L'efficacia sensibile all'età della restrizione calorica sulla biogenesi mitocondriale e sul danno MtDNA nel fegato di ratto

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Astratto:La restrizione calorica (CR) è il trattamento più efficace per ritardare l'insorgenza di cambiamenti legati all'età come la disfunzione mitocondriale. Tuttavia, la sensibilità dei marcatori mitocondriali alla CR e i limiti legati all'età dell'efficacia della CR non sono completamente chiariti. Abbiamo utilizzato campioni di fegato di ratti alimentati ad libitum (AL) suddivisi in:18-mesi (AL-18), 28-mesi (AL-28) e 32-gruppi di un mese(AL-32) e da gruppi trattati con CR (CR) 28-di un mese (CR-28) e 32- controparti di un mese(CR-32) per analizzare l'effetto della CR su diversi marcatori mitocondriali. Le diminuzioni legate all'età dell'attività della citrato sintasi, delle quantità di proteine ​​TFAM, MFN2 e DRP1 e del contenuto di mtDNA nel gruppo AL-28 sono state prevenute nelle controparti CR-28. Di conseguenza, il CR ha ridotto il danno ossidativo del mtDNA valutato attraverso l'incidenza di purine ossidate in specifiche regioni del mtDNA negli animali CR-28. Questi risultati supportano l'effetto antietà della CR fino a 28 mesi. Al contrario, le quantità di proteine ​​di LonP1, Cyt c, OGG1 e APE1 e il contenuto di delezione del mtDNA di 4,8 Kb non sono stati influenzati nei ratti CR-28. L'assenza di differenze significative tra i valori AL-32 e le controparti CR-32 suggerisce un limite di CRefficacia legato all'età a questa età.puritani vitamina cTuttavia, ciò riduce solo parzialmente i benefici della CR nel contrastare il declino generalizzato dell'invecchiamento e il relativo coinvolgimento mitocondriale.

Parole chiave:fegato di ratto; invecchiamento; restrizione calorica; biogenesi mitocondriale; danno al mtDNA; efficacia sensibile all'età di CR

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1. Introduzione

Secondo l'impressionante progressione degli studi che indagano sul processo di invecchiamento, sono state composte in sequenza diverse definizioni del processo e un insieme di percorsi e mediatori è stato identificato come i cosiddetti segni distintivi dell'invecchiamento [1,2]. Tra questi, la disfunzione mitocondriale, lo stress ossidativo e il danno molecolare dei mitocondri sono emersi come fattori cruciali. Una caratteristica importante dell'invecchiamento è la specificità del tessuto che è stata evidenziata per il coinvolgimento mitocondriale [3,4], i cambiamenti epigenetici [5] e altre alterazioni come la lunghezza dei telomeri [6]. Tra i vari trattamenti volti a prevenire o ritardare l'insorgenza di cambiamenti legati all'età, la restrizione calorica (CR) è la strategia più antica proposta [7], e rappresenta ancora il gold standard per l'altissimo numero di effetti benefici veicolati da questo intervento. Infatti, studi recenti sui meccanismi molecolari evocati dalla CR hanno dimostrato che diversi percorsi sono positivamente influenzati da questo intervento nutrizionale [8-10].sistanoInoltre, questi risultati supportano fortemente anche l'esistenza di una "plasticità" dell'invecchiamento [5,9,11,12] che può essere modulata tramite interazioni ambientali come interventi nutrizionali o farmaceutici o abitudini di vita. È già stato dimostrato che la CR contrasta le alterazioni legate all'età della biogenesi e del metabolismo mitocondriale in diversi tessuti di ratto con effetti tessuto-specifici [3,13,14]. Più specificamente, studi precedenti del nostro gruppo sul fegato di ratto, che è profondamente influenzato dall'invecchiamento a livello mitocondriale, esaminando i marcatori organellari hanno mostrato un effetto positivo della CR sulle alterazioni mitocondriali legate all'età. Infatti, nei ratti di 28-mesi di età trattati con CR, il contenuto di DNA mitocondriale (mtDNA), la quantità di proteine ​​coinvolte nella biogenesi mitocondriale o sensibili ai ROS e l'entità del legame del fattore di trascrizione mitocondriale A(TFAM) in specifiche regioni del mtDNA presentavano valori significativamente diversi da quelli delle controparti alimentate ad libitum (AL) della stessa età e non statisticamente diversi da quelli degli animali più giovani alimentati con AL di 18- mesi [15]. Più recentemente, l'analisi della biogenesi mitocondriale e del danno al mtDNA nel fegato di ratti di età AL (28-mesi) ed estremamente invecchiati (32- mesi) ci ha permesso di studiare una matrice diversificata dei parametri mitocondriali e di suggerire un diverso ritmo di invecchiamento in relazione al coinvolgimento mitocondriale, nei pochi animali che raggiungono naturalmente la longevità rispetto alla maggior parte di quelli che invecchiano [16,17]. Con queste premesse, abbiamo mirato a valutare l'efficacia della CR su un ampio set di marcatori mitocondriali a varie età nel fegato di ratto. Per questi scopi, abbiamo utilizzato animali del ceppo ibrido a vita molto lunga Fischer 344× Brown Norway, da cui sono stati scelti come controlli i 18-ratti nutriti ad libitum (AL-18) di un mese, da confrontare con gli animali alimentati ad libitum, invecchiati(AL-28) ed estremamente invecchiati(AL-32) e le controparti di pari età trattate con CR (CR-28 e CR{ {39}}). In questi gruppi di ratti, abbiamo valutato: L'attività dell'enzima mitocondriale citrato sintasi, l'espressione di un insieme di proteine ​​tra cui TFAM, Lon proteasi (LonP1) e citocromo c(Cyt c), gli enzimi di riparazione del mtDNA 8- oxo DNA glicosilasi/apurinica o apirimidinica(AP) liasi (OGG1) ed endonucleasi apurinica/apirimidinica 1(APE1), e le proteine ​​della dinamica mitocondriale mitofusina 2 (MFN2) e la proteina correlata alla dinamina 1(DRP1). Infine, sono stati determinati anche il contenuto di mtDNA e il danno ossidativo in regioni specifiche.

