Il sistema della gliossalasi nelle malattie legate all'età: l'intervento nutrizionale come strategia anti-età Parte 1

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Astratto:Il sistema della gliossalasi è fondamentale per la disintossicazione dei prodotti finali della glicazione avanzata (AGE). Gli AGE sono composti tossici risultanti dalla modifica non enzimatica delle biomolecole da parte degli zuccheri o dei loro metaboliti attraverso un processo chiamato glicazione. Gli AGE hanno effetti negativi su molti tessuti, giocando un ruolo patogeno nella progressione dell'invecchiamento molecolare e cellulare. A causa del declino correlato all'età di diversi meccanismi anti-AGE, inclusi i meccanismi disintossicanti e le capacità proteolitiche, le biomolecole glicate si accumulano durante il normale invecchiamento nel nostro corpo in modo tessuto-dipendente. In questo modo, i sistemi disintossicanti anti-AGE si propongono come bersagli terapeutici per combattere le disfunzioni patologiche associate all'accumulo di AGE e alla citotossicità. Qui riassumiamo lo stato attuale delle conoscenze relative ai meccanismi protettivi contro lo stress da glicazione, con un'enfasi particolare sul sistema della gliossalasi come meccanismo primario per disintossicare gli intermedi reattivi della glicazione. Questa recensione si concentra sulla gliossalasi 1 (GLO1), il primo enzima del sistema della gliossalasi e l'enzima limitante la velocità di questo processo catalitico. Sebbene GLO1 sia espresso in modo ubiquo, i livelli e le attività proteiche sono regolati in modo dipendente dal tessuto. Forniamo un'analisi comparativa della proteina GLO1 in diversi tessuti. I nostri risultati indicano un ruolo per il sistema della gliossalasi nell'omeostasi nella retina dell'occhio, un tessuto altamente ossigenato con un rapido ricambio proteico. Descriviamo anche la modulazione del sistema della gliossalasi come obiettivo terapeutico per ritardare lo sviluppo di malattie legate all'età e riassumiamo la letteratura che descrive le attuali conoscenze sui composti nutrizionali con proprietà per modulare il sistema della gliossalasi.

Parole chiave:stress della glicazione; sistema della gliossasi; invecchiamento; proteotossicità

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1. Introduzione: stress glicativo e invecchiamento malsano

Un numero crescente di letteratura indica che l'accumulo di proteine ​​danneggiate è un segno distintivo dell'invecchiamento e di molte malattie legate all'età, tra cui il diabete di tipo 2, il cancro, i disturbi neurodegenerativi, cardiovascolari e correlati agli occhi [1-7]. Le proteine ​​aberranti compromettono l'omeostasi cellulare formando aggregati non funzionali e tossici e questo porta all'inattivazione non solo della proteina aberrante, ma può anche compromettere la funzione di altre proteine ​​essenziali a causa dello stress o dell'insufficienza del meccanismo di controllo della qualità delle proteine nella cella. Un importante meccanismo che porta a molecole aberranti è una modifica da parte di prodotti finali di glicazione avanzata (AGE).

Vengono generati composti dicarbonilici

da diverse vie metaboliche (Figura 1) che coinvolgono il metabolismo degli zuccheri e dei carboidrati nella dieta per formare AGE. Questi composti dicarbonilici interagiscono con le biomolecole, come proteine, lipidi e acidi nucleici in una modifica post-traduzionale non enzimatica chiamata glicazione. I principali agenti dicarbonilici glicati sono metilgliossale (MG), gliossale o 3-deossiglucosone [8]. Questi dicarbonili vengono mantenuti a bassi livelli in condizioni omeostatiche, ma il processo di invecchiamento aumenta questi reagenti glicativi a livelli patologici, aumentando la formazione di AGE tossici e, in definitiva, compromettendo la forma fisica dei tessuti. Dato che la formazione di AGE dipende dalla concentrazione di glucosio, il consumo di diete ad alto indice glicemico o condizioni diabetiche porta a un drammatico accumulo sistemico di AGE. Ciò è direttamente correlato al metabolismo alterato, all'aumento dell'infiammazione e alla progressione di gravi condizioni mediche. Al contrario, l'assunzione di diete a basso indice glicemico limita l'accumulo di AGE ed è associata alla progressione più lenta di alcune di queste malattie [9-13]. In questo contesto, l'iperglicemia impone ulteriore stress sulla produzione associata all'età di proteine ​​glicate ed esacerba le conseguenze dannose dei depositi di AGEs sulla funzione degli organi.

