Il targeting della lattato deidrogenasi A con la catechina resensibilizza le cellule tumorali gastriche SNU620/5FU al 5-fluorouracile, parte 2

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2.5. Il cotrattamento CA e 5Fu induce l'apoptosi mitocondriale dipendente da ROS

Poiché l'inibizione dell'LDHA aumenta direttamente il ROS mitocondriale e la perdita del suo potenziale di membrana, inducendo successivamente l'apoptosi[16,29], sono stati esaminati i fattori correlati all'apoptosi mitocondriale mediata da ROS. Il singolo trattamento CA o 5FU ha leggermente aumentato il livello di ROS mitocondriale nelle cellule SNU620/5FU quando misurato mediante citometria a flusso utilizzando MitoSOX. Tuttavia, il cotrattamento con CA e 5FU ha migliorato significativamente la produzione di ROS mitocondriali. Questa maggiore produzione di ROS è stata invertita da Mito-TEMPO, un antiossidante mirato ai mitocondri (Figura 5A-C). Anche l'inibizione della crescita dopo il trattamento con CA e 5FU è stata recuperata durante il trattamento con Mito-TEMPO nelle cellule SNU620/5FU (Figura 5D). Inoltre, l'apoptosi è stata valutata tramite la colorazione con annessina V-FITC/PI nelle cellule SNU620/5FU. Il cotrattamento con CA e 5FU ha aumentato il numero di cellule apoptotiche tra le cellule SNU620/5FU (Figura 6A, B). La frammentazione morfologica nucleare appare durante l'apoptosi e può essere osservata mediante colorazione 4',6-diamidino-2-fenilindolo(DAPI) [30,31]. È stato riscontrato che la frammentazione del DNA è aumentata significativamente nel gruppo di cotrattamento, rispetto a quella del gruppo di controllo (Figura 6C). Infine, sono stati esaminati i biomarcatori dell'apoptosi tra cui Bcl-2, Bax, Caspase-9, Caspase-3 e PARP. La cascata proapoptotica è aumentata dopo il cotrattamento con CA e 5FU nelle cellule SNU620/5FU (Figura 6D). Questi risultati suggeriscono che il cotrattamento con CA e 5FU induce l'apoptosi nelle cellule SNU620/5FU.

Figura 5. Il cotrattamento con catechina (CA) e 5- fluorouracile (5FU) aumenta la produzione di ROS mitocondriali: le cellule (A) SNU620/5FU sono state trattate con le concentrazioni indicate di CA, 5FU (10 μM) e Mito -TEMPO（20 μM） per 48 h. Il ROS mitocondriale delle cellule è stato misurato tramite analisi FACS utilizzando MitoSOXTM Red; (B) il grafico a barre mostra il tasso di cellule positive per la colorazione MitoSOX; (C) immagini di microscopia a fluorescenza (X100) di cellule SNU620/5FU colorate con MitoSOX sono stati presentati; (D) le vitalità delle cellule sono state misurate tramite il test MTT. I risultati sono mostrati come media ± SEM.*p<><0.001, and=""><0.001, compared="" to="" the="" respective="" control.="" the="" experiments="" were="" independently="" performed="" in="">

Figura 6. Aumento dell'apoptosi da parte del cotrattamento con catechina(CA) e 5-fluorouracile(5FU); Le cellule SNU620/5FU sono state trattate con CA （10 uM） e/o 5FU （10 μM） per 48 h∶（A） il numero di cellule apoptotiche è stato analizzato tramite analisi FACS utilizzando la colorazione PI-Annexin V; (B) il grafico a barre indica la percentuale di cellule nelle fasi apoptotiche precoci e tardive. I risultati sono mostrati come media ± SEM.**p<0.001, compared="" to="" the="" control;(c)="" the="" nuclei="" of="" the="" cells="" were="" stained="" with="" dapl,="" and="" fluorescence="" microscopic="" images="" were="" taken="" (x200).="" the="" white="" arrowhead="" indicates="" apoptotic="" cells.="" scale="" bar,="" 10="" um;="" (d)the="" expression="" levels="" of="" proteins="" related="" to="" the="" apoptotic="" pathway="" were="" measured="" by="" western="" blot="" analysis.="" the="" experiments="" were="" independently="" performed="" in="">

