Gli effetti differenziali di un breve arricchimento ambientale in seguito all'isolamento sociale nei ratti Parte 2

Prova in campo aperto

Per misurare i livelli generali di attività locomotoria è stato utilizzato un campo aperto (72 x 72 x 45 cm). Ciascun animale è stato portato nella sala test 5 prima del test e posto nella camera OFT per altri 5 minuti.

Negli ultimi anni sempre più studi scientifici hanno dimostrato che esiste un legame inestricabile tra attività motoria e memoria. Diversi tipi di attività sportive hanno un effetto significativo sulla promozione della memoria per persone di diverse età, il che è di grande importanza per il nostro studio, lavoro e vita quotidiana.

Le attività fisiche possono stimolare la circolazione sanguigna e il sistema respiratorio del corpo e promuovere il metabolismo. In questo modo, i vasi sanguigni del cervello riceveranno un migliore apporto di sangue e verranno forniti più ossigeno e sostanze nutritive per garantire il normale funzionamento delle cellule cerebrali. Questa buona condizione fisica può aiutarci a concentrarci meglio e a migliorare le capacità di apprendimento e di memoria. Di conseguenza, le persone che praticano regolarmente attività fisica sono generalmente maggiormente in grado di mantenere la memoria e la vitalità mentale.

Inoltre, diversi tipi di attività fisica possono influenzare diversi tipi di memoria. Ad esempio, l'esercizio aerobico come la corsa su lunghe distanze può promuovere la crescita dell'ippocampo, migliorando così la capacità di memoria spaziale delle persone. Attività di coordinazione veloce come giocare a ping pong possono stimolare la memoria della danza e la memoria a breve termine. Per gli anziani, la partecipazione a sport pensanti come gli scacchi può migliorare notevolmente la memoria in termini di intelligenza e cognizione spaziale.

Inoltre, le attività fisiche possono migliorare ulteriormente la memoria riducendo lo stress e migliorando la qualità del sonno. Lo stress e l'insonnia non solo influenzano l'afflusso di sangue e il metabolismo del cervello, ma rendono anche le persone depresse ed esauste, rendendole incapaci di concentrarsi. Attività fisiche appropriate possono distrarre l’attenzione, alleviare lo stress sul corpo e sul cervello, aiutare a migliorare la qualità del sonno, renderci più facile concentrarci sull’apprendimento e sul lavoro e migliorare la memoria.

Per riassumere, le attività fisiche possono favorire la circolazione sanguigna e il metabolismo, migliorare le condizioni fisiche e la salute mentale e quindi favorire il miglioramento della memoria. Pertanto, dovremmo partecipare a vari tipi di attività sportive nella nostra vita quotidiana per mantenere la salute del corpo e del cervello e promuovere il miglioramento della memoria. Si può vedere che dobbiamo migliorare la nostra memoria. La Cistanche deserticola può migliorare significativamente la memoria, perché la Cistanche deserticola può anche regolare l'equilibrio dei neurotrasmettitori, come aumentare i livelli di acetilcolina e fattori di crescita. Queste sostanze sono molto importanti per la memoria e l'apprendimento. Inoltre, la carne può anche migliorare il flusso sanguigno e promuovere l’apporto di ossigeno, il che può garantire che il cervello riceva nutrienti ed energia sufficienti, migliorando così la vitalità e la resistenza del cervello.

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Le sessioni sono state registrate su video utilizzando il software di tracciamento degli animali EthoVision (Noldus, Wageningen, NL) per valutare la durata totale della mobilità e modelli comportamentali specifici, tra cui l'allevamento e la tigmotassi.

Labirinto elevato e più

Per valutare comportamenti di tipo ansioso è stato utilizzato un EPM (Handley & Mithani, 1984; Pellow et al., 1985; Pellow & File, 1986) posizionato a 51 cm sopra il livello del suolo. È costituito da una base in legno con quattro bracci stretti (50×10 cm).

Due bracci opposti sono ricoperti con lati in vetro acrilico trasparente e sono conosciuti come bracci aperti, mentre gli altri due sono chiusi con lati in legno, conducendo a corridoi sostanzialmente più bui.

Ogni animale è stato posto nel compartimento centrale e lasciato nel labirinto per 5 minuti. Il tempo totale trascorso al centro del labirinto, a braccia aperte e a braccia chiuse, è stato registrato e calcolato con EthoVision. Il tempo trascorso a braccia aperte indica un effetto ansiolitico mentre le braccia chiuse sono associate a comportamenti di tipo ansioso (Walf & Frye, 2007).

