Gli effetti di Cistanche Shenqiwan sul danno renale, GRP78 e fattori correlati all'autofagia nei ratti grassi diabetici Zucker con diabete mellito di tipo 2

quantità di soluzione salina normale. I ratti sono stati somministrati continuamente per 4 settimane. La condizione generale dei ratti è stata osservata regolarmente. Sono stati misurati i livelli di glicemia a digiuno (FBG) e 24-ora di microalbumina urinaria (24 h U-mAlb). Il tessuto renale è stato colorato ed è stata osservata la morfologia. L'ultra-microstruttura è stata osservata mediante microscopia elettronica a trasmissione. I livelli di mRNA di GRP78, Beclin-1 e LC3 nel tessuto renale di ratto sono stati esaminati mediante PCR in tempo reale e i livelli proteici sono stati esaminati mediante Western blotting. Risultati Rispetto al gruppo modello, i ratti del gruppo Shenqiwan hanno mostrato

migliore lucentezza della pelliccia, maggiore aumento di peso e più attività; entrambi i livelli di FBG e 24 h U-mAlb erano diminuiti (P ​​<0.05). ILrenidi ratti nel gruppo modello mostratocapillari glomerulari dilatati, membrane basali irregolarmente ispessite, aree mesangiali allargate e sclerosi segmentale; in questi reni sono stati osservati anche atrofia tubulare renale e tessuto fibroso interstiziale renale. Questi cambiamenti patologici sono stati alleviati nel gruppo Shenqiwan. Rispetto al gruppo modello, sia i livelli genici che proteici di GRP78 erano diminuiti (P ​​<0.05) nel gruppo Shenqiwan; il livello proteico di Beclin-1

è stato diminuito (P <{{0}}.05); e il livello proteico di LC3 è stato aumentato (P <0,05). Conclusione Shenqiwan può alleviare il danno renale nei ratti ZDF e ritardare la progressione della malattia renale diabetica riducendo lo stress del reticolo endoplasmatico e migliorando l'autofagia.

 

Parola chiave: Shenqiwan;diabete mellito di tipo 2; ; stress del reticolo endoplasmatico;autofagia; GRP78; Ratti grassi diabetici di Zucker

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Malattia renale diabetica(DKD) è un'importante complicanza microvascolare didiabete mellitoe una delle principali cause dimalattia renale allo stadio terminale[1]. DKD è un importantecomplicanza microvascolare del diabeteEuna delle principali cause di malattia renale allo stadio terminale[1]. I pazienti con DKD possono presentare proteinuria persistente e persistentemente ridottavelocità di filtrazione glomerulare[2]. ILpatogenesi della DKDè complesso e studi recenti hanno dimostrato che lo stress del reticolo endoplasmatico (ERS) nel rene è la causa più comune di malattia renale allo stadio terminale. （Anche lo stress del reticolo endoplasmatico (ERS) e l'autofagia sono strettamente correlati alla DKD e lo studio della loro patogenesi può essere importante per il trattamento della DKD. DKD è più simile alla "estinzione inferiore" nella categoria dei disturbi della sete nella medicina cinese.
I sintomi tipici della sete, del bere eccessivo e della minzione sono registrati nel Jin Kui Yao (Essenziale dell'oroscopo d'oro) e nelPillola di Qi del renesi propone come principale formula terapeutica. Il Jin Kui Yao (金匮要略) registrava i sintomi tipici della sete e della minzione eccessiva e proponeva ilPillola di Qi del renecome formula di trattamento principale. Il trattamento della DKD con MTC può effettivamente proteggere efficacemente la funzione renale e ha caratteristiche sicure e affidabili [5-6]. Il trattamento della DKD con la medicina cinese può proteggere efficacemente la funzione renale e ha caratteristiche sicure e affidabili [5-6]. L'efficacia di Kidney Qi Pill nel tonificare i reni e aiutare lo Yang è stata confermata in studi correlati [7]. Anche il nostro studio precedente Il nostro studio precedente ha anche mostrato che le pillole di qi renale hanno buoni effetti protettivi sulla struttura e sulla funzione dei tessuti renali nei topi diabetici [8]. Nel presente studio, abbiamo osservato gli effetti della pillola di qi renale sul danno del tessuto renale, ERS e fattori associati all'autofagia nel ratto grasso diabetico Zucker (ZDF). In questo studio, abbiamo studiato i possibili meccanismi di danno renale nei ratti ZDF osservando gli effetti delle pillole renali di qi sudanno tissutale renale, ERS e fattori correlati all'autofagia mediati dalle pillole di qi renale.