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3. Discussione

In questo studio, per caratterizzare e valutare la chemioresistenza al 5FU, abbiamo utilizzato cellule SNU620/5FU, che sono state stabilite dall'esposizione a lungo termine al 5FU con un incremento seriale della concentrazione del farmaco [32]. È stato riportato che le cellule parentali SNU620 ospitano un mutante p53 con una delezione omozigote nell'esone 5[33]. Sulla base di un microarray di DNA, diversi geni coinvolti nella chemioresistenza, tra cui timidilato sintetasi, proteina legante il DNA specifica del danno 2, clusterina e midchina, sono elevati nelle cellule SNU620/5FU [32]. Diversi studi precedenti hanno utilizzato la linea SNU620/5FUcell come modello per valutare l'efficacia in vitro dei farmaci contro la resistenza al 5FU attraverso l'antimitosi, l'attivazione dell'AMPK e la segnalazione del recettore dei cannabinoidi [34-36]. Tuttavia, le caratteristiche metaboliche ei livelli di espressione dei geni correlati al metabolismo nelle cellule SNU620/5FU e i loro ruoli nella chemioresistenza non sono stati ampiamente studiati.

Qui, abbiamo dimostrato che le cellule SNU620/5FU hanno fenotipi glicolitici avanzati, tra cui un'elevata produzione di lattato e l'espressione di enzimi correlati alla conversione del piruvato in lattato, come l'LDHA. La fosforilazione di PDHA1, che rappresenta la ridotta attività PDH da parte di PDK2 e PDK3 elevati, è aumentata anche nelle cellule resistenti a SNU620/5FU, rispetto a quella delle cellule madri SNU620. Tuttavia, l'OCR non è stato significativamente ridotto nelle cellule resistenti. Una possibile spiegazione di questa discrepanza è la plasticità nutritiva delle cellule tumorali per il ciclo del TCA, ovvero gli amminoacidi o l'acetil-CoA derivato dagli acidi grassi, non solo l'acetil-CoA derivato dal glucosio, potrebbero fornire substrati al ciclo del TCA [37] ].In correlazione con questo, le cellule del cancro gastrico resistenti al 5FU promuovono la staminalità attraverso l'ossidazione degli acidi grassi mitocondriali [38]. Inoltre, la resistenza al 5FU è stata correlata all'aumento della massa e dell'attività mitocondriale, inclusa l'espressione degli enzimi della catena di trasporto degli elettroni (ETC) e il consumo di ossigeno [39,40]. Pertanto, ci siamo concentrati sulla modulazione dell'LDHA per risensibilizzare la resistenza al 5FU. Sulla base dei nostri risultati, l'inibizione dell'attività dell'LDHA con ossamato o CA ha soppresso con successo la crescita delle cellule SNU620/5FU resistenti e le ha resensibilizzate al trattamento con 5FU. Questi risultati hanno mostrato una buona correlazione con quelli di studi precedenti, che hanno riportato che l'inibizione genetica o farmacologica dell'LDHA ha ridotto con successo la resistenza alla chemioterapia, incluso 5FU [19,41,42]. Pertanto, abbiamo ipotizzato che l'inibizione di LDHA potesse essere sufficiente per sopprimere la resistenza contro 5FU nelle cellule SNU620/5FU.

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Diverse molecole sintetiche, come ossamato, FX11, PSTMB e GNE-140 sono state stabilite come inibitori dell'LDHA a piccole molecole [11,43]. Tra questi, FX11 è stato segnalato come sensibilizzante alla chemioterapia in cellule tumorali resistenti [44]. Tuttavia, sebbene molti inibitori dell'LDHA siano sotto esame per l'approvazione come nuovi farmaci antitumorali, nessuno di essi è stato ancora approvato. Pertanto, sono necessari più candidati simili a farmaci per generare nuovi inibitori dell'LDHA [45]. I composti naturali sono stati considerati potenziali risorse per i farmaci antitumorali, in particolare per il superamento della chemioresistenza come terapia combinata [46,47]. Pertanto, prendere di mira il metabolismo del cancro, in particolare il metabolismo del glucosio con prodotti naturali di origine vegetale, è una tendenza di ricerca emergente per lo sviluppo di nuove terapie contro il cancro [48].