2. Risultati

2.1.Eovalutazione dell'età e degli effetti della CR sui marcatori della funzionalità mitocondriale

L'attività della citrato sintasi, che è anche un marker della massa mitocondriale, è stata determinata in tutti e cinque i gruppi di ratti per valutare la sensibilità della funzionalità mitocondriale all'invecchiamento e alla CR (Figura 1).

È stata osservata una diminuzione statisticamente significativa correlata all'età dell'attività della citrato sintasi nei ratti AL-28(-41 percento) e AL-32(-40 percento) rispetto all'AL{{ 5}} controllo dell'età. Nessuna differenza statisticamente significativa è stata trovata tra i gruppi AL-28 e AL-32. L'effetto CR è stato dimostrato dall'attività enzimatica significativamente più alta (più il 40 percento) nei ratti CR-28 rispetto al valore del ratto AL-28 corrispondente all'età. Inoltre, l'attività CR-28 era simile a quella osservata nei ratti di controllo AL-18 più giovani (Figura 1). Questo effetto è stato invece attenuato negli animali CR-32. Infatti, all'età più avanzata di 32 mesi, non è stata osservata alcuna differenza statistica tra i gruppi AL e CR.

cistanche può antinvecchiamento

Per approfondire l'analisi dell'età e degli effetti della CR sulla funzionalità mitocondriale, la quantità proteica di TFAM e di LonP1 è stata determinata nei mitocondri isolati da tutti i gruppi di ratti mediante analisi Western blot, in cui la proteina della membrana mitocondriale esterna VDAC è stata utilizzata come controllo del carico interno (Figura 2).

