Gli effetti della naringenina sui profili MiRNA-mRNA nelle cellule HepaRG

Per maggiori dettagli contattare:tina.xiang@wecistanche.com

Astratto: Naringenin, un naturaleflavonoideampiamente presente negli agrumi, è stato segnalato per possedere proprietà antiossidanti, antinfiammatorie ed epatoprotettive come integratore alimentare naturale. Tuttavia, il meccanismo di regolazione della naringenina nel fegato umano rimane poco chiaro. Nel presente studio, sono stati utilizzati il ​​sequenziamento dell'RNA messaggero (mRNA-seq), il sequenziamento del microRNA (miRNA-seq) e la qPCR in tempo reale per distinguere le differenze di espressione tra le cellule HepaRG trattate con naringenina e di controllo. Abbiamo ottenuto 1037 mRNA differenzialmente espressi e 234 miRNA. Secondo la previsione del target e l'analisi di integrazione in silico, abbiamo trovato 20 potenziali coppie di miRNA-mRNA coinvolte infegatometabolismo. Questo studio è il primo a fornire una prospettiva delle interazioni miRNA-mRNA nella regolazione della naringenina attraverso l'analisi integrata di mRNA-seq e miRNA-seq nelle cellule HepaRG, che caratterizza ulteriormente il valore nutraceutico della naringenina come additivo alimentare.

Parole chiave: naringenina; mRNA-seq; miRNA-seq; cellule HepaRG

fare clic per ottenere maggiori informazioni sul prodotto

1. Introduzione

Naringenina, un flavonoide naturale, si trova abbondantemente negli agrumi e in altri frutti commestibili, come pompelmi, arance, bergamotto, pomodori e fichi [1]. Dopo somministrazione orale, la naringenina è ampiamente distribuita nel tratto gastrointestinale e nel fegato [2,3] e mostra una proprietà antiossidante diretta grazie all'attività di scavenging dei radicali liberi a causa della sua struttura molecolare e induce il sistema antiossidante endogeno nel fegato [4]. Prove crescenti da studi sia in vitro che in vivo hanno identificato varie capacità protettive della naringenina, comeantinfiammatorio[5], antiossidante [6], antifibrosi [Z] ed epatoprotettivo 4,8| attività. Queste capacità suggeriscono che la naringenina dietetica potrebbe essere applicata per prevenire la sindrome metabolica e malattie maligne, tra cui epatite fulminante, grassomalattia del fegato, fibrosi, ecc. 19,10]. Tuttavia, ci sono pochi studi dettagliati sugli effetti regolatori della naringenina sui geni complessivi del fegato [4].

I microRNA (miRNA) sono una classe di molecole di RNA a filamento singolo non codificanti con una lunghezza di 18-26 nucleotidi codificati da geni endogeni, che esibiscono un'ampia gamma di funzioni di regolazione biologica nella filogenesi, differenziazione, proliferazione e apoptosi [11]. miRNA, legando gli RNA messaggeri (mRNA) mediante riconoscimento specifico della sequenza, regola negativamente l'espressione genica a livello post-trascrizionale attraverso la degradazione degli mRNA bersaglio [12]. Sotto stimolazione esogena, l'espressione del miRNA viene alterata e quindi l'espressione dell'mRNA bersaglio viene regolata. Alla fine, ampie funzioni fisiologiche vengono modificate per far fronte alle sfide causate dalla stimolazione esogena [13]. Un metodo più affidabile per prevedere le relazioni target miRNA-mRNA consiste nell'integrare simultaneamente l'analisi mRNA-seq con l'analisi miRNA-seq utilizzando un particolare contesto di elaborazione in silico [14].

Pertanto, il nostro obiettivo era studiare gli effetti della naringenina sui geni globali ed evidenziare il possibile meccanismo di regolazione delle coppie di miRNA-mRNA nel fegato. Nel presente studio, i cambiamenti di espressione di mRNA e i profili di espressione di miRNA sono stati studiati nelle cellule HepaRG eseguendo analisi di mRNA-seq, miRNA-seq, bioinformatica e qPCR in tempo reale per fornire prove del potenziale della naringenina come integratore alimentare naturale.