Inoltre, diversi rapporti hanno suggerito che i prodotti naturali, come il gossipolo, la galloflavina, la crocetina, la macchina A e l'EGCG, sono potenti inibitori dell'LDHA [43,49,50]. Sebbene tra questi, il gossipolo abbia la più potente azione inibitoria sull'LDHA (IC50=9.8 uM), inibisce anche l'attività dell'LDHB, che converte il lattato in piruvato [51]. I nostri risultati hanno dimostrato che l'EGCG, un inibitore consolidato dell'LDHA e un sensibilizzante alla chemioterapia con 5FU [22-25], esercita effetti inibitori sia sull'LDHA che sull'attività dell'LDHB. Tra gli inibitori dell'LDHA derivati ​​dal prodotto naturale che mostrano attività inibitorie specifiche dell'LDHA, come la macchina A(IC50 =84 μM）, la crocetina （IC50 =54.9 μM） e CA （IC{{13} }.69 μM）【49,50】, CA ha mostrato il miglior effetto soppressivo sull'attività LDHA rispetto al valore ICsn Sebbene le strutture chimiche di CA ed EGCG siano molto simili ad eccezione della parte aggiuntiva di acido gallico, le loro selettività inibitorie erano non è lo stesso. Inoltre, nonostante il CA sia il composto più semplice, rispetto ai suoi derivati, ha mostrato la migliore azione inibitoria sia sulla produzione di lattato che sull'attività di LDHA. Pertanto, dovrebbe essere condotto un ampio studio di relazione struttura-attività per dimostrare che il CA è un potenziale nuova spina dorsale per lo sviluppo di inibitori specifici e potenti di LDHA.

EGCG è noto che è un inibitore competitivo del NADPH. Inoltre, EGCG inibisce la traslocazione e la riproduzione della NADPH ossidasi [52-54]. Tuttavia, secondo i risultati della modellazione molecolare, CA ed EGCG sono strutturalmente localizzati in luoghi diversi (Figura 3A, B). Inoltre, non hanno mostrato la correlazione nella specificità nell'inibizione dell'attività di LDHA e LDHB, che utilizzano il NADH e NAD plus come cofattore, rispettivamente. Da questi dati, abbiamo ipotizzato che CA non abbia alcuna correlazione diretta con EGCG nel meccanismo di competizione con NAD(P)H. A proposito, l'inibizione dell'LDHA da parte di diversi inibitori, come FX11, GSK 2837808A, NCI-737 e NCI-006, ha ridotto la produzione di NADt e aumentato l'accumulo di NADH, diminuendo così il rapporto tra NAD più /NADH[16,17,55]. L'apoptosi indotta dalla via del danno al DNA p53/NAD-dipendente è anche aumentata dall'inibizione dell'LDHA utilizzando siRNA o un inibitore chimico, NH-2 [56]. La via di segnalazione GCN2-ATF4 è stata anche segnalata come un altro meccanismo responsabile della morte cellulare apoptotica indotta dall'inibitore LDHA, GSK 2837808A [17]. Poiché il rapporto NAD/NADH gioca un ruolo chiave nell'omeostasi redox e nella proliferazione cellulare [5758], il CA come inibitore di LDHA potrebbe influenzare le cellule tumorali resistenti al 5FU attraverso la modulazione del rapporto NAD più /NADH.

