terapia con cellule T CAR T STEAP1-BBζ. Pertanto, la perdita dell’antigene STEAP1 nel cancro alla prostata promuove non solo la resistenza diretta alla terapia con cellule T CAR T STEAP1-BBζ, ma può anche limitare l’immunità antitumorale adattativa dell’ospite. La perdita dell'espressione dell'antigene bersaglio tumorale e la conversione in uno stato più immunosoppressivo con maggiore infiltrazione di Treg e maggiore espressione di molecole immunosoppressive è stata osservata anche in uno studio di fase I sulle cellule T CAR EGFR-vIII in partecipanti con glioblastoma ricorrente76. Sarà necessario ulteriore lavoro per comprendere i meccanismi funzionali alla base della perdita dell’antigene STEAP1 e più in generale come gli effetti dinamici della terapia adottiva con cellule CAR T possano contribuire alla perdita dell’antigene e all’immunoediting modulando le interazioni tumore-immuno-stroma nei tumori solidi.

Figura 7|La combinazione di CBD-IL-12 con la terapia con cellule CAR T STEAP1-mBBζ migliora la sopravvivenza generale e i livelli di citochine infiammatorie. uno schema dell'esperimento di provocazione tumorale per il modello disseminato RM9-hSTEAP1 nei topi hSTEAP1-KI/+ che studiano la combinazione di CBD-IL-12 con STEAP{{1{{18} }}}mBBζ Terapia con cellule CAR T. Ciclofosfamide (per il precondizionamento). Creato con BioRender.com. b BLI live seriale di topi hSTEAP1-KI/ + innestati con metastasi RM9-hSTEAP1- fLuc e trattati con una singola iniezione endovenosa di 5 × 106 topi non trasdotti Cellule T o cellule T CAR T STEAP1-mBBζ il giorno 0 con o senza trattamento con CBD-IL- 12 settimanale. La X rossa indica topi deceduti. Viene mostrata la scala della radianza. (c) Grafico che mostra la quantificazione del flusso totale nel tempo dal BLI vivo di ciascun topo in (b). d Curve di sopravvivenza di Kaplan-Meier dei topi in (b) con significatività statistica determinata dal test log-rank (Mantel-Cox) (p=0.002). e Grafici che mostrano i livelli sierici di citochine di IFN- (a sinistra, p=0.002) e TNF- (a destra, p < 0,0001) basati su test immunologici ProcartaPlex da sanguinamenti retroorbitari di topi hSTEAP1-KI/+ ( n=4 topi per gruppo) portatori di metastasi RM9-hSTEAP1-fLuc prima (giorno 0) e dopo il trattamento (giorno 8) con cellule T di topo non trasdotte o STEAP di topo{{38} }cellule T CAR mBBζ con o senza terapia con CBD-IL-12. La barra di errore rappresenta la media con SEM. Per il pannello (e), i valori p sono stati derivati ​​dall'ANOVA a due vie con il test di confronti multipli di Sidak. I dati di origine sono forniti nel file dei dati di origine.

Figura 8|La combinazione di CBD-IL-12 con la terapia con cellule CAR T STEAP1-mBBζ riprogramma il microambiente immunitario tumorale e promuove la presentazione dell'antigene e la diffusione dell'epitopo. a Microfotografie della colorazione IHC STEAP1 (in alto), B2m (al centro) e CD3 (in basso) di tumori polmonari RM9-hSTEAP1 dopo trattamento con cellule T murine non trasdotte o cellule T CAR STEAP1-mBBζ con o senza trattamento con CBD-IL-12. Barre della scala=50 µm. b Grafico a barre che mostra la quantificazione IHC delle cellule CD3 positive infiltranti i tumori polmonari metastatici (n=4 tumori per gruppo). ANOVA unidirezionale p=0.{{80}}021. La barra di errore rappresenta la media con SD. Grafici che mostrano le frequenze di (c) Ly6C− F4/{{20}} MHC-II+ (a sinistra, ANOVA unidirezionale p=0.00{ {98}}5) e Ly6C − F4/80+ iNOS2+ (destra, ANOVA unidirezionale p=0.0017) macrofagi, (d) Ly6C+ F4/ {{36} } macrofagi MHC-II+ (a sinistra, ANOVA unidirezionale p=0.0038) e Ly6C+ F4/80+ iNOS2+ (a destra, ANOVA unidirezionale p=ns) (e) CD11b+ XCR1+ cDC1 (ANOVA unidirezionale p=0.0003), (f) F4/80+ SiglecF+ eosinofili (ANOVA unidirezionale p=0. 0008) e (g) neutrofili Ly6G+ (ANOVA unidirezionale p=0.0035) normalizzati in cellule CD45+ totali come determinato mediante citometria a flusso multiparametrica dopo trattamento con cellule T non trasdotte, STEAP{{67 }}cellule T CAR mBBζ, cellule T non trasdotte e CBD-IL-12 e cellule T CAR STEAP1- cellule T CAR mBBζ e CBD-IL-12 alla massima risposta al trattamento (nadir) e recidiva del tumore (ricaduta). h Grafici a barre che rappresentano la clonalità di Simpson come misura di "uniformità" del repertorio TCR analizzato mediante sequenziamento TCRB su cellule infiltranti il ​​tumore raccolte da topi in (a). n=4 tumori per gruppo. I valori P per le cellule T non trasdotte + CBD-IL-12 rispetto alle cellule T non trasdotte e alle cellule T CAR STEAP1-mBBζ sono rispettivamente 0,008 e 0,02; e le cellule T CAR T STEAP1-mBBζ + CBD-IL-12 rispetto alle cellule T CAR T non trasdotte e STEAP1-mBBζ sono 0,004 e 0,01, rispettivamente. La barra di errore rappresenta la media con SD. Per i pannelli (c – g) n=3 tumori per gruppo, *p <0,05; **p <0,01, ***p <0,001, i valori p nei pannelli (b–h) provengono da ANOVA unidirezionale con il test di confronti multipli di Dunn. I dati di origine sono forniti nel file dei dati di origine.