2. Risultati

2.1. Analisi del sequenziamento del trascrittoma nella risposta alla naringenina

Per identificare i cambiamenti di espressione dell'mRNA dicellule HepaRGin risposta alla naringenina, otto librerie di DNA(cDNA) complementari nel gruppo di controllo (CK-1, CK-2, CK-3 e CK-4) e nel gruppo sperimentale (T-1, T-2, T-3 e T-4) sono stati costruiti con RNA totale e sottoposti al sequenziamento Illumina HiSeq2500 (Genedenovo Biotechnology Co., Ltd, Guangzhou , Cina). Panoramica dei risultati di sequenziamento e assemblaggio per il gruppo di controllo e il gruppo sperimentale sono mostrati nella Tabella 1. I cambiamenti dell'espressione genica sono stati analizzati confrontando i gruppi trattati e di controllo. Come mostrato nella Figura la, il gruppo esposto alla naringenina ha espresso 1037 geni differenzialmente espressi (DEG) rispetto al gruppo di controllo. Una mappa di calore di 1037 DEG ha mostrato l'analisi del cluster del gruppo di controllo e del gruppo naringenina (Figura 1b; 381 geni up-e 656 down-regolati; Tabella S1, Materiali supplementari).

Secondo il sistema di classificazione Gene Ontology (GO), 1037 DEG sono stati classificati in tre categorie funzionali principali (processo biologico, componente cellulare e funzione molecolare) e 61 sottocategorie (Figura 2). Tra i processi biologici, il processo cellulare(731) era quello più comunemente rappresentato, seguito dal processo mono-organismo (672) e dalla regolazione biologica (595). Nella categoria dei componenti cellulari, una percentuale significativa di cluster è stata assegnata a cellula(727), parte cellulare (721) e organello(580). I geni coinvolti nei gruppi di legame (666) e di attività catalitica (238) erano rappresentati in particolare nella categoria della funzione molecolare.

La classificazione dell'Enciclopedia dei geni e dei genomi (KEGG) di Kyoto è stata trovata per 1037 DEG che sono stati ulteriormente classificati tra i primi venti percorsi biochimici in base al valore q più piccolo e al numero Gene più grande nell'annotazione del percorso (Figura 3). Il GeneNumber e il rapporto tra i geni annotati delle prime cinque vie sono lupus eritematoso sistemico (33,8,4 percento), alcolismo (38,9,67 percento), cattiva regolazione trascrizionale nei tumori (22, 5,6 percento), via di segnalazione PI3K-Akt (34, 8,65 percento), e complemento e cascate di coagulazione (12, 3,05 percento o). C'erano più di 10 geni arricchiti tra i cinque percorsi. Nel complesso, il trattamento con naringenina ha avuto un impatto significativo sul profilo di espressione genica globale delle cellule HepaRG. Questi risultati implicavano che i geni coinvolti in questi percorsi potessero svolgere ruoli cruciali nella regolazione della naringenina.

2.2. Analisi dei livelli di trascrizione di miRNA in risposta alla naringenina

In questo studio, abbiamo mirato a determinare senaringeninal'esposizione altera i livelli di espressione dei miRNA nelle cellule HepaRG. Dopo l'esposizione, abbiamo raccolto piccoli RNA e misurato la loro abbondanza relativa utilizzando Illumina HiSeq2500 (Genedenovo Biotechnology Co., Ltd, Guangzhou, Cina). Come mostrato nella Tabella 2, sono state generate letture pulite di otto campioni, rispettivamente, dopo aver rimosso le letture dei contaminanti. Una panoramica delle letture per il sequenziamento di piccoli RNA da dati grezzi ad alta qualità e con filtraggio di qualità è fornita nella Tabella 2. Le distribuzioni di lunghezza di piccoli RNA erano simili tra le librerie in quanto 21-23 nt RNA erano i più abbondanti (Figura 4 ).

