Il principio attivo delle cistanche: l'echinacoside sull'inibizione antinfiammatoria e l'effetto neuroprotettivo

Contatto:joanna.jia@wecistanche.com

echinacoside, un Attivo Costituente di Cistanche Erba, Esercita a Neuroprotettivo Effetto in a Kainico Acido Ratto Modello di Inibendoinfiammatorio Processi e Attivazione il Akt/GSK3 Via

Cheng Wei Lu,a,b Hsi Lung Hsieh,c,d Tzu Yu Lin,a,b Ting Yang Hsieh,e Shu Kuei Huang,a e Su Jane Wang^*,f,g

Echinacosideè un composto importante di Cistanche Herb e ha attività di inibizione del rilascio di glutammato nel cervello. Dato il coinvolgimento dell'eccitotossicità causata dal glutammato massiccio nella fisiopatologia dell'epilessia, abbiamo esplorato l'effetto antiepilettico dell'echinacoside sulle convulsioni indotte dall'acido kainico nei ratti. I ratti sono stati somministrati per via intraperitonealeechinacosideper 30 minuti prima dell'iniezione intraperitoneale con acido kainico. I risultati hanno mostrato che modelli comportamentali simili a convulsioni indotti dall'acido kainico, aumento delle concentrazioni di glutammato, perdita neuronale e attivazione della microglia e stimolazione dell'espressione genica delle citochine proinfiammatorie nell'ippocampo. Si è scoperto che queste alternanze indotte dall'acido kainico sono attenuate daechinacosidepretrattamento. Inoltre, la ridotta fosforilazione di Akt e glicogeno sintasi chinasi 3 (GSK3), nonché l'espressione di Bcl-2 nell'ippocampo, è stata invertita dal pretrattamento con echinacoside. Questi risultati dimostrano che l'echinacoside esercita le sue azioni antiepilettiche e neuroprotettive in un modello di ratto acido kainico sopprimendo la risposta infiammatoria e attivando la segnalazione Akt/GSK3. Pertanto, il presente studio suggerisce che l'echinacoside è potenzialmente utile nella prevenzione dell'epilessia.

Parole chiave:echinacoside; acido kainico; epilessia; effetto neuroprotettivo; ippocampo

Echinacoside in cistanche

L'epilessia è un disturbo cerebrale diffuso in tutto il mondo. Colpisce più di 65 milioni di persone, quasi l'1% della popolazione mondiale.1) I farmaci antiepilettici sintetici sono ampiamente disponibili nel mercato farmaceutico; tuttavia, questi farmaci sono efficaci solo nel 60-70% dei pazienti e hanno effetti collaterali negativi.2-4) Pertanto, esiste un'esigenza insoddisfatta di cercare un farmaco più efficace e più sicuro. Le piante medicinali rappresentano una potenziale fonte di tali composti.^5,6)

Nella fitoterapia tradizionale cinese, Cistanche Herba è stata a lungo utilizzata per il trattamento dell'epilessia.7,8)Echinacosideè un componente importante di Cistanche Herba9) e ha molte proprietà farmacologiche, come attività antiossidante, antinfiammatoria, antineoplastica, epatoprotettiva e immunomodulante.10,11) Inoltre, è stato riportato cheechinacosidepuò entrare nel cervello e suscitare neuroprotezione.12-16) Abbiamo precedentemente dimostrato che l'echinacoside riduce il rilascio di glutammato nelle terminazioni nervose cerebrocorticali di ratto.17) Poiché il glutammato è un importante neurotrasmettitore eccitatorio nel cervello dei mammiferi e svolge un ruolo cruciale nella fisiopatologia dell'epilessia, 18,19) abbiamo suggerito che l'echinacoside abbia attività antiepilettica. Per chiarire questa ipotesi, in questo studio è stato utilizzato un modello di ratto con acido kainico.