Morte cellulare indotta da CA in cellule SNU620/5FU resistenti a 5FU e SNU620 parentali. Tuttavia, la morte cellulare indotta da CA era LDHA dipendente dall'esaurimento dello shRNA nelle cellule SNU620/5FU. Inoltre, il cotrattamento di CA e 5FU ha mostrato ulteriori effetti antitumorali sulle cellule resistenti al 5FU. Come riportato in precedenza [16,59], l'inibizione di LDHA aumenta il ROS e di conseguenza sopprime la crescita delle cellule tumorali. Quando l'LDHA è stato inibito, il metabolismo energetico è stato convertito dalla glicolisi al ciclo TCA e alla fosforilazione ossidativa mitocondriale [60]. Pertanto, le cellule tumorali producono più ROS, con conseguente danno della membrana mitocondriale e apoptosi indotta dai mitocondri [61,62]. In buon accordo con studi precedenti, CA induce la morte cellulare apoptotica attraverso un percorso mitocondriale ROS-dipendente. L'aumentata capacità di difesa dei ROS e la riduzione dei segnali apoptotici sono proprietà comuni delle cellule tumorali chemioresistenti, specialmente nelle cellule resistenti al 5FU 3,63]. Inoltre, le alterazioni del metabolismo del cancro, in particolare del metabolismo del glucosio, portano anche a resistenza alla chemioterapia attraverso l'alterazione delle attività cellulari, come la riparazione aberrante del DNA, l'autofagia potenziata, l'apoptosi ridotta, la difesa contro i ROS e l'aumento della secrezione di esosomi [9,64,651 . Pertanto, prendere di mira gli enzimi glicolitici, incluso LDHA, con CA potrebbe essere una strategia alternativa per superare la chemioresistenza, specialmente nel cancro gastrico resistente al 5FU. In generale, i tumori maligni a rapida divisione sono altamente sensibili agli inibitori della sintesi del DNA, incluso il 5FU, rispetto al tessuto normale. Tuttavia, alcune cellule tumorali possono sviluppare resistenza al trattamento attraverso diversi meccanismi, come descritto in precedenza [34-36]. Il cotrattamento di composti bioattivi e la chemioterapia convenzionale ha un effetto maggiore, rispetto a un singolo composto, nel rallentare lo sviluppo della resistenza |66. Pertanto, gli effetti biologici di sostanze fitochimiche specifiche con comprovati effetti citotossici somministrati con la chemioterapia convenzionale per indirizzare una gamma più ampia di vie di segnalazione nelle cellule tumorali, compreso il metabolismo del cancro e le funzioni mitocondriali, dovrebbero essere superiori ai singoli composti nella gestione del cancro poiché possono ritardare lo sviluppo della resistenza [67]. In questo studio, la combinazione di CA e 5FU ha mostrato una maggiore inibizione della vitalità cellulare, rispetto a quella di un singolo trattamento. Inoltre, abbiamo dimostrato che l'inibizione dell'attività LDHA e la successiva apoptosi mitocondriale mediata da ROS potrebbero essere il meccanismo alla base dell'effetto sensibilizzante della CA sulle cellule resistenti al 5FU (Figura 7).

Oltre alla potenza e specificità dell'inibizione dell'LDHA, il CA è più sicuro degli inibitori dell'LDH derivati ​​da prodotti naturali precedentemente stabiliti. Inoltre, il CA è un noto ingrediente chimico del tè verde e la sua sicurezza e proprietà farmacodinamiche sono state confermate in studi precedenti [68-70]. Tuttavia, non è stata ancora condotta una valutazione precisa della tossicità della somministrazione concomitante di CA e 5FU. Inoltre, in questo studio non è stata esaminata l'efficacia in vivo della CA nelle cellule tumorali resistenti al 5FU. Tuttavia, studi precedenti riportano l'efficacia antitumorale in vivo del CA e dei suoi derivati ​​per superare la chemioresistenza, inclusa la resistenza al 5FU nel cancro gastrico e del colon umano [71-77]. In questo studio, ci siamo concentrati sull'inibizione dell'LDHA come uno dei principali meccanismi molecolari del CA per superare la resistenza al 5FU. Pertanto, per sviluppare la CA come nuovo adiuvante per le cellule tumorali chemioresistenti, l'efficacia in vivo e la sicurezza del cotrattamento CA e 5FU dovrebbero essere valutate attraverso ampi studi sugli animali, inclusi modelli di xenotrapianto e buone valutazioni della tossicità di laboratorio.