Tutti i piccoli RNA sono stati allineati nel database GeneBank (Release 209.0) e nel database Rfam (11.0) per identificare e rimuovere l'RNA ribosomiale (rRNA), il piccolo RNA condizionale (scRNA), piccolo nucleolare (snoRNA), piccolo nucleo (snRNA) e RNA di trasferimento (tRNA). In accordo con il genoma di riferimento, anche questi piccoli RNA mappati su esoni, introni e sequenze ripetute sono stati rimossi. I piccoli RNA filtranti sono stati ricercati nel database miRBase (versione 21) per identificare i miRNA. La mappa termica di 3373 miRNA mostra l'analisi del cluster del gruppo di controllo e del gruppo naringenina nella Figura 5a. Il profilo Illumina HiSeq2500 dei 3373 miRNA analizzati nell'esposizione alla naringenina rispetto ai campioni di controllo ha mostrato che un totale di 234 miRNA differenzialmente espressi (DEM, 174 up-e 60 down-regolati; Tabella S2, Materiali supplementari) erano rilevabili nelle cellule HepaRG (Figura 5b) .

2.3. Previsione del target e analisi dell'integrazione dei profili di espressione di mRNA e miRNA in risposta alla naringenina

Agendo a livello post-trascrizionale, i miRNA silenziano e/o regolano verso il basso l'espressione genica dell'mRNA cellulare mediante la scissione dell'RNA bersaglio. Per prevedere i geni bersaglio di 234 DEM, abbiamo eseguito analisi computazionali utilizzando RNAhybrid (v2.1.2) più lucernario (v6 .01), Miranda (v3.3a) e TargetScan (versione:7.0). La profilazione simultanea di 234 DEM e 1037 DEG livelli in silico può identificare i presunti mRNA bersaglio dei miRNA. Abbiamo selezionato l'intersezione di DEG e geni bersaglio di DEM e quindi eseguito l'analisi bioinformatica su questi geni di intersezione. Sono state ottenute un totale di 5607 coppie di miRNA-mRNA negative per il trattamento con naringenina, con il coinvolgimento di 216 DEM e 681 DEG (Tabella S3, Materiali supplementari). In linea con il sistema di classificazione GO, 681 DEG sono stati classificati in 58 sottocategorie (Figura 6). Le prime tre sottocategorie non erano cambiate in tre categorie funzionali principali rispetto all'analisi del sequenziamento del trascrittoma (Figure 2 e 6).

L'analisi dell'arricchimento del percorso per 681 DEG di 5607 coppie di miRNA-mRNA negativi ha identificato i primi venti percorsi in base al valore q più piccolo e al più grande GeneNumber nell'annotazione del percorso dopo l'esposizione alla naringenina (Figura 7): con la via di segnalazione PI3K-Akt (25,8,96 percent ) essendo l'ottavo percorso e il secondo più abbondante.

2.4. Validazione qPCR in tempo reale della regolazione della naringenina nel metabolismo epatico e potenziali coppie di miRNA-mRNA regolatori

Secondo le annotazioni della funzione genica globale, la revisione della letteratura e la loro potenziale relazione con i miRNA sensibili alla naringenina, 19 DEG (ALOX15, CA9, TH, HKDC1, NDUFA4L2, RRM2, ACSL5, PLA2G4C, LIPT2, UGDH, FTCD, ABAT, AZIN2, HS6ST3 , B4GALT6, GUSB, DCT, ALAS2 e MAT1A) sono stati selezionati manualmente come rappresentanti per i loro potenziali ruoli nel metabolismo del fegato. Inoltre, la via di segnalazione PI3K-Akt era stata significativamente arricchita (quarta nel KEGG dell'analisi RNA-seq, Figura 3; ottava nel KEGG dell'analisi miRNA-RNA-seq, Figura 7); pertanto.11 GRADI (PDGFRB. CSF1R. FGFR2, IL2RG, IL7R, ITGB4, GNG4, PCK1, CREB3L3, CREB3L1 e NFkB1) tra la via di segnalazione PI3K-Akt sono stati esclusi.