Figura 2. Quantità di proteine ​​TFAM e LonP1 nei mitocondri epatici isolati da AL-18, AL-28, CR-28, AL-32 e CR-32-mese -vecchi topi. (UN). Quantità di proteine ​​​​TFAM nei mitocondri epatici isolati da diversi gruppi di ratti. Nel riquadro, è stata eseguita una macchia occidentale rappresentativa su un ratto da ciascuno dei gruppi saggiati. Le bande immunoreattive, dall'alto verso il basso, rappresentano, rispettivamente, i segnali provenienti da TFAM e VDAC. L'istogramma mostra la quantificazione dell'intensità delle bande di TFAM, normalizzata all'intensità di VDAC.(B).Le quantità di proteine ​​LonP1 nei mitocondri epatici isolati da diversi gruppi di ratti. Nel riquadro, è stata eseguita una macchia occidentale rappresentativa su un ratto da ciascuno dei gruppi saggiati. Dall'alto verso il basso, le bande immunoreattive rappresentano, rispettivamente, i segnali di LonP1 e VDAC.cos'è la cistancheL'istogramma mostra la quantificazione dell'intensità delle bande di LonP1, normalizzata all'intensità di VDAC. (A, B) I dati rappresentano i risultati di esperimenti di Western blot triplicati e sono stati analizzati utilizzando il test ANOVA a una via e il test di confronto multiplo di Tukey . Le barre rappresentano i valori medi e SD per i cinque gruppi sperimentali. I dati sono stati normalizzati rispetto al valore dei ratti AL-18, fissato a 1.*p<0.05 versus="" al-18=""><0.05 versus="" al-28="" rats.="" n:="" number="" of="" analyzed="" animals.="" aging="" led="" to="" a="" statistically="" significant="" (-31%)decrease="" in="" the="" tfam="" amount="" comparing="" al-18="" control="" rats="" with="" both="" al-28="" and="" al-32="" animals,="" whereas="" there="" was="" no="" significant="" difference="" between="" the="" values="" of="" al-28="" and="" al-32="" groups.="" as="" an="" effect="" of="" cr,="" the="" cr-28="" rats="" had="" a="" tfam="" amount="" significantly="" higher(+39%)="" than="" that="" of="" the="" age-matched="" al="" counterparts="" and="" not="" different="" from="" that="" of="" the="" younger="" al-18="" controls.="" conversely,="" such="" diet="" effect="" was="" not="" visible="" anymore="" in="" the="" cr-32="" animals="" that="" showed="" a="" tfam="" amount="" not="" statistically="" different="" from="" that="" of="" the="" age-matched="" al="" group="" and="" significantly="" lower="" than="" that="" of="" the="" al-18="" rats.="" as="" for="" the="" lonp1="" amount,="" there="" was="" a="" statistically="" significant="" (-65%)="" age-related="" decrease="" in="" the="" al-28="" group="" with="" respect="" to="" the="" al-18="" value.="" the="" age="" progression="" made="" the="" statistically="" significant="" decrease="" in="" the="" lonp1="" amount,="" with="" respect="" to="" the="" al-18="" rats,="" more="" marked(-75%)in="" the="" al-32="" group.="" interestingly,="" there="" was="" no="" evident="" effect="" of="" cr="" on="" the="" lonp1="" amount="" since="" the="" comparison="" between="" the="" al-28="" value="" and="" the="" cr="" age-matched="" counterpart="" did="" not="" show="" any="" significant="" difference="" and="" the="" same="" occurred="" for="" the="" comparison="" between="" the="" al-32="" and="" cr-32="">

Per valutare l'effetto dell'invecchiamento e della CR su un'altra funzione metabolica mitocondriale che è l'inizio della via apoptotica intrinseca mitocondriale, abbiamo determinato, mediante esperimenti di Western blot, la quantità intra-mitocondriale di Cyt c (Figura 3).

Figura 3. Quantità di proteina Cyt c nei mitocondri epatici isolati da AL-18, AL-28, CR-28, AL-32 e CR-32-mese- vecchi topi. Nel riquadro, è stata eseguita una macchia occidentale rappresentativa su un ratto da ciascuno dei gruppi saggiati. Dall'alto verso il basso, le bande immunoreattive rappresentano, rispettivamente, i segnali di Cyt c e VDAC. L'istogramma mostra la quantificazione dell'intensità delle bande di Cyt c normalizzata all'intensità di VDAC. Tutti i dati rappresentavano i risultati di esperimenti di Western blot triplicati e sono stati analizzati utilizzando il test ANOVA a una via e il test di confronto multiplo di Tukey. Le barre rappresentano i valori medi e SD per i cinque gruppi sperimentali. I dati sono stati normalizzati rispetto al valore dei ratti AL-18, fissato a 1.* p<0.05 versus="" al-18=""><0.05 versus="" al-28="" rats.="" n:="" number="" of="" analyzed="" animals.="" the="" age-related="" effect="" on="" the="" intra-mitochondrial="" cyt="" c="" amount="" was="" peculiar="" since="" there="" was="" a="" marked(-44%)statistically="" significant="" decrease="" passing="" from="" the="" al-18="" rats="" to="" the="" al-28="" animals,="" but="" such="" decrease="" was="" partially="" prevented="" in="" the="" al-32="" group="" showing="" a="" small(-13%)="" decrease="" in="" comparison="" with="" the="" al-18counterpart="" and="" a="" significant="" marked="" (+55%)="" increase="" in="" comparison="" with="" the="" al-28="" rats.="">Cistanche antietàL'effetto CR non era affatto rilevante poiché non c'erano differenze significative nelle quantità di proteina Cyt c tra i gruppi AL e CR di pari età a 28 e 32 mesi. La diminuzione correlata all'età delle quantità di Cyt c nei due gruppi ha mostrato un andamento simile a quello osservato nei gruppi AL-28 e AL{5}} con una diminuzione più rilevante negli animali CR-28 parzialmente prevenuto nei ratti CR-32 più anziani.