L'acido kainico è un derivato del glutammato e la sua singola iniezione sistemica ai roditori provoca convulsioni, neuroinfiammazione e degenerazione neuronale o morte sulla popolazione selettiva di neuroni nel cervello.20–22) Queste alternanze patologiche sono simili all'epilessia del lobo temporale umano.23 ,24) Si ritiene generalmente che la somministrazione di acido kainico ai roditori induca un modello adeguato di epilessia. Ad oggi, nessuno studio ha studiato le proprietà antiepilettiche e neuroprotettive diechinacosidein un modello animale iniettato con acido kainico. Pertanto, il nostro studio mira a valutare l'effetto e il suo possibile meccanismo diechinacosidepre-somministrazione in ratti trattati con acido kainico.

MATERIALI E METODI

Animali e attività convulsiva

Durante lo studio sono stati utilizzati ratti maschi Sprague-Dawley (BioLASCO, Taipei, Taiwan) del peso di 150-200 g. I ratti sono stati assegnati in modo casuale a quattro gruppi come segue: i) Gruppo 1: gruppo trattato con dimetilsolfossido (controllo); ii) Gruppo 2: gruppo trattato con acido kainico; iii) Gruppo 3:echinacoside10 mg/kg più gruppo acido kainico; iv) Gruppo 4:echinacoside50 mg/kg più gruppo acido kainico. L'echinacoside (ChemFaces, Wuhan, PRC) è stato iniettato (somministrazione intraperitoneale) 30 minuti prima dell'iniezione intraperitoneale di acido kainico (15 mg/kg). L'attività convulsiva è stata valutata durante un periodo di 4 ore dopo l'iniezione di acido kainico secondo la scala di Racine.25) La dose e il programma di somministrazione sono stati scelti sulla base di studi precedenti.22,26,27) Gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dall'Istituto Comitato per la cura e l'uso degli animali presso l'Università Cattolica di Fu Jen e svolto secondo i protocolli emessi, che hanno seguito la Guida per la cura e l'uso dei laboratori del National Institutes of Health (NAC 2011).

Determinazione dei livelli di glutammato

Quattro ore dopo il trattamento con acido kainico, i ratti sono stati sacrificati per decapitazione. L'intero cervello è stato sezionato e l'ippocampo di ciascun ratto è stato raccolto per l'analisi. La concentrazione di glutammato nel tessuto cerebrale dell'ippocampo è stata determinata secondo i metodi descritti da studi precedenti.28,29)

Colorazione neutra rossa e fluoro-giada B

Tre giorni dopo l'iniezione di acido kainico, i ratti sono stati anestetizzati utilizzando cloralio idrato (650 mg/kg) e perfusi per via transcardiaca con una soluzione fissativa contenente il 4% di paraformaldeide in una soluzione tampone fosfato 0,1 M (PBS, pH 7,4). I cervelli sono stati rimossi immediatamente dopo la perfusione e conservati in paraformaldeide al 4% per una notte a 4 gradi. Dopo la post-fissazione, i cervelli sono stati immersi con saccarosio al 30% a 4 gradi per 24 ore. I campioni sono stati congelati rapidamente e le sezioni spesse 30-µm sono state tagliate utilizzando un microtomo congelato. Le sezioni libere sono state colorate con rosso neutro (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) e Fluoro-Jade B (Millipore, CA, USA). Le cellule B-positive al fluoro-giada nella regione CA3 dell'ippocampo sono state determinate come descritto in precedenza.^30,31)

Immunoistochimica

Le sezioni sono state lavate con {{0}},1 M PBS e bloccate con 0,5% di siero di capra normale in {{20}},1 M PBS per 1 ora a temperatura ambiente. L'incubazione dell'anticorpo primario (anticorpo monoclonale di topo anti-OX-42, 1: 1000; AbD Serotec, Oxford, Regno Unito) è stata eseguita per due notti a 4 gradi . Dopo ripetuti lavaggi con PBS, le sezioni sono state incubate con immunoglobulina G (IgG) anti-topo biotinilata (1: 200) per 90 minuti, trattate con la soluzione di complesso avidina-biotina (ABC) (1: 1000) per 1 ora a camera temperatura e ha reagito con 0,025 percento di 3,3'-diaminobenzidina e 0,025 percento di H2O2 fino a raggiungere l'intensità della colorazione desiderata. Le sezioni sono state montate su vetrini utilizzando protocolli standard. I vetrini colorati sono stati esaminati e ripresi al microscopio (Olympus, Tokyo, Giappone).31) L'analisi di un corpo cellulare microgliale e della lunghezza del processo è stata eseguita con ImageJ.³²)