Abbiamo qui descritto l'interazione tra i 30 DEG e 11 miRNA umani (hsa-miR-1306-5p, hsa-miR-627-3p, hsa-miR-194-3p, hsa-miR{{9 }}p, hsa-miR-6837-5p, hsa-miR-429, hsa-miR-100-3p, hsa-miR-194-5p, hsa-miR{{19} }a-3p, hsa-miR-7-5p e hsa-miR-200a-5p), incluse 20 interazioni negative miRNA-mRNA (Figura 9). Come mostrato nella Figura 9, un singolo miRNA può regolare più mRNA target e viceversa (ad esempio, ABAT HS6ST3, B4GALT6 e DCT potrebbero essere regolati simultaneamente da hsa-miR-429; HS6ST3 può essere regolato simultaneamente da hsa-miR -429, hsa-miR-100-3p,hsa-miR-519a-3p, hsa-miR-676-3p, hsa-miR-7-5 p e hsa-miR-194-5p; alcuni DEG non avevano DEM accoppiati). I profili di espressione di 19 DEG relativi al metabolismo del fegato e 11 DEG tra la via di segnalazione PI3K-Akt sono stati ulteriormente convalidati utilizzando qPCR in tempo reale (Figura 9a, b). Il livello di espressione di 11 miRNA umani (due up-e nove down-regolati) è stato ulteriormente valutato per i cambiamenti indotti dalla naringenina mediante qPCR in tempo reale coerenti con i risultati del sequenziamento (Figura 9c). Sebbene vi fossero alcune differenze quantitative tra le due piattaforme analitiche, le somiglianze tra i dati RNA-seq e la PCR in tempo reale suggerivano che i dati RNA-seq fossero riproducibili e affidabili.

3. Discussione e Conclusioni

I risultati discussi qui rivelano le prime informazioni dettagliate sui cambiamenti di espressione paralleli di mRNA e miRNA nelle cellule HepaRG in risposta anaringenina. Abbiamo eseguito un'analisi integrativa di questi dati inclusi 234 DEM e 1037 DEG indotti dalla naringenina, che forniscono informazioni globali sulle interazioni miRNA-mRNA della naringenina nel meccanismo di regolamentazione. Secondo le annotazioni sulla funzione genica e la revisione della letteratura, sono stati esclusi 19 DEG relativi al metabolismo. In particolare, la via di segnalazione PI3K-Akt è stata significativamente arricchita sia nell'analisi del sequenziamento del trascrittoma (il terzo più abbondante e quarto classificato) sia nell'analisi di integrazione dei profili di espressione di miRNA-mRNA (il secondo più abbondante e ottavo classificato) nelle risposte alla naringenina. Inoltre, 11 DEG nella via di segnalazione PI3K-Akt sono stati ulteriormente convalidati utilizzando l'analisi qPCR in tempo reale. In questo lavoro, abbiamo costruito una rete di regolazione del miRNA-mRNA in base ai set di dati DEM e DEG e alle informazioni sul miRNA-targeting. Alcuni studi hanno dimostrato che la rete di regolazione del miRNA-mRNA rispondedanno al fegato, compreso il carcinoma epatocellulare e lo stress ossidativo [15]. Sebbene siano stati identificati diversi fenomeni di attivazione dell'RNA indotti da miRNA [16], nella maggior parte dei casi, la correlazione negativa tra i miRNA e i loro mRNA target è spesso considerata un supporto per il targeting dei miRNA [17]. Infine, sono state identificate 20 coppie di correlazione negativa miRNA-mRNA con il coinvolgimento del metabolismo epatico e la via di segnalazione PI3K-Akt.