Figura 1. Diagramma schematico dei percorsi di formazione e disintossicazione dei -dicarbonili contro i danni derivati ​​dall'età nell'invecchiamento. La formazione di -dicarbonili altamente reattivi come il metilgliossale (MG) avviene attraverso la degradazione non enzimatica degli intermedi glicolitici, inclusi diidrossiacetone fosfato e gliceraldeide {5}}fosfato e altre fonti, incluso il metabolismo degli aminoacidi e dei lipidi. Al fine di evitare danni da AGE, il sistema della gliossalasi è un meccanismo primario che limita la sintesi di AGE, convertendo biomolecole altamente reattive, come MG, in biomolecole meno reattive (D-lattato). Questo processo coinvolge l'attività sequenziale di due enzimi GLO1 e GLO2 e la forma ridotta di glutatione (GSH). Altri meccanismi disintossicanti implicano l'attività di DJ-1, aldeide deidrogenasi (ALDH), aldo-cheto reduttasi (AKR) ed enzimi di degradazione dell'acetoacetato. Una volta formati, gli AGE possono essere eliminati da due vie proteolitiche: il sistema ubiquitina-proteasoma (UPS) e l'autofagia. Questi meccanismi protettivi (evidenziati in verde) diminuiscono con l'invecchiamento e contribuiscono all'insorgenza di malattie legate all'età come neurodegenerazione, malattie legate agli occhi (AMD, cataratta, DR), nefropatie, sindrome metabolica e cancro. GLO1: gliossalasi 1; GLO2: gliossalasi 2; GSH: glutatione.

Cistanche può antietà

L'eccessivo stress della glicazione promuove l'insolubilità delle proteine, deregolando le vie di segnalazione e di controllo della qualità delle proteine. Cambiamenti derivati ​​dagli AGEs nelle vie di segnalazione della perturbazione del proteoma nella fisiologia dei tessuti (vie MAP/ERK, JAK-STAT e PI3K-AKT) che portano alla traslocazione nucleare di fattori di trascrizione coinvolti in molteplici funzioni cellulari, tra cui infiammazione, apoptosi, stress ER , autofagia, stress ossidativo, funzione mitocondriale, ecc. (rivisto in [2,14]). Le proteine ​​glicate possono anche sovraccaricare o limitare la funzionalità delle capacità proteolitiche. Questi cambiamenti alla fine contribuiscono all'insorgenza di molteplici disturbi legati all'età.

Numerosi studi hanno dimostrato che la formazione di MG e AGE derivati ​​da MG è un fattore importante nella patogenesi del diabete e delle sue complicanze, come retinopatia, nefropatia e neuropatia [15-19]. Lo stress da dicarbonile è anche un mediatore che contribuisce all'obesità e alle malattie cardiovascolari [20,21]. La MG può contribuire all'aterosclerosi attraverso diversi meccanismi, tra cui l'accumulo di AGE derivati ​​da MG nelle placche aterosclerotiche [22] e la glicazione lipoproteica a bassa densità indotta da MG [23]. L'associazione tra MG e ipertensione è stata osservata anche in diversi studi, mostrando un aumento dei livelli di MG nell'aorta e nei tessuti renali [24,25]. Diversi studi hanno anche confermato che l'accumulo di AGE è correlato a molti disturbi neurodegenerativi, che influiscono così sulle funzioni cerebrali, come il morbo di Alzheimer, il morbo di Parkinson e la schizofrenia [26-28]. Uno dei migliori esempi della relazione tra l'accumulo di AGE e le conseguenze legate all'invecchiamento si verifica nei tessuti oculari con conseguenti disturbi del tessuto oculare indotti dalla glicazione, come cataratta, degenerazione maculare legata all'età (AMD) e retinopatia diabetica (DR)[{ {15}}]. Per quanto riguarda la cataratta, la principale causa di cecità nel mondo, le cristalline del cristallino diventano progressivamente pigmentate di giallo-marrone con l'età a causa dell'accumulo di sottoprodotti degli AGE [31]. Oltre al cristallino, gli AGE della retina aumentano con l'età e il diabete, specialmente nella retina esterna. L'AMD è la principale causa di cecità negli anziani nei paesi sviluppati. Livelli di AGE più elevati si riscontrano nei pazienti con AMD rispetto ai soggetti di controllo, nonché nei modelli murini di AMD [32-36]. La DR è caratterizzata dall'accumulo di AGE nella retina, che induce danno microvascolare [37].frazione flavonoide purificata micronizzata 1000 mg utilizzaQuesti cambiamenti patologici provocano danni irreversibili alla barriera emato-retinica ed edema maculare, con conseguente perdita della vista. In sintesi, gli AGE si accumulano in tutto il corpo con l'invecchiamento, in particolare nei pazienti diabetici. Ciò compromette l'omeostasi dell'organismo e contribuisce all'insorgenza e al progresso di una pletora di malattie legate all'età.