Labirinto a Y dell'acqua

Abbiamo utilizzato una versione modificata del labirinto a T dell'acqua sviluppato da Del Arco et al. (2007) e convalidato da Locchi et al.(2007). Un labirinto a Y in vetro acrilico costituito da tre bracci distanti 120 gradi (45 × 15,5 × 45 cm ciascuno) è stato riempito con 30 cm di acqua a 24 ± 0,5 gradi per valutare le prestazioni della memoria di lavoro spaziale tramite alternanza spontanea.

Ciascun ratto è stato testato per 5 giorni con sei prove consecutive al giorno, separate da un intervallo tra le prove di 30 s. Gli animali sono stati portati nella sala test 5 minuti prima della prima prova per familiarizzare con l'ambiente. In ciascuna prova, gli animali sono stati posizionati sul lato opposto del braccio di partenza con la testa rivolta verso il centro del labirinto, verso il quale hanno nuotato per scegliere uno dei due bracci bersaglio (Braccio A o Braccio B).

Una piccola piattaforma trasparente è stata posizionata 1 cm sotto il livello dell'acqua in uno dei bracci target (braccio A o braccio B) in modo controbilanciato all'inizio della prima prova e alternata tra i due bracci target per ciascuna prova.

Gli animali che non erano in grado di localizzare la piattaforma entro 60 secondi venivano guidati delicatamente verso di essa per la coda. Dopo l'ultima prova, sono stati posti in una piccola gabbia ad asciugare per 40 minuti prima di essere riportati nelle gabbie di casa. Ogni sessione è stata registrata su video utilizzando EthoVision. Sono stati codificati la latenza per individuare la piattaforma nascosta in ciascuna prova e il numero di voci di braccio errate (errori).

Fissazione della perfusione, lavorazione dei tessuti e immunoistochimica

La fissazione per perfusione degli animali è stata eseguita il giorno 41,24 ore dopo l'ultimo test comportamentale (giorno 5 WYM). Gli animali sono stati rimossi dalle loro gabbie (SI o EE), profondamente anestetizzati con una soluzione di ketamina-xilazina (100-15 mg/kg, IP) e perfusi con paraformaldeide depolimerizzata al 4% (pH7,4).

Dopo la post-fissazione notturna nella stessa soluzione, le sezioni coronali (40-50 μm) sono state tagliate con un vibratomo (VT1000 S, Leica Biosystems, Nussloch, Germania) e risciacquate in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS; pH 7,4).

L'espressione della proteina c-Fos è stata rivelata mediante immunoistochimica per valutare l'effetto delle condizioni abitative sul numero di neuroni spontaneamente attivi in ​​varie regioni del cervello.

La penetrazione nei tessuti è stata ottenuta aggiungendo {{0}},05%Triton X-100 (pH 7,4) a PBS (PBS-Tx). Le sezioni sono state trattate con perossido di idrogeno (0,6%) per 30 minuti a temperatura ambiente (TA) prima di essere trasferite alla soluzione bloccante.

Sono stati bloccati con siero di capra normale al 20% (NGS; Vector Laboratories) in PBS-Tx per 30 minuti a temperatura ambiente e incubati con un anticorpo anti-c-Fos (monoclonale murino, Santa Cruz 8047, concentrazione 1:500) in PBS-Tx con 1%NGS per 3 notti a 4 gradi. Le sezioni sono state quindi risciacquate in PBS (3 × 10 minuti), trasferite in una soluzione di anticorpo secondario (IgG anti-topo biotinilato, 1:250 in PBS-Tx con 1% NGS) e incubate per 2 ore a temperatura ambiente.

Dopo un'altra serie di risciacqui, sono stati incubati con perossidasi avidina-biotinilata (kit ABC, Vector Laboratories) in PBS per 20 minuti a temperatura ambiente. Il prodotto della perossidasi emergeva con un 3,30-diamminobenzidina tetracloridrato idrato potenziato con nichel (DAB,Sigma-Aldrich D5637).