Per ampliare la risposta antitumorale, abbiamo studiato la somministrazione sistemica di CBD-IL-12 in combinazione con la terapia con cellule T CAR T STEAP1-BBζ in un modello tumorale RM9-hSTEAP1 disseminato e singenico in hSTEAP 1-Topi KI per approssimare la natura immunosoppressiva dell'mCRPC sulla base della precedente caratterizzazione di RM9 come modello scarsamente immunogenico57,77. Il co-trattamento con CBD-IL12 ha portato a miglioramenti nella sopravvivenza globale, nella produzione di citochine, nella presentazione dell’antigene tumorale e nella diversità delle cellule T intratumorali coerenti con la diffusione dell’epitopo. Un'indagine approfondita del microambiente immunitario del tumore ha rivelato che l'aggiunta di CBD-IL-12 alla terapia con cellule T STEAP1-BBζ CAR T induce la reversione stromale del tumore e migliora i macrofagi attivati ​​e il cDC1 riducendo i neutrofili associati al tumore. Tuttavia, nei nostri studi non è stata raggiunta la cura e evidenziamo potenziali meccanismi compensatori e adattativi di resistenza e progressione del tumore, tra cui un aumento delle frequenze di neutrofili immunosoppressori e cDC2 che possono promuovere l'induzione di Treg. È importante notare che potrebbe essere necessaria un'ulteriore ottimizzazione della dose e del programma di somministrazione di CBD-IL-12 per massimizzare le risposte antitumorali. Tuttavia, questi risultati supportano lo studio di approcci immunoterapeutici combinatori come l'armatura delle cellule T CAR per esprimere citochine ricombinanti78 (ad esempio, IL-2, IL-12, IL-15 o IL{{24 }}), trattamento concomitante con immunomodulatori (ad esempio, anti-PD-1/PD-L1 o anti-CTLA4) o radioterapia diretta al tumore per rimodellare il microambiente tumorale del cancro alla prostata e migliorare la funzione effettrice delle cellule CAR T. Mentre questo manoscritto era in preparazione, uno studio condotto da un gruppo norvegese ha riportato lo sviluppo preclinico di una terapia con cellule T CAR STEAP1 con attività antitumorale in un modello sottocutaneo 22Rv1 in topi immunocompromessi79. Lo STEAP1 CAR riportato differisce dallo STEAP1-BBζ CAR in quanto incorpora un scFv sintetico chiamato Oslo1 e una cerniera CD8 e un dominio transmembrana. Un'altra caratteristica differenziante è che le cellule T CAR T STEAP1-BBζ sono preparate come un prodotto definito con un rapporto normale di cellule T CD4/CD8 mentre le cellule T CAR T Oslo1 STEAP1 non lo sono. Non sono stati riportati i meccanismi di resistenza e gli studi sulla sicurezza relativi alla terapia con cellule T CAR T Oslo1 STEAP1. Tuttavia, sarà interessante vedere come queste differenze nell'ingegneria CAR e nella composizione del prodotto cellulare possano influire sull'efficacia antitumorale, sulla persistenza e sulla sicurezza sia della terapia con cellule T CAR T Oslo1 STEAP1 che della nostra terapia con cellule T CAR T STEAP1-BBζ i programmi vengono tradotti in clinica. I risultati dei nostri studi hanno portato a una partnership con il programma Experimental Therapeutics (NExT) del National Cancer Institute (NCI) per tradurre la terapia con cellule T CAR T STEAP1-BBζ in un primo studio sull'uomo per uomini affetti da mCRPC. I segnali di sicurezza ed efficacia provenienti da questo studio clinico in fase iniziale aiuteranno a determinare se può essere utile studiare questo approccio terapeutico anche per altri tipi di cancro che esprimono altamente STEAP1.

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