Esistono più sistemi per disintossicare gli AGE. Questi includono il sistema della gliossalasi, il meccanismo meglio caratterizzato per inibire la formazione di AGE, e una delle vie in grado di disintossicare gli intermedi della glicazione. Tuttavia, le capacità anti-AGEs diminuiscono con l'età portando all'accumulo accelerato di AGEs nei tessuti normali più vecchi. Sebbene esistano diversi meccanismi di difesa per limitare l'accumulo di AGE nei tessuti, il loro sviluppo per prevenire l'accumulo di AGE e le patologie associate non vengono ancora sfruttati [38]. Nella prossima sezione, riassumiamo la letteratura attuale sui meccanismi di disintossicazione concentrandosi su il sistema della gliossalasi per ridurre l'accumulo di questi sottoprodotti tossici nelle cellule e nei tessuti. Infine, discutiamo dell'utilità degli interventi nutrizionali per potenziare il sistema della gliossalasi come strategia anti-invecchiamento.

2. Meccanismi disintossicanti contro lo stress glicativo: ruolo principale del sistema della gliossalasi

Sono stati segnalati molteplici meccanismi disintossicanti contro l'accumulo di AGE. La Figura 1 è una panoramica schematica della formazione di -dicarbonile e delle diverse vie di disintossicazione contro i danni derivati ​​dall'invecchiamento dagli AGE. Le principali vie di sintesi degli AGE coinvolgono la reazione dei dicarbonili reattivi derivati ​​principalmente dal metabolismo del glucosio con le ammine primarie (catena laterale N-terminale o della lisina) o il gruppo guanidina della catena laterale dell'arginina [39]. La formazione di -dicarbonili altamente reattivi, come MG, avviene attraverso il metabolismo degli intermedi glicolitici, come il diidrossiacetone fosfato e la gliceraldeide 3-fosfato, e altre fonti, compreso il metabolismo degli aminoacidi e dei lipidi.

Gli AGE sono irreversibili e, una volta formati, possono essere eliminati solo per vie proteolitiche [5,9,40,41]. Si suggerisce che due principali capacità proteolitiche contribuiscano alla clearance degli AGE: il sistema ubiquitina-proteasoma (UPS) e il sistema proteolitico lisosomiale autofagico (ALPS)[5,9,40,41](Figura 1). L'UPS opera principalmente su proteine ​​solubili mal ripiegate. Nell'UPS, i substrati vengono riconosciuti e contrassegnati con ubiquitina e mirati al proteasoma per la degradazione. L'ALPS consiste nel indirizzare il carico al compartimento lisosomiale per il degrado. Il carico autofagico può essere diverso, comprese proteine ​​insolubili, aggregati proteici e persino interi organelli. Entrambi i percorsi proteolitici sono funzionalmente cooperativi e la letteratura in aumento supporta il crosstalk tra i due percorsi con interazioni reciproche dirette e indirette[42-46]. Questo crosstalk garantisce un meccanismo di backup e, in caso di carenza di una delle vie, l'altra via proteolitica tende a compensare per mantenere un proteoma corretto e funzionale [47].

I cambiamenti legati all'età nei tassi di degradazione delle proteine ​​sono stati documentati per molti tessuti più di 3 decenni fa, anche prima che fosse definita la caratterizzazione molecolare delle vie proteolitiche [48]. Al giorno d'oggi, il declino molecolare e cellulare delle due principali vie proteolitiche con l'età è meglio compreso e ci sono differenze nei gradi di diminuzione tra l'UPS e il sistema lisosomiale. Molti rapporti hanno mostrato un declino dipendente dai tessuti dell'UPS, mentre il declino autofagico sembra essere universale (rivisto in [49-51). Per quanto riguarda l'autofagia, sia il compartimento lisosomiale che quello autofagosomico subiscono notevoli modifiche. I cambiamenti che contribuiscono al malfunzionamento dell'autofagia includono una diminuzione della stabilità lisosomiale, dell'attività dell'idrolasi, accumulo di materiale indigeribile (lipofuscina) nel lume lisosomiale, pH lisosomiale disfunzionale, diminuzione del livello trascrizionale delle proteine ​​​​correlate all'autofagia, diminuzione della stabilità del chaperone mediato recettore autofagico LAMP2A nella membrana lisosomiale e ridotta associazione di proteine ​​motorie nei compartimenti autofagici ([49,51,52]). Contrariamente all'autofagia, è ora accettato che i cambiamenti nelle capacità proteolitiche del proteasoma con l'età sembrano essere più qualitativi che quantitativi.oteflavonoideI cambiamenti nella composizione delle attività catalitiche del nucleo del proteasoma e delle subunità modulatorie, la ridotta espressione del proteasoma, nonché i cambiamenti nello stato di ossidazione delle subunità del proteasoma e dei substrati del proteasoma, contribuiscono all'inibizione legata all'età della capacità dell'UPS (rivisto in [53] ,54). In alcuni casi, potrebbe esserci solo la capacità insufficiente dei sistemi proteolitici di gestire il carico. Sfortunatamente, l'efficacia di questi due meccanismi diminuisce con l'età, determinando l'insufficiente capacità di riconoscere e rimuovere le proteine ​​danneggiate e, quindi, l'accumulo intracellulare di aggregati proteici e organelli disfunzionali [55,56]. I livelli di AGE netti sono determinati dall'equilibrio tra il tasso di sintesi o formazione e il tasso di rimozione. La conseguenza immediata del declino della capacità proteolitica è l'accumulo di proteine ​​a vita lunga negli organismi invecchiati, molti dei quali accumulano danni derivati ​​dalla glicazione nelle loro sequenze amminoacidiche. L'accumulo di AGE avviene in modo correlato all'età ([4,9]) e una recente analisi proteomica nella ricerca sull'invecchiamento ha rivelato che la biologia degli AGE contiene una via metabolica arricchita associata ai proteomi associati all'età [57].