Microscopia e conteggio delle cellule

Abbiamo elaborato un totale di 48 sezioni di 12 animali (6 SI continui e 6 SI a EE; 4 sezioni per animale) con una buona qualità di perfusione. Il numero di nuclei c-Fos-immunopositivi (c-Fos+) è stato quantificato per la corteccia retrospleniale (RSC), la corteccia peririnale agranulare (area 35; PRC), il nucleo laterale dell'amigdala (LA) e il nucleo basolaterale dell'amigdala (BL). .

Le regioni di interesse sono state individuate mediante confronto citologico con un atlante del cervello di ratto (Paxinos &Watson, 2006). Le immagini sono state ottenute con un microscopio epifluorescente (Olympus BX53) dotato di una telecamera CCD monocromatica (Olympus XM10). Le analisi sono state limitate al tessuto selezionato prima dell'immunoistochimica e nessuna sezione aggiuntiva è stata elaborata dopo l'acquisizione dei dati.

Le cellule etichettate sono state contate in modo semiautomatico. Innanzitutto, il numero di cellule c-Fos+ nelle regioni sopra menzionate è stato rilevato e quantificato con il plug-in di conteggio delle cellule (ITCN) in ImageJ (Schneider et al.,2012).

L'ITCN ha prodotto immagini di output che mostrano le cellule rilevate all'interno di ciascuna regione. Due valutatori indipendenti ciechi rispetto alle condizioni sperimentali hanno valutato queste immagini per identificare e contare i casi falsi negativi (cioè cellule debolmente etichettate non rilevate dal software). La media aritmetica di questi due conteggi di cellule false negative è stata aggiunta al numero totale di cellule rilevate dall'ITCN per ciascuna sezione.

Risultati

Variazione di peso

Il peso corporeo degli animali è stato registrato in quattro punti temporali, sia prima (giorni 1, 15 e 31) che dopo la manipolazione EE (giorno 41). Abbiamo trovato un effetto del tempo sul peso corporeo (F (3, 42)=7.69, p < 0.001) e un'interazione del gruppo temporale di pesatura (F (3, 42 )=3.30, p=0.029, 2 × 4 ANOVA mista a due vie), indicando una significativa perdita di peso negli animali EE in seguito all'arricchimento: pesi al giorno 1 (M= 324 .6, SD=15.7), giorno 15 (M=334.6, DS=13.3) e Giorno 31 (M=325.5, DS {{ 33}}.6) erano superiori a quelli del giorno 41 (M=311.9, DS=14; tutti ps < 0,05).

Non si è verificato alcun cambiamento di questo tipo nel gruppo SI continuo (Giorno 1, M=321, SD =12,5; Giorno 15, M=325, SD=15,5; Giorno 31 , M=322.3, DS=15.5; Giorno 41, M=320.1, SD=12.9).

Disperazione comportamentale

Abbiamo valutato gli effetti di una breve manipolazione dell'EE sulla disperazione comportamentale in seguito allo stress indotto dall'SI registrando e confrontando i punteggi complessivi di immobilità FST-2 (Slattery & Cryan, 2012; Yankelevitch-Yahav et al., 2015).

Il livello di immobilità del gruppo SI-EE (M=49.04, SD=21.77) era significativamente più alto di quello osservato nel gruppo SI continuo (M=29.47, SD { {6}}.04; t (14)=2.18, p=0.047,d=1.09, test t di campioni indipendenti; Fig. 2), che indica il comportamento disperazione negli animali esposti a breve EE e relativo effetto antidepressivo dell'SI continuo.

Va notato che il valore di riferimento, ovvero FST-1, i punteggi di immobilità degli animali SI continui (M=41.32, SD=17.02) e gli animali da SI a EE (M {{5 }}.18, SD=11.42) erano molto simili. Pertanto, la differenza osservata nella fase di test del FST non era dovuta a una differenza di base nell'attività locomotoria. Allo stesso modo, non è stata osservata alcuna alternanza nei livelli generali di attività locomotoria dopo l'FST-2, come valutato nell'OFT (sotto).

Attività locomotoria e comportamento esplorativo

Abbiamo utilizzato l'OFT per valutare le potenziali differenze nell'attività locomotoria tra gli animali SI continui e SI-EE. Non c'era differenza tra il controllo (M =160.05, SD=53.95) e gli animali da esperimento (M=206.93, SD=76.36; t ( 14)=1.42, p=0.178, test t di campioni indipendenti; Fig. 3), che mostra che l'effetto metabolico (cioè il cambiamento di peso) dell'EE breve non altera l'attività locomotoria complessiva e non interferisce con la FST.