2.2.Valutazione dell'età e degli effetti CR sugli enzimi di riparazione del mtDNA

Poiché è stato ampiamente dimostrato che l'invecchiamento è associato all'accumulo di danni al mtDNA, abbiamo misurato, mediante esperimenti di Western blot, in mitocondri epatici isolati l'espressione di due principali enzimi di riparazione del mtDNA, vale a dire la 8-oxo DNA glicosilasi/apurinico o apirimidinico(AP)liasi (OGG1) e apurinico/apirimidinico endonucleasi 1(APE1), entrambi coinvolti nella riparazione dell'escissione della base (BER), che è il meccanismo di riparazione del mtDNA prevalente (Figura 4).

Figura 4. Quantità di proteine ​​OGG1 e APEl nei mitocondri epatici isolati da AL-18, AL-28, CR-28, AL-32 e CR-32-mese -vecchi topi. (A). Nel riquadro, è stata eseguita una macchia occidentale rappresentativa su un ratto da ciascuno dei gruppi analizzati. Le bande immunoreattive, dall'alto verso il basso, rappresentano rispettivamente i segnali provenienti da OGGl e VDAC. L'istogramma mostra la quantificazione dell'intensità delle bande di OGG1 normalizzata all'intensità di VDAC.(B). Nel riquadro, è stata eseguita una macchia occidentale rappresentativa su un ratto da ciascuno dei gruppi analizzati.cistanche benefíciosDall'alto verso il basso, le bande immunoreattive rappresentano, rispettivamente, i segnali provenienti da APE1 e VDAC. L'istogramma mostra la quantificazione dell'intensità delle bande di APE1 normalizzata all'intensità di VDAC. (A, B) I dati rappresentavano i risultati di esperimenti di Western blot triplicati e sono stati analizzati utilizzando il test ANOVA a una via e il test di confronto multiplo di Tukey. Le barre rappresentano i valori medi e SD per i cinque gruppi sperimentali. I dati sono stati normalizzati rispetto al valore dei ratti AL-18, fissato a 1. n: numero di animali analizzati.

Le quantità di proteine ​​intra-mitocondriali di entrambi gli enzimi avevano tendenze simili per quanto riguarda l'età e gli effetti CR. In particolare, OGG1 e APE1 non hanno mostrato alcun cambiamento correlato all'età statisticamente significativo in entrambi i gruppi AL e CR, suggerendo alcun effetto dell'età. Inaspettatamente, anche la CR non ha indotto alcun effetto significativo sulle quantità di OGG1 e APE1 nel gruppo CR-28 rispetto agli animali AL della stessa età, nonché tra i gruppi di 32-mesi.

2.3. Valutazione dell'età e degli effetti CR sulla dinamica mitocondriale

Avendo precedentemente riportato un marcato effetto dell'età sull'espressione delle proteine ​​coinvolte nella fusione (MFN2) e nella fissione (DRP1)[16], abbiamo valutato qui gli effetti della CR su un lungo arco di tempo su questi marcatori. Pertanto, le quantità proteiche di MFN2 e DRP1 sono state determinate, mediante esperimenti di Western blot, in mitocondri epatici isolati da tutti i gruppi di ratti (Figura 5).

Figura 5. Quantità di proteine ​​MFN2 e DRP1 nei mitocondri epatici isolati da AL-18, AL-28, CR-28, AL-32 e CR-32-mese -vecchi topi. (A). Nel riquadro, è stata eseguita una macchia occidentale rappresentativa su un ratto da ciascuno dei gruppi analizzati. Dall'alto verso il basso, le bande immunoreattive rappresentano, rispettivamente, i segnali di MFN2 e VDAC. L'istogramma mostra la quantificazione dell'intensità delle bande di MFN2normalizzate all'intensità di VDAC.(B). Nel riquadro, è stata eseguita una macchia occidentale rappresentativa su un ratto da ciascuno dei gruppi saggiati. Le bande immunoreattive, dall'alto verso il basso, rappresentano rispettivamente i segnali provenienti da DRP1 e VDAC. L'istogramma mostra la quantificazione dell'intensità delle bande di DRP1 normalizzata all'intensità di VDAC. (A, B) I dati rappresentano i risultati di esperimenti di Western blot triplicati e sono stati analizzati utilizzando il test ANOVA a una via e il test di confronto multiplo di Tukey. Le barre rappresentano i valori medi e SD per i cinque gruppi sperimentali. I dati sono stati normalizzati rispetto al valore dei ratti AL-18, fissato a 1. *p<0.05 versus="" al-18=""><0.05 versus="" al-28="" rats.n:="" number="" of="" analyzed="">