Sebbene UPS e ALPS diminuiscano con l'età, esistono diversi percorsi protettivi con la capacità di ridurre la sintesi degli AGE. In questa recensione, ci concentriamo su questi meccanismi protettivi che limitano la biogenesi degli AGE, con un'enfasi speciale sul sistema della gliossalasi, la via principale per la disintossicazione dei dicarbonili reattivi [58]. In questa sezione descriveremo in dettaglio il sistema della gliossalasi. Descriviamo anche brevemente altri meccanismi nella disintossicazione degli AGE: proteina associata al Parkinson DJ-1, aldeide deidrogenasi (ALDH), aldo-cheto reduttasi (AKR) e degradazione dell'acetoacetato.

2.1. Sistema della gliossalasi: la principale via disintossicante per i dicarbonili di reazione

Una vasta letteratura supporta il sistema della gliossalasi come la principale via disintossicante per i dicarbonili reattivi nel citosol di tutte le cellule di mammifero [58]. Il sistema della gliossalasi è la via meglio caratterizzata per il metabolismo della MG. I geni per le gliossalasi sono evolutivamente conservati e ampiamente distribuiti in vari sistemi viventi, come esseri umani, piante, lieviti, batteri, funghi e protisti. La presenza in molti taxa diversi sottolinea l'elevata importanza degli enzimi della gliossalasi nella funzione fisiologica della vita biologica. Le attività combinate delle gliossalasi 1 e 2(GLO1, GLO2) catalizzano la conversione di -ossoaldeidi acicliche reattive nei corrispondenti -idrossiacidi [58]. Queste reazioni richiedono anche GSH catalitico. Nella fase iniziale, GLO1 converte il suo substrato, emitioacetale, formato da una reazione spontanea dell'aldeide del dicarbonile MG e GSH, in trono SD-lattoilglu. Quindi, GLO2 idrolizza SD-lattoilglu tatione in D-lattato e riforma GSH (Figura 1).puritani vitamina cL'attività di GLO1 è direttamente proporzionale alla concentrazione di GSH. L'attività del GLO1 diminuisce quando il GSH viene rimosso, ad esempio in caso di stress ossidativo quando il GSH viene convertito in GSSG [59].

L'MG si forma durante la glicolisi e la gluconeogenesi dalla degradazione del diidrossiacetone fosfato e della gliceraldeide 3-fosfato, nonché dal catabolismo della treonina, dall'ossidazione dei corpi chetonici e dalla degradazione delle proteine ​​glicate. Anche altri substrati, inclusi gliossale, fenilgliossale e idrossipirualdeide, vengono metabolizzati attraverso questa via [60]. GLO1, l'enzima limitante la velocità nel sistema della gliossalasi, catalizza la fase di disintossicazione primaria [61], quindi l'alterazione della proteina GLO1 è coinvolta in molti processi patologici dell'invecchiamento, come il diabete, le malattie neurodegenerative, il cancro e gli occhi correlati malattie [20.