4. Materiali e metodi

4.1.Materiali

Gli anticorpi contro la poli(ADP-ribosio)polimerasi, la caspasi-3 e la caspasi-9 sono stati acquistati da Cell Signaling Technology (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA). Gli anticorpi contro LDHA, gliceraldeide 3-fosfato deidrogenasi (GAPDH) e PDHA1 sono stati acquistati da Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) e quelli contro fosforo-PDHA1 e PDK3 sono stati acquistati da Abcam ( Abcam, Cambridge, MA, USA). Inoltre, gli anticorpi contro PDK2 e PDK4 sono stati acquistati da Signalway Antibody (Signalway Antibody, Dallas, TX, USA), quelli contro PDK1 sono stati ottenuti da Enzo Life Sciences (Enzo Life Sciences, Farmingdale, NY, USA) e quelli contro B-cell il linfoma-2(Bcl-2) e la proteina X associata a Bcl-2-sono state acquistate da Novus Biologicals (Novus Biologicals, Littleton, CO, USA). MitoSOX è stato acquistato da Invitrogen (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Sostanze chimiche e reagenti, tra cui 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio bromuro (MTT),4',{22} }diamidino-2-fenilindolo, ossamato, nicotinamide adenina dinucleotide, CA e derivati ​​CA (EC GC, EGC e EGCG) sono stati acquistati da Merck (Merck, Darmstadt, Germania). -nicotinamide adenina dinucleotide (forma ossidata) è stata acquistata dalla Tokyo Chemical Industry (Tokyo Chemical Industry, Tokyo, Giappone).

4.2.Cultura cellulare

Il cancro gastrico umano SNU620, SNU620/5FU e AGS, il cancro del pancreas Panic-1 e MIA PaCa-2 e le cellule LS174T e RKO del cancro del colon sono stati ottenuti dalla Korean Cell Line Bank (KCLB, Seoul, Korea Le cellule ).SNU620, SNU620/5FU, AGS e LS174T sono state coltivate nel terreno 1640 del Roswell Park Memorial Institute (RPMI-1640)(Welgene, Daegu, Corea), integrato con il 10% di siero fetale bovino inattivato al calore (FBS). )(Gibco, New York, NY, USA) e l'1% di penicillina/streptomicina (Invitrogen), e le cellule Panc-1, MIA PaCa-2 e RKO sono state coltivate nel mezzo di Eagle modificato di Dulbecco (Welgene ) contenente il 10% di FBS termoinattivato e l'1% di penicillina/streptomicina. Tutte le cellule sono state coltivate in CO umidificata, incubatrice a 37 gradi e 5% di CO2.

4.3. Test di vitalità cellulare

I livelli di citotossicità di CA e 5FU nelle cellule SNU620 e SNU620/5FU sono stati misurati utilizzando un test MTT. Le cellule sono state coltivate in 24-piastre a pozzetti (2 × 104 cellule/pozzetto) con le concentrazioni indicate di CA e 5FU per il giorno indicato. La soluzione MTT (2,0 mg/mL) è stata quindi aggiunta a ciascun pozzetto, seguita da 3-4 h di incubazione a 37 gradi e 5% di CO, in un'incubatrice per colture cellulari. Il mezzo di coltura è stato successivamente rimosso e l'assorbimento dei cristalli di formazano è stato ottenuto da cellule vive. È stato aggiunto DMSO per dissolvere i cristalli di formazano ed è stato misurato a 540 nm utilizzando un lettore di micropiastre Spectramax M2 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA).

4.4. Tasso di acidificazione extracellulare (ECAR) e tasso di consumo di ossigeno (OCR)

ECAR e OCR, che indicano rispettivamente i tassi cellulari di glicolisi e fosforilazione ossidativa, sono stati monitorati con l'analizzatore Seahorse XF (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA), come descritto in precedenza [78,79]. In breve, 60,{3}} cellule SNU620 o SNU620/5FU per pozzetto sono state seminate in piastre a sei pozzetti Seahorse XF in terreno RPMI integrato con l'1% di penicillina/streptomicina. Dopo un'incubazione di 30 minuti, il terreno di ciascun pozzetto è stato sostituito con 80 ul di terreno privo di siero preriscaldato con ossamato 5 mM, un inibitore LDH standard [11]. Le cellule sono state quindi incubate a 37°C per 24 ore. Dopo l'incubazione, il mezzo di ciascun pozzetto è stato sostituito con 180 μL di mezzo XFbase preriscaldato (contenente 10 mM di glucosio, 2 mM di glutammina e 1 mM di piruvato di sodio; pH 7,4) per misurare ECAR e OCR. I risultati sono stati analizzati utilizzando il software Wave 2.6.0.31 (Agilent Technologies).