Microscopia elettronica a trasmissione Microscopia elettronica a trasmissione

è stato eseguito come descritto in precedenza.33) In breve, la regione CA3 dell'ippocampo è stata rimossa e fissata in un tampone contenente il 4% di paraformaldeide e il 2,5% di glutaraldeide a 4 gradi per 24-36 ore. Dopo i lavaggi con PBS, le regioni CA3 sono state postfissate in tetrossido di osmio all'1% per 2 ore, disidratate con etanolo e incorporate in resina epossidica. Sezioni ultrasottili (70 nm) sono state preparate utilizzando un ultramicrotomo (EM UC7, Leica Microsystems, Wetzlar, Germania). Le sezioni sono state colorate con acetato di uranile e citrato di piombo e osservate mediante microscopia elettronica a trasmissione (modello JEM-1400, JEOL Ltd., Tokyo, Giappone).

PCR quantitativa in tempo reale

L'estrazione dell'RNA e la PCR quantitativa in tempo reale sono state eseguite come descritto in precedenza.34,35) L'RNA totale è stato estratto dall'ippocampo utilizzando mirVana™ miRNA Isolation Kit (Life Technologies, Grand Island, NY, USA) seguendo il protocollo del produttore. Il DNA genomico è stato rimosso mediante incubazione con desossiribonucleasi (DNasi) I. Il cDNA è stato sintetizzato da (kit del sistema di trascrizione inversa NoScript; Promega, Madison, WI, USA) e utilizzato per il reale quantitativo SYBR Green (Roche Diagnostics, Mannheim, Germania) amplificazione time PCR con primer specifici utilizzando il sistema LightCycler 480 (Roche Diagnostics). Il protocollo consisteva in una fase di denaturazione iniziale a 95 gradi per 3 minuti, seguita da 45 cicli di denaturazione a 95 gradi per 10 s, ricottura a 56 gradi per 30 s. I livelli di mRNA di ciascun gene bersaglio sono stati normalizzati a quelli dell'mRNA della gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi (GAPDH). L'induzione della piega è stata calcolata utilizzando il metodo 2-ΔΔCT come descritto in uno studio precedente.³⁴)

Immunoblotting

Venti microgrammi di estratti proteici dall'ippocampo sono stati separati mediante elettroforesi su gel di sodio dodecil solfato-poliacrilammide (SDS-PAGE) seguita da trasferimento elettroforetico su membrana di polivinilidene difluoruro (PVDF). La membrana è stata bloccata usando latte scremato al 5% per 1 ora a temperatura ambiente e incubata con gli anticorpi appropriati in latte scremato all'1% durante la notte a 4 gradi, seguita da incubazione con un anticorpo secondario per 1 ora. Gli anticorpi primari erano anticorpi monoclonali di coniglio diretti contro Akt (1: 2000), pAktSer473 (1: 2000), glicogeno sintasi chinasi 3 (GSK3 ) (1: 2000), pGSK3 Ser9 (1: 500), Bcl-2 ( 1: 1000) e -actina (1: 2000) ottenuta da Cell Signaling Technology (MA, USA). L'anticorpo secondario di capra anti-coniglio coniugato con perossidasi (1: 5000) è stato ottenuto da Santa Cruz (CA, USA). Le bande sono state visualizzate con una chemiluminescenza potenziata (Amersham, Buckinghamshire, Regno Unito) utilizzando un sistema di analisi di immagini su gel. L'intensità di ciascuna banda è stata misurata utilizzando il software Syngene (Synoptics, Cambridge, Regno Unito).