1 Materiali
1.1 Animali da esperimento
Ratti ZDF maschi SPF di venti 12-settimane (massa corporea 390-410 g, alimentati con cibo per roditori di alta qualità 5C08 per 4 settimane per completare l'induzione del diabete di tipo 2) e sette 12-settimane- vecchi ratti maschi SPF Zucker Lean (ZL) (massa corporea 350-380 g) sono stati acquistati da Beijing Viton Lehua Laboratory Animal Technology Co. Tutti i ratti sono stati alloggiati nell'ambiente barriera dell'Institute of Clinical Medicine, China-Japan Friendship Hospital , numero di licenza: SYXK (Beijing) 2016-0043, e la piattaforma ha fornito un sistema di ventilazione indipendente all'interno della barriera, mantenendo un'alternanza di 12- ore di luce e buio, una temperatura ambiente di 23-25 gradi e un'umidità relativa della stanza del 50 percento -60 percento . Tutti i ratti potevano bere e nutrirsi liberamente durante il periodo di alimentazione.

1.2 Revisione etica
Gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal sottocomitato per l'etica degli animali sperimentali del comitato accademico dell'Università di medicina tradizionale cinese di Pechino (BUCM) con il numero di approvazione BUCM-4-2021102801-4034.
1.3 Principali farmaci e reagenti
Le tavolette (Shu Di Huang, Shan Yu Fei, Shan Yao, Mudan Pi, Fu Ling,Cistanche, Ze Xie, Gunner's Fructus, Gui Zhi) per il decotto diRene QiLa pillola è stata acquistata da Beijing Tong Ren Tang Co. Soluzione fisiologica, specifica: 500 ml, fornita da Shandong Hualu Pharmaceutical Co. Silver Staining Solution (Beijing Regen Biotechnology Co., Ltd., Lot No. DG0090), Magic SYBR Mixture (Jiangsu Kangwei Century Biotechnology Co., Ltd.), kit di trascrizione inversa mRNA (Thermo Fisher Scientific, Inc.), reagente RNA TRIzol (reagente RNA TRIzol), reagente RNA TRIzol (reagente RNA TRIzol). Reagente RNA TRIzol (Beijing Solabao Technology Co., Ltd.), kit ELISA per microalbumina urinaria di ratto (Jiangsu Kote Biotechnology Co., Ltd., lotto n. KT8560-A), anticorpo GRP78 BiP, anticorpo LC3B e Beclin{ {5}} Anticorpo (Abcam, Regno Unito) (numeri di lotto: ab108613, ab192890, ab207612), anticorpo policlonale anti-GAPDH di coniglio (Proteintech, USA), IgG(H&L)-HRP anti-coniglio di capra (Beijing Baiao Yijie Technology Co. srl).

 

Misuratore di glicemia, strisce reattive per glicemia (Shanghai Roche Diagnostic Products Co. Ltd.), centrifuga ad alta velocità a bassa temperatura (Eppendorf, Germania), strumento PCR quantitativo a fluorescenza, doppio strumento per elettroforesi verticale e strumento per elettroforesi di trasferimento (Burroughs Life Medical Products Co. Ltd.), gel imager (Protein Simple, USA), microscopio ottico (Leica, Germania), microscopio elettronico a trasmissione (Leica, Germania) e gel imager. (Leica, Germania), microscopio elettronico a trasmissione (Hitachi, Giappone).