La regolazione dell'espressione e dell'attività di GLO1 è complessa e ancora non ben compresa (Figura 2). La sequenza del promotore GLO1 contiene un elemento di risposta metallica (MRE), un elemento di risposta all'insulina (IRE), un'isoforma del fattore 2- del gene iniziale (E2F) e una proteina 2 (AP{{10) legante un potenziatore attivante }} ) e un elemento di risposta antiossidante (ARE). La funzione di IRE e MRE è stata confermata in saggi reporter in cui il trattamento con insulina e cloruro di zinco ha prodotto una risposta trascrizionale aumentata 62]. Attività funzionali simili sono state osservate per E2F e AP-2 [63,64]. L'ARE situato nell'esone 1 di Glo1 serve a unire Glo1 al sistema trascrizionale reattivo allo stress correlato al fattore 2 (NRF2) del fattore nucleare eritroide 2- [65]. Diversi geni correlati al metabolismo dell'MG e alla protezione contro lo stress ossidativo sono sotto il controllo del percorso NRF2-ARE [66]. NRF2 è complessato con KEAP1, una proteina adattatrice del substrato per il complesso ubiquitina ligasi E2 dipendente da cullin-3-, dirigendo NRF2 per la degradazione da parte del proteasoma 26S in condizioni fisiologiche. Lo stress ossidativo porta alla destabilizzazione di questo complesso, causando la traslocazione di NRF2 nel nucleo e innescando la sovraregolazione dei geni antiossidanti [67,68]. Il legame di NRF2 al Glo1-ARE aumenta l'espressione basale e inducibile di GLO1.[65]. Anche le risposte NRF2 e antiossidanti sono sovraregolate quando MG provoca la dimerizzazione di KEAP liberando Nrf2 [69].

Diversi studi mostrano che NRF2 aumenta l'attività GLO1 e allevia lo stress intracellulare di MG; quindi, la modulazione di GLO1 da parte degli agonisti NRF2 ha comportato una diminuzione degli addotti proteici derivati ​​​​da MG e MG sia nelle cellule che nei tessuti [70-73]. Inoltre, l'mRNA e le proteine ​​Glol epatici, cerebrali, cardiaci, renali e polmonari erano diminuiti nei topi knockout NRF2 [65]. Complessivamente, questi rapporti suggeriscono che GLO1 è un obiettivo a valle mediante il quale il percorso NRF2/KEAP1 svolge le sue funzioni protettive diminuendo lo stress MG e dicarbonile. Tuttavia, l'attivazione infiammatoria di NF-kB (fattore nucleare kB) con NRF2 diminuisce l'espressione di Glol [74]. L'espressione del bagliore è anche regolata negativamente da HIFl (fattore l inducibile dall'ipossia) in condizioni ipossiche, un importante fattore fisiologico dello stress da dicarbonile [75].

Insieme alla regolazione trascrizionale, esiste anche una regolazione post-traduzionale della proteina GLO1 (Figura 2). GLO1 è acetilato dalla sirtuina citosolica-2[76,77] e la sua espressione può essere ridotta dall'attivazione di RAGE (recettore per i prodotti finali della glicazione avanzata); tuttavia, questi meccanismi non sono chiaramente compresi [78].sistanoUno studio recente ha dimostrato che la proteina GLO1 può essere modificata dalla fosforilazione della treonina 107 (T107) e dalla nitrosilazione della cisteina 139 [79]. In questo studio, la fosforilazione di T107 da parte della chinasi II calmodulina-dipendente delta nella proteina GLO1 è stata segnalata come un meccanismo preciso che regola il sistema della gliossalasi. In particolare, la fosforilazione di GLO1 a T107 influisce sull'efficienza cinetica della disintossicazione da MG e sul tasso di degradazione del proteasoma. Pertanto, il suo stato alterato è associato allo sviluppo di malattie legate all'età [79].

Figura 2. Meccanismi di regolazione della gliossalasi 1(GLO1). L'attività di GLO1 può essere regolata attraverso molteplici meccanismi, tra cui la regolazione trascrizionale e le modifiche post-traduzionali. Il promotore Glo1 contiene vari elementi regolatori, come la risposta antiossidante (ARE), la risposta al metallo (MRE) e la risposta all'insulina (IRE) e i siti di legame per AP-2 ed E2F. In condizioni normali, il Il fattore nucleare eritroide 2-correlato fattore 2 (NRF2) è complessato con KEAP1, una proteina adattatrice del substrato per il complesso E2 ubiquitina ligasi cullin-3-dipendente, dirigendo NRF2 alla degradazione da parte del sistema ubiquitina-proteasoma (UPS). Lo stress ossidativo porta alla destabilizzazione del complesso NRF2-KEAP1, provocando il distacco di NRF2 che viene traslocato nel nucleo che innesca la sovraregolazione di diversi geni antiossidanti. L'associazione di NRF2 a Glo1-ARE aumenta l'espressione di GLO1. In condizioni di ipossia, l'espressione di Glow è regolata inversamente dal fattore 1 inducibile dall'ipossia (HIFlx). Diverse modifiche post-traduzionali nel citosol possono influire sulla stabilità di GLO1.