Analisi statistica

I dati sono presentati come media ± errore standard della media (SEM). L'analisi statistica è stata eseguita dal test t di Student a due code quando si confrontano due gruppi e dall'ANOVA unidirezionale con i test post hoc di confronti multipli di Tukey quando si confrontano più di due gruppi. L'analisi è stata completata utilizzando il software SPSS (versione 17.0; SPSS Inc., Chicago, IL, USA). p<0.05 was="" considered="" statistically="">

RISULTATI

Effetto dell'echinacoside sulle convulsioni indotte dall'acido kainico e sull'aumento dei livelli di glutammato ippocampale

Per valutare l'effetto neuroprotettivo diechinacosidecontro l'eccitotossicità indotta da acido kainico, i ratti sono stati pretrattati conechinacoside(5, 10 e 50 mg/kg, somministrazione intraperitoneale) per 30 minuti prima dell'iniezione intraperitoneale di acido kainico (15 mg/kg). L'iniezione intraperitoneale di acido kainico (15 mg/kg) ha provocato convulsioni con latenza e punteggi rispettivamente di 92,5±5,3 min e 4,9±0,1 (Figg. 1A, B). Un aumento significativo della latenza delle crisi[F(2, 43)=40.2, p<0.01; fig.="" 1a]="" and="" a="" significant="" decrease="" in="" seizure="" score="" [f(2,="" 40)="21.5,"><0.001; fig.="" 1b]="" were="" observed="" in="" echinacoside="" (10="" or="" 50="" mg/kg)-pretreated="" rats.="" however,="" echinacoside="" at="" 5="" mg/kg="" had="" no="" significant="" effect="" on="" seizure="" latency="" and="" score="" (p="">0.05; Fichi. 1A, B). Data la robusta attenuazione dell'attività convulsiva osservata con 10 o 50 mg/kg di echinacoside, queste due dosi di echinacoside sono state utilizzate in esperimenti successivi per valutare i meccanismi alla base della capacità dell'echinacoside di inibire le convulsioni indotte dall'acido kainico. La figura 1C mostra che l'aumento dei livelli di glutammato ippocampale è stato notato nei ratti trattati con acido kainico a 4 ore rispetto al gruppo trattato con dimetilsolfossido (controllo; p<0.001). however,="" decreased="" hippocampal="" glutamate="" levels="" were="" obtained="" in="" the="" echinacoside="" group="" (10="" or="" 50="" mg/kg)="" [f(3,="" 16)="6.1,"><0.01; fig.="">

Effetto dell'echinacoside sulla lesione neuronale indotta dall'acido kainico nella regione CA3 dell'ippocampo

Il grado di danno neuronale è stato valutato 3 giorni dopo l'iniezione di acido kainico mediante colorazione rossa neutra o Fluoro-Jade B per rilevare rispettivamente i neuroni sopravvissuti e i neuroni in degenerazione. La colorazione rossa neutra ha rivelato un'apparente perdita neuronale nel CA3 dei ratti iniettati con acido kainico, rispetto ai ratti trattati con dimetilsolfossido (controllo; p<0.001; figs.="" 2a,="" c).="" however,="">echinacosidepretrattamento (10 o 50 mg/kg) ha ridotto efficacemente la perdita neuronale indotta dall'acido kainico nel CA3 [F(2, 13)=11.6, p<0.001; figs.="" 2a,="" c].="" similarly,="">echinacosidegli animali trattati presentavano una diminuita fluorescenza FL Fluoro-Jade B FL nelle regioni CA3 dell'ippocampo dopo l'iniezione di acido kainico (p<0.001), compared="" with="" the="" strong="" damage="" observed="" in="" kainic="" acid-injected="" rats="" [f(2,="" 24)="6.9,"><0.001; figs.="" 2b,="" d].="" in="" addition,="" transmission="" electron="" microscopy="" shows="" that="" neuronal="" injury="" in="" ca3="" was="" not="" obvious="" in="" the="" dimethylsulfoxide-treated="" (control)="" group.="" however,="" in="" the="" kainic="" acid-treated="" group,="" nerve="" cells="" had="" ultrastructural="" changes.="" nerve="" cells="" exhibited="" autophagosome="" formations,="" deformed="" nuclei="" with="" the="" condensed,="" and="" disruptive="" cell="" plasma="" membrane.="" in="" contrast,="" the="" neuronal="" injury="" in="" the="" echinacoside-pretreated="" group="" was="" apparently="" attenuated="" compared="" with="" the="" kainic="" acid-injected="" rats="" (fig.="">