4.5.Quantitazionee Reazione a catena della trascrizione inversa-polimerasi (qRT-PCR)

L'RNA totale è stato estratto utilizzando il kit di estrazione dell'RNA totale RiboEx (GeneAll Biotechnology, Seoul, Korea) e il cDNA è stato sintetizzato utilizzando un kit di trascrittasi inversa (Promega, Madison, WI, USA). Nella trascrizione inversa, è stato utilizzato 1 ug di RNA totale , e la quantità totale di cDNA sintetizzato è 20 μL. Ciascun kit è stato utilizzato secondo le istruzioni del produttore. La PCR quantitativa è stata eseguita utilizzando un sistema StepOneTM Real-Time PCR (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA), con Real HelixgPCR Kit (NanoHelix, Daejeon, Corea), per 40 cicli costituiti da 15 s a 95 gradi C e 1 min a 60 gradi I livelli di mRNA relativi sono stati normalizzati ai livelli di RNA ribosomiale 18S, che fungeva da controllo endogeno Sequenze dei primer utilizzati per qRT-PCR sono elencati nella Tabella 1.

4.6. Analisi della macchia occidentale

Le cellule sono state lavate con 1 × PBS e le proteine ​​totali sono state estratte dalle cellule utilizzando il tampone RIPA e l'1% di tampone di lisi NP-40 contenente compresse di cocktail di inibitori della proteasi (Roche, Basilea, Svizzera). Ciascuna concentrazione di proteine ​​è stata misurata utilizzando il saggio proteico Bio-Rad. Uguali quantità di proteine ​​sono state frazionate da ciascun campione attraverso il 8-15 percento di SDS-PAGE, quindi le proteine ​​​​sono state trasferite su membrane di nitrocellulosa (GE Healthcare, Monaco, Germania) tramite elettroforesi. Le membrane sono state bloccate a temperatura ambiente (20-25 gradi) per 1 ora usando il 5% di latte in polvere senza grassi e incubate con anticorpi primari a 4 gradi durante la notte. Successivamente, queste membrane sono state lavate tre volte con 1× soluzione salina tamponata con Tris per 10 min. Bande specifiche di proteine ​​sono state misurate con un sistema di imaging a chemiluminescenza (ImageQuant LAS 4000; GE Healthcare). L'espressione delle proteine ​​è stata regolata da GAPDH. 4.7. Saggio di produzione di lattato

La produzione di lattato è stata misurata nei mezzi di coltura delle cellule SNU620, SNU620/5FU, AGS, Panc-1, MIA PaCa-2, LS174T e RKO. Queste cellule sono state incubate per 1 giorno a 37 gradi e il mezzo di coltura è stato successivamente sostituito con un mezzo privo di rosso fenolo, seguito da incubazione per 1 ora a 37 gradi. Il mezzo di ciascuna cellula è stato quindi valutato utilizzando un kit di analisi fluorometrico del lattato commerciale (BioVision, Milpitas, CA, USA).

4.8. Saggi di attività LDHA e LDHB

Per rilevare l'attività dell'LDHA, le concentrazioni indicate di CA sono state incubate per 20 min in un tampone contenente 2 mM di piruvato, 20 μM di NADH e 20 mM di HEPES-K plus (pH7,2). Per l'attività LDHB, è stato utilizzato un tampone contenente 1 M Tris-HCl(pH8.0), 25 mM NAD plus e 2 M sodio L-lattato. In breve, 10 nanogrammi di ciascuna delle proteine ​​ricombinanti purificate LDHA e LDHB sono stati utilizzati per i saggi di attività in vitro LDHA e LDHB. Un microgrammo di proteine ​​totali dai lisati cellulari è stato utilizzato per i test di attività intracellulare di LDHA e LDHB come fonte di enzimi. La fluorescenza del NADH a una lunghezza d'onda di eccitazione di 340 nm e una lunghezza d'onda di emissione di 460 nm è stata rilevata utilizzando uno spettrofluorimetro (Spectramax M2; Dispositivi molecolari), come precedentemente descritto [80]. L'attività di LDHA è stata misurata dalla quantità ridotta di NADH, mentre l'attività di LDHIB è stata valutata misurando la quantità di NADH convertita da NAD plus.