Per quanto riguarda i geni globali, abbiamo affrontato la nostra particolare domanda di ricerca utilizzando l'analisi del percorso per evidenziare 19 DEG relativi ai cluster funzionali: metabolismo, incluso il metabolismo dei lipidi (ALOX15, ACSL5, PLA2G4C e B4GALT6), metabolismo energetico (CA9 e NDUFA4L2) , Metabolismo di cofattori e vitamine (TH, LIPT2 e FTCD), Metabolismo degli aminoacidi (RRM2, AZIN2, DCT, ALAS2 e MAT1A), Biosintesi e metabolismo dei glicani (HS6ST3 e GUSB) e Metabolismo dei carboidrati"(HKDC1, PCK1, UGDH e ABAT). Questi 19 DEG arricchiti per il metabolismo sono principalmente coinvolti nella sensibilità all'insulina, nell'accumulo di lipidi, nell'accumulo di glicogeno e nel dispendio energetico. Studi precedenti hanno riportato che la down-regulation di ALOX15 nel danno epatico dei topi indotto dall'alcol [18], CA9 nei topi BALB/C [19], la steatosi epatica non alcolica THin (NAFLD) [20], HKDC1 [21] e l'up-regulation di UGDH [22] possono alleviare significativamente lo stress ossidativo, l'accumulo di lipidi e il danno epatico. Atterramento dell'accumulo di ROS soppresso NDUFA4L2 zione e apoptosi nelle cellule di carcinoma epatocellulare (HCC) [23]. Il silenziamento di RRM2 ha inibito la proliferazione cellulare NCI-H929 [24] e la sovraespressione di FTCD ha soppresso la proliferazione cellulare promuovendo il danno al DNA e inducendo l'apoptosi cellulare nelle cellule HCC [25]. L'ablazione di ACSL5 ha migliorato la sensibilità all'insulina, ha aumentato il dispendio energetico e ha ritardato l'assorbimento dei trigliceridi nei topi [26]. La supplementazione di DCT ha migliorato la steatosi e l'infiammazione epatica associate all'età [27]. La formazione di goccioline lipidiche in seguito alla stimolazione del virus dell'acido grasso e dell'epatite C nelle cellule knockdown PLA2G4C era compromessa [28]. La down-regulation di LIPT2 ha inibito la sintesi degli acidi grassi [29]. L'up-regulation di ABAT [30], AZIN2 [31], B4GALT6 [32], HS6ST3 [33] e GUSB [34] potrebbe promuovere la decomposizione degli acidi grassi e del glicogeno. La sovraespressione di ALAS2 potrebbe migliorare la capacità ematopoietica del fegato [35l, e MAT1A espresso negli epatociti ha mantenuto lo stato differenziato di queste cellule [36]. Coerentemente con i risultati sopra descritti, la regolazione di questi geni metabolici nei nostri risultati potrebbe essere favorevole per migliorare il metabolismo in risposta alla naringenina.