2.2. Meccanismi alternativi di disintossicazione come sistemi di backup putativi per compensare la mancanza di attività della gliossalasi

Sebbene sia il meccanismo principale per disintossicare i dicarbonili reattivi nel sistema della gliossalasi, esistono percorsi alternativi con la capacità di disintossicare i dicarbonili formati durante il metabolismo degli zuccheri. Questi includono ALDH, AKR, la proteina associata al Parkinson DJ-1 e lo scavenging da parte dell'acetoacetato per formare 3-idrossiesano-2,5-dione ({5}}HHD )[80]. La rilevanza fisiologica di questi sistemi rimane poco chiara ed è stato messo in dubbio se questi enzimi siano o meno cruciali per la disintossicazione degli AGE nei tessuti a causa dell'elevata attività del sistema della gliossalasi. Sembrano essere componenti di sistemi di backup che operano in assenza di attività della gliossalasi sebbene non sia possibile escludere un ruolo dipendente dal tessuto di queste vie.

DJ-1, noto anche come proteina 7 del morbo di Parkinson (PARK7), svolge un ruolo essenziale nel morbo di Parkinson (PD). È stato dimostrato che la mancanza di proteina funzionale DJ-1 causa PD autosomica recessiva [81,82]. È stato riportato che DJ-1 ha due diverse attività: (1) attività della gliossalasi in vitro, che converte MG in lattato e previene il danno tissutale indotto da MG in Caenorhabditis elegans [83] e (2) attività deglicasi in vitro, riducendo sottoprodotti MG in fase iniziale [84]. Di recente, anche altri studi hanno dimostrato che il DJ-1 svolge un ruolo importante nel deglicasi del DNA [85-87].cos'è la cistancheLa capacità disintossicante di DJ-1 in assenza di glutatione (GSH) lo rende una via alternativa al sistema della gliossalasi, che richiede la presenza di GSH. Tuttavia, Pfaff et al. utilizzando sia il knockdown DJ-1 nelle cellule di Drosophila che il knockout DJ-1 nell'intero organismo non hanno osservato differenze nell'accumulo di addotti proteici MG [88].

Gli AKR sono una superfamiglia di proteine ​​in grado di ridurre aldeidi e chetoni in alcoli primari e secondari. Gli AKR metabolizzano l'MG in idrossiacetone o lattaldeide. Alcuni studi hanno dimostrato che l'espressione transgenica delle Aldo-cheto reduttasi sia umane che di topo nelle cellule dei fibroblasti dei roditori protegge dai danni indotti da MG, suggerendo che gli AKR possono partecipare alla disintossicazione da MG e a una riduzione dei livelli di AGE [89-91]. È stata rilevata un'elevata attività di AKR1B3 nelle cellule Schwann di topo knockout Glo1 e un'aumentata espressione durante l'esposizione a MG, suggerendo che potrebbe essere un meccanismo compensatorio indotto dalla mancanza del sistema della gliossalasi o da un eccessivo stress della glicazione [92]. È interessante notare che la mancanza di AKR1B3 ha portato a livelli più elevati di MG e AGE nel cuore dei topi diabetici [91].

I LED sono un altro gruppo di enzimi che metabolizzano il dicarbonile che ossidano l'MG a piruvato. L'espressione di ALDH è stata aumentata nelle cellule di tipo selvatico di Schwann di topo dopo il trattamento con MG [92]. In un modello di pesce zebra, il pesce knockout glo1 ha mostrato che l'attività ALDH indotta compensa la mancanza di GLO1 [93]. Tuttavia, almeno nei topi, i meccanismi di compensazione dipendono dal tessuto, poiché l'aumentata espressione di AKR e ALDH è stata osservata nel tessuto epatico ma solo AKR sono stati riportati nei reni nei topi knockout Glo1 [94]. Negli studi sull'uomo, il 3-metabolita DG prodotto dall'attività dell'aldeide deidrogenasi 1A1(ALDH1A1) è stato aumentato nel plasma e negli eritrociti di pazienti diabetici [92]. Recentemente, è stato anche dimostrato che l'acetoacetato del corpo chetonico riduce la concentrazione di MG mediante una reazione non enzimatica durante la chetosi diabetica e dietetica [95,96]. Hanno scoperto che questa via metabolica comporta una reazione aldolica non enzimatica tra MG e il corpo chetonico acetoacetato, che porta a 3-idrossiesano-2,5-dione, che è presente nel sangue dei pazienti affamati di insulina. Percorsi alternativi che potrebbero compensare la carenza del sistema della gliossalasi potrebbero potenzialmente generare molecole tossiche come gli y-dichetoni, che sono associati alla degenerazione assonale periferica e al danno testicolare [97,98].