Anche il comportamento di allevamento, un indicatore del comportamento esplorativo, non ha mostrato una differenza significativa tra i gruppi, sebbene gli animali SI toEE spesso mostrassero più allevamenti (M=38.75, SD =31.91) rispetto all'SI continuo animali (M=18.75, SD=11.83; t (14)=1.66, p=0.119, test campione indipendente). Il risultato non è cambiato quando le osservazioni sono state limitate al centro (SI a EE M=2.25, SD=1.75 vs.

continuo SI M {{0}}.38, SD=2.77) o la periferia (SI toEE M=34.25, SD=34.44 vs. continuo SI M=16.38,SD=9.93) dell'OFT (tutti i ps > 0,05). Indipendentemente dai gruppi, la maggior parte del comportamento di allevamento veniva mostrato alla periferia, spesso contro i muri (M=25.31, SD =25.34) invece che al centro (cioè, allevamento indipendente ;M=2.31, DS=2.17; t (15)=3.54, p=0.003, d=1.28,accoppiato test t dei campioni).

Ansia

L'allevamento differenziale e la durata totale trascorsa al centro rispetto alla periferia dell'OFT indicano un'alterazione dei livelli generali di ansia. A seguito di questa osservazione, abbiamo utilizzato una misura standard dell'ansia, l'EPM, e abbiamo confrontato il comportamento simile all'ansia degli animali SI e SI continui con quelli EE.

Abbiamo scoperto che il gruppo da SI a EE ha trascorso molto più tempo a braccia aperte (M=169.25, SD=106.59) rispetto agli animali di controllo (M=60.87, SD { {6}}.51;t (14)=−2.33, p=0.036, d=1.16, test samplet indipendente; Fig. 4), che indica un ansiolitico effetto di un breve arricchimento in seguito allo stress indotto dall'SI.

Memoria di lavoro spaziale

Le prestazioni della memoria di lavoro spaziale sono state valutate per cinque giorni consecutivi nel WYM. Abbiamo riscontrato un effetto significativo nel giorno del test, misurato dalla latenza media per individuare la piattaforma di escape nascosta (F (1.47, 20.64)=12.95,p=0.001, 2 × 5 a due vie ANOVA mista), rivelando che l'apprendimento è stato raggiunto.

I test posthoc corretti da Bonferroni hanno dimostrato che la latenza per individuare la piattaforma era significativamente più elevata il primo giorno (M {{0}}.26, SD=10.13) rispetto al terzo (M=6. 79, SD= 2.25), quarto (M=4.73, SD =1.44) e quinto (M=6.29, SD {{14} }.03) giorni del MMG (allps < 0,05; Fig. 5).

Né un'interazione giorno-condizione del test (F (1.47, 20.64)=2.54, p=0.115) né un effetto principale della condizione sperimentale (F (1, 14)=3 .87, p=0.069, 2 × 5ANOVA mista a due vie).

Abbiamo analizzato il numero totale di voci errate sul braccio (ovvero errori) nelle prove come misura aggiuntiva delle prestazioni della memoria di lavoro e abbiamo riscontrato un effetto significativo del giorno del test (F (4, 56)=4.71, p {{4 }}.002, 2 × 5 mistaANOVA a due vie). I test post-hoc corretti da Bonferroni hanno rivelato che il numero totale di errori è diminuito significativamente il quarto giorno (M=8.69, SD=1.82) rispetto al primo giorno del GMG (M=12 .69, DS=4.27; p < 0,05), indicando che l'apprendimento è stato raggiunto.

Non c'era alcun effetto principale della condizione sperimentale (F (1, 14)=2.46, p=0.139, 2 × 5ANOVA mista a due vie) o un'interazione giorno-condizione del test (F (4, 56)=1.34, p=0.269). Le analisi del tasso di errore indicano che l'apprendimento è stato raggiunto da entrambi i gruppi il quarto giorno. Tuttavia, gli animali da SI a EE hanno mostrato prestazioni apparentemente migliori nei primi 2 giorni del WYM (Fig. 5).

Questa differenza nella latenza per localizzare la piattaforma è diventata significativa il secondo giorno del WYM (da SI a EE M=7.13, SD= 2.63 rispetto a SI M continuo=11.09, SD=4.47; t (14) =2.17, p=0.048, d=1.08, test t di campioni indipendenti), indicando un apprendimento più rapido nella fase iniziale del compito di memoria.

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