La via di segnalazione PI3K-Akt può offrire indizi per il meccanismo molecolare coinvolto nel metabolismo, nell'infiammazione e nello stress ossidativo [37], che svolge un ruolo fondamentale nella risposta alla naringenina. La via di segnalazione PI3K-Akt ha diversi effetti a valle sul metabolismo cellulare attraverso la regolazione diretta dei trasportatori di nutrienti e degli enzimi metabolici o il controllo dei fattori di trascrizione che regolano l'espressione dei componenti chiave delle vie metaboliche [38,39], tra cui il metabolismo del glucosio, la biosintesi di macromolecole e mantenimento dell'equilibrio redox. È stato riportato che il silenziamento del PDGFRB ha inibito l'attivazione e la proliferazione delle cellule stellate epatiche e ha migliorato la fibrosi epatica [40]. L'inibizione collaborativa di CSF1R e FGFR2 dovrebbe aumentare gli effetti antitumorali mirando all'evasione immunitaria e all'angiogenesi nel microambiente tumorale [41]. Abbattere ITGB4 ha soppresso la glicolisi nei fibroblasti associati al cancro [42]. Il knockdown genetico del PCK1 ha impedito un aumento indotto dagli acidi grassi del flusso ossidativo, dello stress ossidativo e dell'infiammazione [43], che era anche correlato alle vie di segnalazione governate dall'insulina [44]. È stato dimostrato che la sovraespressione di CREB3L3 nucleare induce lipolisi sistemica, chetogenesi epatica e sensibilità all'insulina con un aumento del dispendio energetico [45]. Secondo quanto riferito, l'inibizione di CREB3L1 ha bloccato l'invasione e la metastasi del cancro [46]. NFkB è un regolatore chiave dello sviluppo immunitario, delle risposte immunitarie, dell'infiammazione e del cancro [47]. È stato accertato che la soppressione di NFkB trasduce i segnali antinfiammatori e riduce l'infiammazione [48]. Nella via di segnalazione PI3K-Akt, i nostri risultati hanno mostrato che la naringenina ha ridotto significativamente le espressioni di mRNA di PDGFRB, PCK1, CREB3L1 e NFkB1 con i miRNA correlati (has-miR-1306-5p e hsa-miR{{40} }p) essendo significativamente sottoregolato. Pertanto, i nostri dati hanno suggerito che la naringenina può svolgere un ruolo salutare nello stress antinfiammatorio, antiossidante e nel metabolismo migliorativo attraverso l'inibizione della via di segnalazione PI3K-Akt.

Questo studio è stato il primo a integrare l'analisi di mRNA-seq e miRNA-seq nel fegato in risposta alla naringenina e fornire una prospettiva del metabolismo nella regolazione della naringenina. In termini di metabolismo e via di segnalazione PI3K-Akt, le coppie di 11 DEM, 30 DEG e 20 miRNA-mRNA necessitano di ulteriori ricerche per le attività della naringenina. Ci sono alcuni limiti di questa ricerca; per esempio, gli effetti dose-dipendenti e tempo-dipendenti della naringenina nelle interazioni miRNA-mRNA non erano ancora chiari. Sebbene dati i miRNA analizzati in silico suggeriscano capacità regolatorie, le loro funzioni devono essere ulteriormente certificate in un contesto specifico all'interno di un sistema vivente. In sintesi, abbiamo fornito una ricerca preliminare che analizza l'espressione di mRNA e miRNA e la profilazione del metabolismo. Il meccanismo di regolazione delle coppie miRNA-mRNA potrebbe essere un'ulteriore possibile prova per annotare il valore nutraceutico della naringenina.

4. Materiali e metodi

4.1. Sostanze chimiche e reagenti

La linea cellulare HepaRG è stata originariamente acquistata da Biopredic International (Rennes, Francia). Il mezzo RPMI-1640 e la soluzione di penicillina-streptomicina-glutammina sono stati ottenuti da Gibco (Gaithersburg, MD, USA). Il siero fetale bovino (FBS) è stato acquistato da Corning (Auckland, Nuova Zelanda). Naringenina e dimetilsolfossido (DMSO) provenivano da Sigma-Aldrich (St.Louis, MO, USA). Il reagente TRIzolTM è stato fornito da Thermo Fisher (Carlsbad, CA, USA). L'acqua ultrapura è stata purificata da un sistema di purificazione dell'acqua accademico Milli-O (Millipore, Bedford, MA, USA). Tutti gli altri reagenti erano prodotti commercializzati del più alto grado analitico disponibile.

4.2. Coltura di cellule HepaRG

Le cellule HepaRG sono state seminate a 5×10*cellule/cm- in piastre da sei pozzetti e coltivate in terreno RPMI-1640, coltivate con o senza 100 uM di naringenina per 48 ore e integrate con il 10% di FBS e l'1% di antibiotici (100 U/mL di penicillina e 100 ug/mL di streptomicina) a 37 gradi in un'incubatrice di CO umidificata al 5%. CK-1, CK-2, CK-3 e CK-4 fanno riferimento al gruppo di controllo; T-1, T-2, T-3 e T-4 si riferiscono al gruppo di trattamento con naringenina da 100 μM. I numeri 1, 2, 3 e 4 rappresentano campioni di quattro esperimenti ripetuti indipendenti.