4.9.Interazione proteina-piccola molecola

L'interazione tra proteine ​​e piccole molecole è stata prevista utilizzando il programma Pyrex. Le molecole LDHA (PDB ID:1l10) e le strutture 2D di CA ed EGCG ottenute dal database dei composti NCBI PubChem sono state utilizzate in Pyrex. L'ID di CA era 9064 e quello di EGCG era 65064. La distribuzione relativa della carica superficiale è stata mostrata con la regione acida in rosso, la regione basica in blu e la regione neutra in bianco. I legami idrogeno nei complessi LDHA con CA o EGCG, rispettivamente, sono stati mostrati come linee tratteggiate nere. Le sequenze sono state ottenute da UniProt (https://www.uniprot.org, accesso il 9 novembre 2020) con numeri di accesso P00338(LDHA).

4.10.Trasfezione di RNA a forcina corta (shRNA)

Sono stati utilizzati il ​​mock-vector pLKO.1 e il vettore LDHA mirato a shRNA, come descritto in precedenza [50]. Le cellule sono state seminate su piastre a sei pozzetti (2 × 10 cellule/pozzetto) e incubate durante la notte. Le cellule SNU620/5FU sono state trasfettate utilizzando polietilenimmina (PED) (trasfezione Polyplus, llkirch, Francia), gene e il rapporto PEI è 1:3. Quindi, le cellule trasfettate sono state trattate con 1 ug/mL di puromicina per 1 settimana. La linea cellulare di controllo è stata generata in seguito all'infezione con un plasmide criptato.

4.11. Sovraespressione LDHA

Il plasmide pDEST{0}}LDHA è stato costruito mediante subclonazione del cDNA LDHA (acquistato dalla Korea Human Gene Bank, Daejeon, Corea) in vettori pDEST27(Invitrogen). Sono stati condotti due set di subclonati per LDHA. Per la ricostruzione dell'LDHA, le cellule SNU620/5FU-shLDHA sono state trasfettate con pDEST27-LDHA e plasmide pDEST27 vuoto. In breve, le cellule sono state coltivate fino al 70% di confluenza. Quindi, le cellule sono state trattate con una miscela comprendente 3ug di DNA e Lipofectamine 2000 (Invitrogen) per 48 ore. Dopo l'incubazione, le cellule sono state selezionate con 200 ug/mL di G418 per 1 settimana. Quindi, per confermare l'efficacia della trasfezione, abbiamo eseguito il test Western blot.

4.12.Analisi dell'apoptosi

Le cellule apoptotiche sono state rilevate utilizzando il kit di rilevamento dell'apoptosi dell'allegato V-FITC (BD Biosciences, San Jose, CA, USA), secondo le istruzioni del produttore. In breve, le cellule sono state seminate su piastre da sei pozzetti (2 × 10 cellule/pozzetto) e trattate con le concentrazioni indicate di CA e 5FU per 2 giorni. Dopo 2 giorni di trattamenti, la cellula è stata lavata con 1× PBS. Le cellule sono state sospese in 500 μL di tampone legante e trattate con 5 μL di annessina V-FITC e 5 μL di ioduro di propidio (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), seguite da incubazione per 15 minuti a temperatura ambiente in il buio. Le intensità di fluorescenza sono state esaminate utilizzando un BD FACS CANTO ⅡI (BD Biosciences).