Effetto dell'echinacoside sull'attivazione della microglia indotta dall'acido kainico e sull'espressione genica del proinfiammatorio

Citochine nell'ippocampo Nel modello per le crisi epilettiche indotte dall'acido kainico e la morte neuronale dell'ippocampo, l'attivazione microgliale e la produzione di citochine proinfiammatorie sono aumentate nell'ippocampo.36,37) Al fine di indagare seechinacosideha influenzato la risposta infiammatoria nell'ippocampo di ratti iniettati con acido kainico, l'attivazione della microglia è stata analizzata utilizzando l'anticorpo anti-OX42. Nei ratti trattati con dimetilsolfossido (gruppo di controllo), i corpi cellulari microgliali nelle regioni CA3 erano piccoli e i loro processi erano lunghi e sottili (Fig. 4A). Tuttavia, il numero di cellule microgliali attivate nell'area CA3 dei ratti iniettati con KA è aumentato in modo significativo, i corpi delle cellule microgliali sono stati ingranditi (p<0.01; figs.="" 4a,="" b),="" and="" their="" cellular="" processes="" became="" shorter="" and="" thicker=""><0.001; figs.="" 4a,="" c).="" in="" the="" animals="" pretreated="" with="">echinacoside(10 o 50 mg/kg) di ratti pretrattati, il numero di cellule microgliali attivate era significativamente diminuito e i corpi cellulari microgliali erano sottili [F(2, 13)=6.2, p<0.01; fig.="" 4b]="" and="" their="" cytoplasmic="" processes="" were="" ramified="" [f(2,="" 28)="47.5,"><0.001; fig.="" 4c].="" in="" addition,="" the="" expression="" levels="" of="" interleukin-1β,="" interleukin-6,="" and="" tumor="" necrosis="" factor-α="" mrna="" in="" the="" hippocampus="" were="" apparently="" elevated="" at="" 1="" d="" after="" kainic="" acid="" injection,="" compared="" to="" dimethylsulfoxideinjected="" animals="" (control)=""><0.001). however,="" decreased="" mrna="" levels="" for="" these="" pro-inflammatory="" cytokines="" were="" obtained="" in="" the="" echinacoside="" group="" [interleukin-1β,="" f(3,="" 18)="154.7,"><0.001; interleukin-6,="" f(3,="" 17)="17.9,"><0.001; tumor="" necrosis="" factor-α,="" f(3,="" 16)="31.1,"><0.001; figs.="">

Effetto dell'echinacoside sulla diminuzione indotta dall'acido kainico dei livelli di fosfo-akt ippocampale, fosfo-glicogeno sintasi chinasi 3 e Bcl-2

I livelli di Akt fosforilato (pAkt) (Ser473), GSK3 fosforilato (pGSK3 ) (Ser9) e Bcl-2 sono stati analizzati nell'ippocampo (Fig. 6). Un sostanziale abbassamento dell'espressione di pAkt, pGSK-3 e Bcl-2 nell'ippocampo è stato osservato nei ratti trattati con acido kainico a 4 ore rispetto ai ratti trattati con dimetilsolfossido (controllo) (p<0.001). however,="" pretreatment="" with="">echinacoside(10 o 50 mg/kg) ha aumentato significativamente i livelli di pAkt, pGSK3 e Bcl-2 rispetto al solo trattamento con acido kainico [pAkt, F(3, 19)=69.5, p<0.001; pgsk3β,="" f(3,="" 17)="60.3,"><0.001; bcl-2,="" f(3,="" 18)="26.1,"><0.001; figs.="">