4.3.Estrazione totale dell'RNA

Le cellule HepaRG sono state lavate due volte con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) ghiacciata e raccolte con il reagente TRIzolTM come raccomandato dal produttore. Gli spettrofotometri Thermo Scientific NanoDropTM2000 c (Wilmington, DE, USA) sono stati utilizzati per misurare la qualità e la quantità di RNA di ciascun campione secondo il protocollo del produttore.

4.4.Sequenziamento dell'RNA

L'mRNA è stato arricchito da perline Oligo(dT), quindi l'mRNA arricchito è stato frammentato e trascritto inverso in cDNA con primer casuali dal kit di estrazione PCR OiaOuick (Qiagen, Venlo, Paesi Bassi). Le molecole di RNA in un intervallo di dimensioni di 18-30 nt sono state arricchite mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide. Sono stati aggiunti gli adattatori 3' e 5', quindi gli RNA arricchiti sono stati trascritti inversamente dal kit di estrazione QiaQuick PCR, secondo le istruzioni del produttore (Qiagen, Venlo, Paesi Bassi). I prodotti di legatura sono stati selezionati per dimensione mediante elettroforesi su gel di agarosio. C'erano quattro campioni nel gruppo naringenina e quattro campioni nel gruppo di controllo. Ogni campione ha generato due librerie di cDNA: una per mRNA-seq e l'altra per miRNA-seg. I prodotti amplificati per PCR sono stati arricchiti per generare rispettivamente 16 librerie di cDNA e sequenziati utilizzando Ⅲlumina HiSeq2500 da Genedenovo Biotechnology Co. (Guangzhou, Cina). I dati di sequenziamento dell'RNA e del piccolo RNA sono stati depositati nell'archivio di lettura della sequenza NCBI (numeri di accesso da SRR13675952 a SRR13675963).

4.5. qPCR in tempo reale

La trascrizione dell'mRNA in cDNA è stata condotta con il sistema di trascrizione inversa GoScriptTM (Promega, Madison, WI, USA) da 3 ug di RNA totale, secondo le istruzioni del produttore. Per l'analisi del miRNA, la sintesi del cDNA è stata eseguita con la sintesi del cDNA del primo filamento miRNA (Tailing Reaction, Sangon Biotech, Shanghai, Cina) da 2 ug di RNA totale.

con GoTaq® qPCR Master Mix(Promega, Madison, WI, USA) su un LightCycler 480 (Roche, Mannheim, Germania), come raccomandato dal produttore. La procedura di ciclo termico è iniziata con una denaturazione iniziale a 95°C per 10 min. Questo è stato seguito da 45 cicli di denaturazione per 10 secondi a 95 gradi, legame del primer per 20 secondi a 60 gradi e allungamento per 20 secondi a 72 gradi. La procedura si è conclusa con un'amplificazione finale a 95 gradi per 5 secondi, 65 gradi C per 1 minuto, l'aggiunta di una fase della curva di dissociazione e una fase di raffreddamento. I primer sono stati acquistati da Sangon Biotech (Shanghai, Cina). Le sequenze delle coppie di primer utilizzate per la convalida della firma sono descritte nelle Tabelle 3 e 4. I valori Ct sono stati calcolati in riferimento a -actina o U6.

4.6.Analisi bioinformatica e statistica

DEG e DEM sono stati identificati utilizzando un pacchetto software basato su R. Il valore di soglia per la selezione di DEG e DEM era q-value (valore p aggiustato) Minore o uguale a 0.05 and fold change (FC) Maggiore o uguale a 2 o Minore minore o uguale a 0,5. Le classificazioni KEGG e GO, comprese le funzioni molecolari, i processi biologici e i componenti cellulari, sono state utilizzate per analizzare DEG e DEM.