Sebbene non esista un'analisi sistematica dell'invecchiamento delle proteine ​​coinvolte nei percorsi alternativi GLO1-indipendenti, sono stati segnalati cambiamenti legati all'età in questi attori molecolari. Ad esempio, esiste una correlazione tra i livelli di D]-1 di espressione e lo stress ossidativo e diversi rapporti hanno mostrato un aumento di DJ-1 con l'età. I livelli di mRNA e proteine ​​di DJ-1 sono aumentati da 8 a 20 settimane di età nei topi [99] e i livelli di DJ-1 sono aumentati significativamente in funzione dell'età nel liquido cerebrospinale umano [100]. Nei tessuti oculari, è stato dimostrato che il DJ-1 è espresso nell'epitelio pigmentato retinico e nei fotorecettori e l'espressione aumenta nei vecchi occhi [101]. Potrebbe riflettere un meccanismo compensatorio dovuto al declino dell'attività del sistema della gliossalasi.

2.3. Attività dipendente dai tessuti del sistema della gliossalasi

Sebbene GLO1 sia una proteina onnipresente, i livelli di questo enzima sono regolati in modo dipendente dal tessuto. Al fine di valutare il ruolo del sistema della gliossalasi in diversi tessuti, abbiamo esaminato l'espressione e l'attività di GLO1 nei tessuti non oculari (fegato, cervello, cuore e rene) e oculari (retina, RPE/coroide e cristallino) da topi selvatici C57BL/6]. Utilizzando anticorpi che riconoscono specificamente GLO1, sono stati eseguiti Western blotting e immunoistochimica per quantificare i livelli proteici. L'attività di GLO1 negli estratti citosolici è stata determinata spettrofotometricamente come velocità iniziale di formazione di SD-lattoilglutatione, come riportato in precedenza [30,102]. Questi risultati sono riassunti nella Figura 3.

Figura 3. Un'analisi comparativa della proteina GLO1 e dell'attività nei tessuti oculari e non oculari. (A) L'attività di GLO1 è stata analizzata nei tessuti non oculari e nei tessuti retinici di topi WT come precedentemente descritto [29] e l'attività è stata espressa come percentuale (percentuale) rispetto al fegato. (B) Analisi Western blot rappresentativa del fegato e della retina (C) di topi transgenici con sovraespressione WT e Glow (Glo1 Tg plus / plus) utilizzando un anticorpo monoclonale (non commerciale) e un anticorpo policlonale per Glol (commerciale, GeneTex) [36,103,104]. (D) Analisi rappresentativa Western blot di estratti di tessuto non oculare (50 ug) di topi WT utilizzando un anticorpo monoclonale per la quantificazione della proteina Glo1 (non commerciale) e (E) di GLO1 normalizzata per controllare il carico (colorazione Ponceau). (F) L'attività GLO1 è stata eseguita nei tessuti oculari (retina, RPE/coroide e lente) da topi WT come precedentemente descritto [29] e l'attività è stata espressa come milliunità per milligrammo di proteine. I valori sono medi ± SEM. La dimensione del campione è n=4dal test di attività e proteine ​​GLO1.

I dati pubblicati in precedenza indicavano che la retina e il fegato mostrano la più alta attività di GLO1([30]; Figura 3A). Si noti che l'attività retinica era il valore più alto mentre il fegato, i reni, il cervello e il cuore rappresentavano rispettivamente solo il 46%, 27%, 22% e 11% della capacità disintossicante della retina. Abbiamo valutato se l'attività di GLO1 fosse correlata al livello dell'enzima mediante valutazione dei livelli di proteina GLO1 mediante Western blotting. L'anticorpo contro GLO1 è stato precedentemente convalidato in precedenti rapporti e utilizzato per l'analisi di GLO1 in campioni di retina [36,103,104]. Come controllo positivo, è stata eseguita anche un'analisi comparativa nella retina e nei tessuti epatici di topi transgenici che sovraesprimono GLO1 su sfondo C57BL/6J (B6) [105]. Per esaminare i livelli di GLO1, abbiamo utilizzato due diversi anticorpi: un anticorpo policlonale di coniglio (anticorpo commerciale di GeneTex) e un anticorpo monoclonale di topo (anticorpo non commerciale) riportato in diversi modelli animali per lo studio della biologia GLO1 [103,106]. Siamo stati in grado di rilevare la proteina GLO1 nei tessuti di tipo selvaggio del fegato e della retina mediante Western blotting e abbiamo trovato la massima espressione nei topi transgenici in entrambi i tessuti (Figura 3B, C e Figura S1 supplementare). Sono state riconosciute due bande per entrambi gli anticorpi. I profili elettroforetici differenziali di questi GLO1-positivi suggeriscono che i cambiamenti post-trascrizionali potrebbero essere vitali nel ruolo della proteina. Di conseguenza, uno studio recente ha indicato che il GLO1 fosforilato è più efficiente e più stabile, supportando queste alterazioni post-trascrizionali come un preciso meccanismo che regola l'attività del GLO1 [79]. Tuttavia, ci sono scarse informazioni su come le modifiche post-trascrizionali modulano l'attività della gliossalasi 1.