2 Metodi
2.1 Preparazione di farmaci sperimentali
Il decotto diPillola Rene-Qiè stato preparato convertendo la dose della Kidney-Qi Pill nel Jin Kui Yao [9] secondo i rapporti antichi e moderni del sistema metrologico Han nella prima edizione di "Study on the Dose and Proportion of Typhoid Prescriptions" [2015 ], e la dose del decotto richiesta per l'esperimento era la seguente: Shu Di Huang 24 g, Shan Yu Fei 12 g,Cistanche10 g, Shan Yao 12 g, Mudan Pi 9 g, Fu Ling 9 g, Ze Xie 9 g, Gunnera 3 g e Gui Zhi 3 g. I farmaci sono stati immersi in acqua distillata per 2 ore. Il decotto è stato poi concentrato per 30 min e filtrato attraverso garza sterile. Decotto le erbe per 30 min, quindi aggiungere i restanti farmaci e decotto per 1 h. Dopo che la temperatura della soluzione è stata abbassata a temperatura ambiente, la soluzione viene concentrata e filtrata attraverso una garza sterile e il filtrato viene confezionato e conservato a -20 gradi . Il farmaco deve essere conservato per non più di 1 settimana e la soluzione deve essere portata a temperatura ambiente prima della somministrazione.

2.2 Creazione e raggruppamento di modelli animali
I ratti ZDF sono stati indotti con una dieta ricca di grassi 5C08 per 4 settimane e la glicemia è stata misurata mediante prelievo di sangue dall'estremità della coda a 12 settimane di età. Ai ratti nel gruppo della pillola del qi del rene è stato somministrato un decotto acquoso della pillola del qi del rene e la dose giornaliera di 8,12 g/kg per ratto è stata calcolata secondo la formula in "Modelli di malattia negli animali da esperimento" [10] e la concentrazione di dosaggio era di 0,812 g/mL e ai ratti nei gruppi modello e di controllo è stata somministrata soluzione fisiologica nel volume corrispondente per 4 settimane.

2.3 Condizione generale e test della glicemia a digiuno (FBG) nei ratti
Le condizioni generali dei ratti sono state osservate e registrate giornalmente e le masse corporee sono state pesate regolarmente. Alla fine delle 12 settimane e delle 16 settimane di età, il sangue è stato prelevato dalla punta della coda dei ratti dopo 8 ore di digiuno e l'FBG è stato misurato dal glucometro Roche e dalle strisce reattive. 2.4 La 24-h microalbumina urinaria (24-h U-mAlb) è stata misurata alla fine delle 16 settimane di età e la concentrazione di 24-h U-mAlb è stata misurata secondo le istruzioni del kit Lisa.

2.5 Raccolta di campioni di tessuto renale
Alla fine delle 16 settimane di età, tutti i ratti hanno digiunato per 8 ore. Dopo l'anestesia, la cavità addominale è stata aperta e i reni bilaterali sono stati esposti e il peritoneo è stato rimosso intatto e staccato. La corteccia renale è stata separata e parzialmente fissata in paraformaldeide al 4% per la preparazione di sezioni di paraffina da 3 μm; parzialmente tagliato in blocchi di tessuto da 1 mm3 e fissato in glutaraldeide al 2,5% per la preparazione di sezioni ultrasottili. I restanti tessuti renali sono stati conservati a -80 gradi per i test Realtime PCR e Western blotting.

 

2.6 Applicazione dell'osservazione morfologica dei tessuti renali
La colorazione PAS, la colorazione Masson e la colorazione esaammonio argento-ematossilina-eosina sono state utilizzate per osservare ilalterazioni istopatologiche renalial microscopio ottico e per acquisire immagini. La microscopia elettronica a trasmissione è stata applicata per osservare i cambiamenti ultrastrutturali dei tessuti renali e sono state raccolte immagini.

 

2.7 Saggio PCR in tempo reale
Congelatotessuti renalisono stati macinati su ghiaccio e il reagente TRIzol è stato aggiunto per estrarre l'RNA totale e centrifugato a 4 gradi con un raggio di 9,5 cm. Il surnatante è stato estratto mediante centrifugazione a 12 000 giri/min per 10 min, quindi centrifugato per 15 min con cloroformio. Il supernatante è stato nuovamente centrifugato per 15 minuti a temperatura ambiente per 10 minuti e il surnatante è stato lavato con etanolo al 75%. espressione a livello di mRNA. I primer sono stati progettati utilizzando il software Primer Premier 5.0 e sintetizzati da Shanghai Bioengineering Co. Ltd. Le sequenze dei primer sono le seguenti.