Lo stato attuale della neuroprotezione nelle cardiopatie congenite Parte 3

3.2. Valutazione semiquantitativa del DNA mitocondriale ectopico

Le immagini della colorazione Hsp60 (la matrice mitocondriale) e della colorazione istone-H2B (il marcatore nucleare) sono state sottratte dalle immagini della colorazione dsDNA. Quindi, utilizzando la funzione "AdjustThreshold" del software lmage] (National Institutes of Health), le immagini sono state binarizzate.

I mitocondri sono le fabbriche di energia nelle cellule, responsabili della sintesi di ATP per fornire l'energia necessaria alle cellule. La matrice mitocondriale è il liquido interno dei mitocondri, che contiene una varietà di enzimi e ioni ed è un sito chiave per varie reazioni biochimiche dei mitocondri. La memoria è una delle capacità cognitive più importanti dell’essere umano. Sebbene i due possano sembrare non correlati, sono strettamente correlati.

La ricerca mostra un’interazione tra la matrice mitocondriale e la memoria. Enzimi e ioni nella matrice mitocondriale possono influenzare direttamente l'eccitabilità dei neuroni regolando il metabolismo energetico e lo stato dei canali ionici nelle cellule neuronali, influenzando così la memoria. Inoltre, nella matrice mitocondriale sono presenti una varietà di molecole di segnalazione che possono essere trasmesse ai neuroni a valle attraverso gli assoni e le sinapsi dei neuroni, influenzando l'efficienza di trasduzione del segnale dei neuroni, influenzando così la formazione e il consolidamento della memoria.

Allo stesso tempo, l’attività della memoria influenza direttamente anche lo stato della matrice mitocondriale. Le attività di memoria aumenteranno il consumo energetico dei neuroni e promuoveranno la reazione redox nella matrice mitocondriale, influenzando così il livello metabolico dei mitocondri e l'equilibrio ionico intracellulare, influenzando ulteriormente l'eccitabilità e l'efficienza di trasduzione del segnale dei neuroni.

Pertanto, mantenere una buona salute mitocondriale è fondamentale per mantenere una buona funzione di memoria. Mantenendo buone abitudini di vita, come una dieta regolare, un esercizio moderato, un sonno adeguato, ecc., puoi aiutare a mantenere la salute della matrice mitocondriale. Inoltre, la funzione della memoria può anche essere migliorata attraverso un appropriato intervento farmaceutico per promuovere reazioni biochimiche e segnali all’interno della matrice mitocondriale.

Nella vita quotidiana possiamo esercitare la memoria in molti modi, come leggere, studiare, pensare, giocare, ecc. Allo stesso tempo, dovremmo anche prestare attenzione al mantenimento di una buona salute per preservare al meglio la salute della matrice mitocondriale. Credo che grazie a questi sforzi avremo sicuramente una memoria migliore e affronteremo meglio le varie sfide della vita e del lavoro. Si può vedere che abbiamo bisogno di migliorare la memoria, e la Cistanche deserticola può migliorare significativamente la memoria, perché la Cistanche deserticola può anche regolare l'equilibrio dei neurotrasmettitori, come ad esempio aumentare i livelli di acetilcolina e i fattori di crescita. Queste sostanze sono molto importanti per la memoria e l'apprendimento. Inoltre, Cistanche deserticola può anche migliorare il flusso sanguigno e promuovere l’apporto di ossigeno, il che può garantire che il cervello riceva nutrienti ed energia sufficienti, migliorando così la vitalità e la resistenza del cervello.

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Abbiamo selezionato puncta dsDNA di dimensioni comprese tra 2 e 20 um' (circolarità 0.1-1.0) utilizzando la funzione "Analyze-Analyze Particles". se necessario, le immagini originali venivano esaminate per il conteggio finale. Se il segnale dell'istone H2B fosse piccolo. quindi le immagini sottratte mostravano strutture a forma di ciambella.

Questi rappresentano i dsDNA citosolici di origine nucleare e dovrebbero essere eliminati dalla quantità di dsDNA citosolici di origine mitocondriale. L'intervallo di dimensioni può essere modificato in base al tipo di cellula o all'origine dei campioni istologici. La Figura lE mostra un esempio del conteggio del DNA mitocondriale ectopico

punti utilizzando 1B D.

In alternativa, le immagini della colorazione Hsp60 sono state sottratte dalle immagini della colorazione dsDNA. Quindi, il numero di punti dsDNA è stato contato utilizzando le funzioni "Regola soglia" "Analizza-Analizza particelle". Successivamente, i punti dsDNA senza il segnale istone-H2B sono stati contati mediante osservazione diretta. Quest'ultimo metodo è adatto quando le immagini istone-H2B mostrano un basso rapporto segnale-rumore.

Nel complesso, questo metodo può mostrare chiaramente la fuoriuscita di DNA mitocondriale ectopico nel citoplasma e consente una valutazione oggettiva e statistica di tale DNA mitocondriale ectopico nelle cellule.