Abbiamo riscontrato una diminuzione statisticamente significativa correlata all'età (-43 percento) di MFN2 nei ratti AL-28 rispetto ai controlli AL-18. Tale diminuzione è stata prevenuta nei ratti AL-32 che mostravano un effetto dell'età complesso, simile a quello riportato per Cyt c. Tuttavia, a differenza di Cyt c, la CR ha avuto un effetto molto positivo sugli animali di 28-mese, prevenendo nei ratti CR-28 la diminuzione correlata all'età degli animali AL{10}} e portando a un significativo aumento marcato (più 52 per cento) in MFN2 rispetto alla controparte di pari età AL. Inoltre, la quantità di MFN2 nei ratti CR-28 non era diversa dal valore nei controlli AL-18, indicando un'efficace prevenzione dell'effetto correlato all'età. Non è stata trovata alcuna differenza significativa tra i gruppi AL-32 e CR-32, indicando così un effetto limitato della CR negli animali più vecchi. Inoltre, non è stato riscontrato alcun effetto correlato all'età per MFN2 nel gruppo AL-32 rispetto alla controparte AL-18. Allo stesso modo, le quantità di proteina DRP1 hanno mostrato una marcata diminuzione correlata all'età (-49 percento) nei ratti AL-28 rispetto al gruppo AL-18 che è stata prevenuta dalla CR nel {{29} }}animali di un mese. In effetti, il gruppo CR-28 ha presentato una differenza positiva (più il 50 percento) rispetto a quello AL-28, dimostrando un forte effetto CR. Tuttavia, l'assenza di una differenza tra AL-32 e CR-32 per quanto riguarda le quantità di proteina DRP1 indicava ulteriormente un'efficacia limitata di CR nell'invecchiamento prolungato. Anche in questo caso non si rilevava alcun effetto età evidente anche per gli importi DRP1 passati dal gruppo AL-18 a quello AL{39}}. Quindi, abbiamo determinato i valori dell'indice di fusione (FI come rapporto tra MFN2/DRP1 per ciascuno dei ratti esaminati (Figura 6).

I valori FI nel gruppo AL{{0}} coprivano un intervallo ristretto che andava da 1,37 a 2,64, mentre nel gruppo AL-28 tutti i valori erano più alti, da 2,20 a 8,24 . I valori FI del gruppo CR{{10}} variavano da 0,99 a 5,14 ed erano abbastanza simili a quelli dei ratti AL-18. Negli animali AL-32, i valori FI variavano da 0,70 a 2,27, coprendo così un intervallo simile a quello del gruppo AL-18 che suggerisce l'assenza di un marcato effetto dell'età. Nel gruppo CR-32, i valori FI variavano da 0,87 a 2,02 ed erano paragonabili a quelli degli animali AL-32, supportando così l'idea che l'invecchiamento prolungato (32 mesi) potrebbe essere meno sensibile alla CR rispetto all'invecchiamento (28 mesi).

L'analisi statistica dei valori FI di tutti i gruppi è presentata in Figura 7. Nel confronto tra i gruppi AL-18 e AL-28, il valore FI più alto di questi ultimi indicava un'alterazione legata all'età di equilibrio dinamico. Per quanto riguarda i ratti trattati con CR, il valore del gruppo CR-28 non era diverso da quello della controparte AL-18 e supportava l'efficacia della dieta nel confronto con le controparti alimentate con AL della stessa età . Analizzando i valori di AL-32 e CR{10}} di FI è risultata evidente l'assenza di una differenza significativa tra loro, rafforzando l'idea di una ridotta efficacia della dieta negli animali raggiungendo naturalmente un invecchiamento prolungato. Inoltre, i valori FI di entrambi i 32-gruppi di un mese non erano diversi dalla controparte AL-18, a sostegno dell'assenza di un marcato effetto dell'età negli animali più anziani.

Questo articolo è estratto da Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 1665