DISCUSSIONE

L'evidenza ha indicato che il glutammato svolge un ruolo cruciale nella fisiopatologia dell'epilessia.^17,18) L'ipotesi glutamatergica dell'epilessia suggerisce che il processo epilettogeno sia correlato ad un aumento della concentrazione di glutammato nel cervello e una riduzione della concentrazione di questo neurotrasmettitore è in grado di produrre un'azione antiepilettica.^38–40) Lo ha dimostrato uno studio del nostro laboratorioechinacosidepuò ridurre il rilascio di glutammato dai terminali nervosi e ha suggerito che è probabile che l'echinacoside abbia un effetto antiepilettico.17) Questo suggerimento è stato confermato nel presente studio utilizzando un modello di ratto iniettato con acido kainico. L'acido kainico, un derivato del glutammato, è ampiamente utilizzato per indurre l'epilessia negli studi sugli animali perché le sue caratteristiche neuropatologiche e biochimiche sono simili a quelle degli esseri umani.^23,24)

L'iniezione intraperitoneale di acido kainico nei ratti provoca convulsioni e danni neuronali, in particolare nelle regioni CA3 dell'ippocampo.^41–43) Inoltre, queste alternanze patologiche prodotte dall'acido kainico sono legate al massiccio rilascio di glutammato.^41,44,45) In accordo con questi risultati, abbiamo osservato che la somministrazione intraperitoneale di acido kainico (15 mg/kg) induceva un comportamento convulsivo, aumentava i livelli di glutammato nell'ippocampo e causava la perdita di cellule piramidali nella regione CA3 dell'ippocampo. Queste alterazioni patologiche indotte dall'acido kainico sono state attenuate dal pretrattamento intraperitoneale conechinacoside(10 o 50 mg/kg). Inoltre, la lesione delle cellule nervose CA3 ippocampali valutata mediante alternanza ultrastrutturale con microscopia elettronica a trasmissione è stata alleviata daechinacosidenei ratti con acido kainico. Inoltre, è stato osservato un aumento del numero di autofagosomi nelle cellule CA3 dopo la somministrazione di acido kainico. Il pretrattamento con echinacoside ha soppresso l'aumentata formazione di autofagosomi. Studi precedenti hanno suggerito che l'attivazione dell'autofagia è coinvolta nella morte neuronale indotta dall'acido kainico e l'inibizione del processo di autofagia sembra essere neuroprotettiva.^46,47) Sebbene il meccanismo alla base dell'effetto antiepilettico diechinacosiderichiede un'ulteriore esplorazione, l'effetto neuroprotettivo dell'echinacoside nel modello animale dell'acido kainico potrebbe essere derivato dall'attività antiepilettica attraverso l'inibizione dell'eccitotossicità del glutammato e dell'attivazione dell'autofagia.

La neuroinfiammazione contribuisce notevolmente a ritardare il danno cerebrale dopo una lesione acuta ed esercita un effetto dannoso sull'esito neurologico.²⁷) Risposte infiammatorie, come l'attivazione della microglia e la produzione di citochine infiammatorie, sono state descritte nell'epilessia umana e in modelli sperimentali di epilessia.^36,48) Inoltre, il rilascio di queste citochine proinfiammatorie dalle cellule microgliali attivate promuove il danno neuronale indotto dall'acido kainico nell'ippocampo.^36,37) Abbiamo dimostrato che, mentre l'acido kainico aumenta l'attivazione della microglia e l'espressione genica delle citochine proinfiammatorie (interleuchina{0}}, interleuchina-6 e fattore di necrosi tumorale-) nell'ippocampo, questi effetti sono stati soppressi daechinacosidepretrattamento. Pertanto, lo suggeriamoechinacosideattraverso la soppressione dei processi infiammatori può contribuire ai suoi effetti antiepilettici e neuroprotettivi nel modello animale con acido kainico. Come già osservato nei nostri studi precedenti, diversi farmaci e prodotti naturali esercitano anche effetti antiepilettici e neuroprotettivi contro le crisi indotte dall'acido kainico, attraverso il loro effetto antinfiammatorio.^31,33,35)