4. Discussione

Nel nostro studio, abbiamo sviluppato un metodo che consente il conteggio del DNA mitocondriale citoplasmatico. È stato riportato il rilevamento del DNA mitocondriale citoplasmatico utilizzando tecniche di immunofluorescenza, ma nella maggior parte dei casi i metodi non erano quantitativi per la valutazione del DNA mitocondriale citoplasmatico [15,25]. In un altro studio, è stata condotta la PCR su goccioline per quantificare il DNA mitocondriale circolante [9].

recentemente, Sato et al. [26,27] hanno pubblicato un eccellente protocollo per valutare il DNA citoplasmatico mediante microscopia a immunofluorescenza utilizzando gli anticorpi Lamin B1 (LMNB1) come marcatore della struttura nucleare e la subunità 4 della citocromo c ossidasi (COX4) come marcatore della struttura mitocondriale. Questo protocollo sembra molto utile per quantificare il dsDNA citoplasmatico di origine nucleare.

Tuttavia, quando abbiamo provato la COX4 o altri marcatori della membrana mitocondriale, inclusi sia i marcatori interni che quelli esterni, è stato molto difficile discriminare con precisione il citoplasma dai mitocondri.

Ad esempio, se osservassimo segnali circolari utilizzando un marcatore della membrana mitocondriale e osservassimo segnali dsDNA all'interno, allora questo dsDNA potrebbe rappresentare il DNA mitocondriale all'interno dei mitocondri circolari (normale) o il DNA mitocondriale citoplasmatico all'esterno dei mitocondri a forma di ciambella (ectopico). Abbiamo quindi utilizzato Hsp60 come marcatore che etichetta la matrice mitocondriale per valutare il DNA mitocondriale ectopico nel citoplasma.

Come descritto in una recente revisione [23], esistono molti tipi diversi di DNA citoplasmatico di origine nucleare e la maggior parte di essi sono positivi per i marcatori istonici. A causa della limitazione della combinazione di anticorpi utilizzati per la tripla colorazione, abbiamo utilizzato l'istone H2Ba come marcatore istonico.

Tuttavia, se questa limitazione venisse risolta, H2AX potrebbe essere un marcatore migliore per il dsDNA citoplasmatico di origine nucleare. Il dsDNA citoplasmatico negativo all'istone-H2B è stato osservato raramente nelle cellule HeLa di controllo utilizzate in questo studio, ma tale dsDNA di origine nucleare può essere presente se vengono utilizzate altre linee o condizioni cellulari.

L'ibridazione in situ del DNA mitocondriale utilizzata nel nostro recente articolo è adatta per la valutazione qualitativa, ma potrebbe essere difficile utilizzare l'ibridazione in situ per la valutazione quantitativa [8].

L'ibridazione in situ espone il campione a temperature elevate, che possono provocare deformazione o rumore di alcune parti del campione. D'altra parte, il metodo immunocitochimico presentato in questo articolo può ottenere segnali con un basso rumore di fondo. Nel nostro recente articolo, nelle cellule umane e nel pesce zebra utilizzati come modelli di malattia di Parkinson, abbiamo dimostrato che il DNA mitocondriale era fuoriuscito nel citoplasma, che è tossico per l'organismo. cellule. Abbiamo anche osservato che la quantità di DNA mitocondriale citosolico era aumentata nei tessuti cerebrali post mortem di pazienti con malattia di Parkinson [8].

Queste evidenze suggeriscono che una maggiore quantità di DNA mitocondriale ectopico fuoriuscito dai mitocondri può indurre infiammazioni acute e croniche con conseguenti varie malattie, tra cui il morbo di Parkinson e l'insufficienza cardiaca; pertanto, la sovraregolazione della degradazione del DNA citosolico o l'inibizione dei suoi sensori potrebbe essere un potenziale bersaglio terapeutico per queste malattie [8,28].

Il metodo introdotto in questo articolo per la valutazione quantitativa del DNA mitocondriale ectopico costituisce uno strumento importante per ulteriori ricerche in questo campo.

Contributi dell'autore: HM e MTH hanno formulato le ipotesi, hanno progettato la maggior parte degli esperimenti, hanno eseguito gli esperimenti, hanno analizzato i dati e hanno scritto il manoscritto. NM ha eseguito gli esperimenti relativi alle cellule in coltura. Tutti gli autori hanno letto e accettato la versione pubblicata del manoscritto.

Finanziamento: questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni di AMED (numeri di sovvenzione JP21gm6110028 e JP19dm0107154 (HM)), Takeda Science Foundation (HM), JSPS KAKENHI (numeri di sovvenzione JP14516799 (HM), JP 16690735 (HM) e JP 17925674 (HM) ), JST (Moonshot R&D; numero di sovvenzione JPMJMS2024 (HM)) e Sovvenzioni in aiuti da TBRF (numero di sovvenzione TBRF-RF 21-135 (HM)).

Dichiarazione sulla disponibilità dei dati: i dati e gli strumenti descritti in questo manoscritto sono disponibili su richiesta.

Ringraziamenti: Ringraziamo Shinano Kobayashi per aver partecipato a discussioni utili e fornito supporto continuo. Riconosciamo la Tokyo Biochemical Research Foundation (TBRF) per aver fornito una borsa di studio post-dottorato TBRF per ricercatori stranieri a MH (TBRF-RF 21-135).

Conflitti di interessi: gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi.

Riferimenti

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