As expected, we found GLO1 protein in all non-ocular tissues analyzed, with the liver showing the highest expression. The relative order of GLO1 expression was liver>kidney>brain>cuore (Figura 3D, E). Ciò corrobora i risultati di uno studio precedente[30]. Ci sono informazioni limitate sul ruolo di GLO1 nei tessuti oculari. Come riportato in precedenza, il test enzimatico ha rivelato che l'attività GLO1 è ~ 10 volte più alta nella retina rispetto alla lente o all'RPE/coroide (Figura 3F, [30]). La sovraespressione della gliossalasi I migliora la sopravvivenza dei periciti retinici umani in condizioni iperglicemiche [107] e un bloccante del recettore dell'angiotensina che ripristina GLO1 nei ratti diabetici ha dimostrato di ridurre i capillari acellulari retinici [18]. Inoltre, la mancanza di GLO1 in Zebrafish ha un impatto sull'architettura del vaso della retina adulta, sebbene una maggiore formazione di germogli angiogenici sia osservata solo nel pesce zebra glo1-/sovraalimentato ma non nell'alimentazione normale [93].

La retina è un tessuto altamente complesso e molto dinamico con diversi tipi di cellule (Figura 4A). Il flusso sanguigno e la conseguente esposizione a xenobiotici e altri fattori di stress sono tra i più alti del corpo. Ogni mattina, il 10 percento delle punte esterne dei fotorecettori della retina viene perso e deve essere rimosso dalle cellule epiteliali pigmentate retiniche adiacenti. Abbiamo eseguito l'analisi immunoistochimica per caratterizzare per la prima volta le differenze spaziali di GLO1 nella retina. La proteina GLO1 era presente in tutti i tipi cellulari all'interno della retina, con livelli elevati all'interno dei corpi cellulari dello strato nucleare interno e della conca delle cellule gangliari. I corpi cellulari dei fotorecettori nello strato nucleare esterno avevano livelli più bassi. Nei fotorecettori, la maggior parte delle proteine ​​GLO1 è stata trovata all'interno dei segmenti interno ed esterno. L'RPE aveva anche alti livelli di proteina GLO1, mentre la coroide e la sclera avevano una quantità inferiore di proteina GLO1 (Figura 4B, C).

Figura 4. Immunoistochimica di GLO1 nei tessuti retinici del topo. (A) Schema cellulare in sezione trasversale della retina che illustra i suoi tre strati primari costituiti dallo strato di cellule gangliari (GCL), contenente cellule gangliari retiniche (RGC), strato nucleare interno (INL), che ospita interneuroni di amacrino, bipolare e orizzontale cellule così come le cellule gliali di Müller e lo strato nucleare esterno (ONL), che ospitano i fotorecettori a cono e bastoncello. Il tessuto sensoriale, o neuroretina, è collegato all'epitelio pigmentato retinico (RPE). Le frecce rosse indicavano lo strato RPE. (B) Immagine rappresentativa dell'immunocolorazione GLO1 in campioni di retina di topi WT. (C) Fluorescenza di intensità media di GLO1 normalizzata al valore nell'RPE. I dati mostrati sono media ± errori standard delle medie (SEM). I nostri risultati nella retina sono rilevanti perché la retina è un tessuto post-mitotico altamente differenziato, in cui il danno derivato dalla glicazione non può essere ridotto dalla divisione cellulare [5,9]. Inoltre, i cambiamenti in GLO1 sono stati associati a danno retinico [108]. Uno scenario simile potrebbe verificarsi in altri tessuti composti da cellule con bassa capacità di rigenerazione, come il sistema nervoso centrale, dove la stragrande maggioranza dei neuroni è post-mitotica. La valutazione dei livelli di GLO1 insieme ai marcatori cellulari specifici potrebbe consentire di valutare la variazione da cellula a cellula all'interno di un determinato tessuto. I nostri risultati suggeriscono che l'alto livello di proteina e attività GLO1 retinica potrebbe svolgere un importante ruolo protettivo contro i danni derivati ​​dall'età con l'età.

Questo articolo è estratto da Cells 2021, 10, 1852. https://doi.org/10.3390/cells10081852 https://www.mdpi.com/journal/cells