4.13. Saggio di rilevamento delle specie reattive dell'ossigeno (ROS) mitocondriali

La produzione di ROS mitocondriale è stata rilevata utilizzando un indicatore di superossido mitocondriale rosso MitoSOX (Thermo Fisher Scientific). Le cellule sono state seminate su piastre a sei pozzetti (2 × 10 cellule/pozzetto) e Mito-TEMPO (20 μM); Sigma-Aldrich） è stato pretrattato per 1 ora prima del trattamento farmacologico. Le cellule sono state risospese in 1 mL di 1 × soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), dopo di che sono stati aggiunti 5 μM di MitoSOX. Le cellule sono state quindi incubate per 10 minuti a 37 gradi. L'intensità della fluorescenza è stata analizzata utilizzando un BD FACS CANTO II (BD Biosciences). L'immagine a fluorescenza è stata rilevata dal microscopio a fluorescenza (ingrandimento, 100 ×) (microscopio Axioimager M1, Carl Zeiss, Oberkochen, Germania).

4.14.Colorazione DAPI del nucleo

SNU620/5FU è stato seminato in una 24-piastra a pozzetti (5 × 104 cellule/pozzetto) e trattato con le concentrazioni indicate di CA e 5FU per 48 ore. Dopo il lavaggio con 1 × PBS, le cellule sono state risospese in 1- ml 1 × PBS. Le cellule sono state quindi colorate con DAPI 4ug/mL per 30 minuti a temperatura ambiente ed esaminate al microscopio a fluorescenza (ingrandimento, 200 ×) (Carl Zeiss).

4.15. Analisi statistica

I risultati di vitalità cellulare, produzione di lattato, ECAR, OCR, qRT-PCR, LDHA, LDHB attività, apoptosi e ROS mitocondriale sono stati indicati rispetto ai valori di controllo ed espressi come media ± errore standard della media di tre esperimenti indipendenti. Le differenze al di sopra del valore medio di ciascun gruppo sono state analizzate dal test t di Student, mentre le differenze tra i gruppi sono state analizzate dall'analisi unidirezionale della varianza con il test post hoc di Tukey utilizzando GraphPad Prism (versione5.0, GraphPad Software, San Diego, California, USA).

5. Conclusioni

Nel loro insieme, le cellule SNU620/5FU resistenti al cancro gastrico hanno fenotipi glicolitici, tra cui un'elevata produzione di lattato e una maggiore espressione di LDHA rispetto a quelle delle cellule SNU620 dei genitori. La limitazione della glicolisi con CA, come inibitore specifico dell'LDHA, sensibilizza le cellule SNU620/5FU a 5FU. Inoltre, il cotrattamento con CA e 5FU ha aumentato i ROS mitocondriali e la morte cellulare apoptotica nelle cellule resistenti al 5FU. I nostri risultati suggeriscono che CA potrebbe essere un candidato promettente per lo sviluppo di un farmaco adiuvante che riduce la resistenza alla chemioterapia a base di 5FU limitando l'attività dell'LDHA.

Materiali supplementari: i seguenti sono disponibili online all'indirizzo https://www.mdpi.com/article/10 .3390/ijms22105406/s1, Figura S1: Effetto di 5FU sulla fattibilità di SNU620/5FU clls, Figura S2: La crescita di SNU620 e cellule SNU620/5FU misurate mediante conteggio cellulare, Figura S3: Livelli di produzione di lattato delle cellule SNU620 e SNU620/5FU, Figura S4: Espressioni degli isotipi PDK nelle cellule SNU620 e SNU620/5FU, Figura S5: Effetto dell'ossamato sulla vitalità di SNU620 e Cellule SNU620/5FU, Figura S6: Effetti dell'EGCG sulle attività di LDHA e LDHB, Figura S7: Effetti della catechina (CA) sui livelli di espressione delle proteine ​​p-PDHA1, PDHA1 e PDK, Figura S8: Analisi della calorimetria isotermica di titolazione (ITC) di LDHA e CA, Figura S9: Espressione di LDHA in cellule SNU620/5FU trasfettate con shLDHA, Figura S10: Misurazione dei fenotipi glicolitici e vitalità cellulare in varie cellule tumorali, Figura S11: I dati grezzi del test Western blot.

Questo articolo è estratto da Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 5406. https://doi.org/10.3390/ijms22105406 https://www.mdpi.com/journal/ijms