I risultati del test biologico sono presentati sotto forma di media ± SD sulla base di quattro esperimenti indipendenti in GraphPad Prism 8.

Materiali supplementari: i seguenti sono disponibili online all'indirizzo https://www.mdpi.com/1422-0 067/22/5/2292/s1: Tabella S1, Identificazione di 1037 mRNA differenzialmente espressi in risposta alla naringenina; Tabella S2, Identificazione di 234 miRNA differenzialmente espressi in risposta alla naringenina; Tabella S3, Identificazione di 5607 coppie di miRNA-mRNA negative in risposta alla naringenina, con il coinvolgimento di 216 DEM e 681 DEG in totale

Riferimenti

1. Salehi, B.; Fokou, PVT Il potenziale terapeutico della naringenina: una rassegna di studi clinici. Prodotti farmaceutici 2019, 12, 11. [CrossRef] [PubMed]

2. Bai, Y.; Peng, W.; Yang, C.; Zou, W.; Liu, M.; Wu, H.; Fan, L.; Li, P.; Zeng, X.; Su, W. Farmacocinetica e metabolismo della naringina e del metabolita attivo Naringenina in ratti, cani, esseri umani e differenze tra le specie. Davanti. Farmaco. 2020, 11, 364. [CrossRef]

3. Joshi, R.; Kulkarni, YA; Wairkar, S. Aspetti farmacocinetici, farmacodinamici e formulativi di Naringenin: un aggiornamento. Scienziato della vita 2018, 215, 43–56. [Rif incrociato]

4. Hernández-Aquino, E.; Muriel, P. Effetti benefici della naringenina nelle malattie del fegato: meccanismi molecolari. Mondo J. Gastroenterol. 2018, 24, 1679–1707. [Rif incrociato]

5. Wang, Q.; O, Y.; Abbraccio.; Wen, C.; Yue, S.; Chen, C.; Xu, L.; Xie, J.; Dai, H.; Xiao, H.; et al. La naringenina attenua la steatosi epatica non alcolica sottoregolando la via NLRP3/NF-κB nei topi. fr. J. Pharmacol. 2020, 177, 1806–1821. [Rif incrociato]

6. Khan, TH; Ganaie, MA Naringenin previene la tossicità indotta dalla doxorubicina nei tessuti renali regolando l'insulto ossidativo e infiammatorio nei ratti Wistar. Arco. Fisio. Biochimica. 2020, 126, 300–307. [Rif incrociato]

7. Wang, J.; Ding, Y.; Zhou, W. Liposomi automodificati con albumina per la terapia della fibrosi epatica tramite percorsi SPARC-dipendenti. int. J. Pharm. 2020, 574, 118940. [CrossRef]

8. Kometsi, L.; Governatore, K.; Mofo Mato, EP; Hurchund, R.; Owira, PMO Riducendo lo stress ossidativo, la naringenina attenua la sovraregolazione indotta dall'iperglicemia della proteina del fattore 2 correlata al fattore nucleare epatico eritroide 2-. J. Pharm. Farmaco. 2020, 72, 1394–1404. [CrossRef] [PubMed]

9. Rossino, MG; Casini, G. Nutraceuticals per il trattamento della retinopatia diabetica. Nutrienti 2019, 11, 771. [CrossRef] [PubMed]

10. Hernández-Aquino, E.; Quezada-Ramírez, MA; Silva-Olivares, A.; Casas-Grajales, S.; Ramos-Tovar, E.; Flores-Beltran, RE; Segovia, J.; Shibayama, M.; Muriel, P. Naringenin attenua la progressione della fibrosi epatica attraverso l'inattivazione delle cellule stellate epatiche e delle vie profibrogeniche. Euro. J. Pharmacol. 2019, 865, 172730. [CrossRef] [PubMed]