È noto che numerose cascate di segnalazione della protein chinasi sono attivate dall'acido kainico che svolgono un ruolo importante nella neuroprotezione. Tra coloro che sembrano avere una partecipazione particolarmente significativa c'è l'Akt.^49,50,) Akt media i suoi effetti neuroprotettivi attivando vari substrati a valle, inclusi GSK-3 e Bcl-2. Akt fosforila GSK-3 in Ser9, portando alla sua inattivazione e al rafforzamento della sopravvivenza delle cellule neuronali51) perché la forma attiva di GSK-3 attiva la via della morte mitocondriale.^52,53) Bcl-2 è un membro chiave della famiglia anti-apoptotica Bcl-2 e svolge un ruolo chiave nella soppressione della morte cellulare apoptotica mediata dai mitocondri. Ad esempio, Bcl-2 può proteggere l'integrità della membrana mitocondriale e bloccare il rilascio del citocromo C dai mitocondri, portando alla sopravvivenza cellulare e all'inibizione dell'apoptosi.⁵⁴) È stato anche segnalato che la sovraespressione di Bcl-2 protegge i neuroni dagli insulti eccitotossici in vitro e in vivo. 54,55) Il presente studio ha osservato una diminuzione della fosforilazione di Akt (Ser473) e GSK3 (Ser9) nonché l'espressione di Bcl-2 nell'ippocampo dei ratti in seguito all'esposizione all'acido kainico, che è in accordo con studi precedenti.^56,57) Inoltre, il pretrattamento con echinacoside ha salvato la diminuzione indotta dall'acido kainico nell'espressione di pAkt e pGSK3, nonché dell'espressione di Bcl-2. Pertanto, gli effetti neuroprotettivi diechinacosidenel modello animale dell'acido kainico potrebbe essere in parte mediato impedendo la sottoregolazione del percorso Akt/GSK-3 /Bcl-2, aumentando così la sopravvivenza dei neuroni.

Echinacosideè un potenziale nuovo candidato terapeutico. Questo è perchéechinacosidepuò entrare nel cervello e mostra numerosi benefici.⁵⁸). Numerosi studi lo hanno dimostratoechinacosideattenua il danno cerebrale e allevia il disturbo motorio o della memoria in diversi modelli sperimentali in vivo.^12,14,15,59) Sebbene i meccanismi che stanno alla base degli effetti neuroprotettivi diechinacosidenel cervello richiedono delucidazioni, sono stati implicati neuroinfiammazione inibita, antiossidante, scavenging dei radicali liberi dell'ossigeno e aumento della neurogenesi.^14–16) Oltre a questi possibili meccanismi, il nostro precedente¹⁷) e i risultati attuali suggeriscono che l'inibizione della sovraeccitazione mediata dal glutammato può in parte contribuire agli effetti neuroprotettivi e antiepilettici diechinacosidenel cervello. Ciò è supportato dal fatto che l'attività convulsiva, la neuroinfiammazione e il danno cerebrale indotti dall'acido kainico sono associati all'eccessivo rilascio di glutammato e all'attivazione dei recettori del glutammato.^44,45) Inoltre, è stato dimostrato che diversi farmaci antiepilettici clinicamente utilizzati attenuano l'attività convulsiva indotta dall'acido kainico60,61) e riducono il rilascio di glutammato nei tessuti cerebrali umani e di ratto.^62,63). Questi risultati hanno evidenziato che livelli ridotti di glutammato sono importanti per gli effetti farmacoterapeutici dei farmaci antiepilettici.

In conclusione, i nostri risultati lo dimostranoechinacoside, attraverso la soppressione dei processi infiammatori, la diminuzione della sovraeccitazione mediata dal glutammato, nonché l'aumento dell'attivazione di Akt/GSK-3 e dell'espressione di Bcl-2, ha un significativo effetto antiepilettico e neuroprotettivo nei ratti iniettati con acido kainico. Sebbene il ruolo diechinacosidesui pazienti con epilessia richiede un'ulteriore valutazione, i nostri risultati suggeriscono che potrebbe essere un approccio prezioso nella terapia dell'epilessia.

Ringraziamenti

Gli autori desiderano ringraziare il signor Yen-Sheng Wu del Laboratorio di microscopio elettronico di Tzong Jwo Jang, College of Medicine, Fu Jen Catholic University. Questo lavoro è stato sostenuto dal Ministero della Scienza e della Tecnologia (MOST 103-2320-B-030-001 MY3).

Conflitto d'interesse

Gli autori dichiarano assenza di conflitto di interesse.