La manifestazione patologica più comune di CKD è una qualche forma di fibrosi renale

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Sfondo:La fibrosi è una delle caratteristiche patologiche più comuni del processo di invecchiamento del rene e la fibrosi nei reni che invecchiano aggrava anche il processo della malattia renale cronica (CKD). Corallodiscus flabellata BLBurtt (C.flabellata, CF) è una droga botanica comunemente usata nel folklore cinese. Tuttavia, pochi studi hanno riportato i suoi effetti farmacologici. Questo studio mirava a esplorare l'effetto dell'estratto di etanolo CF sulla fibrosi renale nei topi SAMP8 e identificare composti potenzialmente attivi.

Metodi:Come modelli animali sono stati usati modelli animali con accelerazione di senescenza 8 (SAMP8) e diverse dosi di FC sono state somministrate mediante sonda gastrica per un mese. Per osservare il grado di invecchiamento renale nei topi usando la colorazione -galattosidasi. La colorazione Masson e i livelli di espressione di Col-lI, a-SMA e FN sono stati utilizzati per valutare la fibrosi renale nei topi. Sono stati misurati i livelli di espressione proteica della via Nrf2 e della via Wnt/-catenina/RAS nel rene. E la -galattosidasi (-gal) ha indotto le cellule NRK-52E come modello in vitro per lo screening dei componenti attivi della FC.

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Risultati:L'estratto di etanolo CF ha inibito significativamente l'attività della galattosidasi renale e i livelli di espressione dei topi Coll, a-SMA e FNin SAMP8 e ha migliorato la colorazione di Masson nei topi SAMP8. La FC ha ridotto notevolmente i livelli sierici di proteine ​​urinarie, creatinina, azoto ureico e di TNF-a e IL-1 nei topi SAMP8 e ha aumentato significativamente i livelli di SOD e GSH-Px. Inoltre, CF ha attivato la via Nrf2 e bloccato la via Wnt/-catenina/RAS nei reni dei topi. Inoltre,3,4-diidrossi fenil etanolo (SDC-0-14,16) e (3,4-diidrossi fenil etanolo-8-O-[4-O-trans -caffeoil- -D-apiofuranosy-(1→3)- -D-glucopiranosil (1→6)]- -D-glucopiranoside (SDC-1-8) sono stati isolati da FC , che ha ridotto la senescenza delle cellule NRK-52E e forse i principi attivi della FC che svolgono un ruolo antietà.

Conclusioni:I nostri esperimenti hanno evidenziato che l'estratto di etanolo CF può migliorare la fibrosi renale nei topi SAMP8 attraverso la via Wnt/-catenina/RAS. E SDC-0-14,16 e SDC-1-8 possono essere la base materiale per la FC per esercitare effetti correlati alla senescenza antirenale.

Parole chiave:Invecchiamento, Corallodiscus flabellata, Rene, Fibrosi renale, SAMP8, Senescenza, Wnt/ -catenina/RAS

introduzione

La prevalenza globale della malattia renale cronica (CKD) è in aumento con l'invecchiamento della popolazione e rappresenta un onere significativo per la società [1-3]. La manifestazione patologica più comune di CKD è una qualche forma di fibrosi renale[4]. Allo stesso modo, anche la fibrosi renale è uno dei segni dell'invecchiamento renale [2]. Gli studi hanno dimostrato che lo stress ossidativo, l'infiammazione, la Wnt/-catenina, il sistema renina-angiotensina-aldosterone (RAS) e la segnalazione della rapamicina (mTOR) sono tutti correlati alla CKD indotta dalla senescenza [5]. La fibrosi renale nei reni che invecchiano è strettamente correlata all'attivazione della via di segnalazione Wnt/-catenina e RAS [6]. Dopo l'attivazione di Wnts, la -catenina nel citoplasma viene traslocata nel nucleo, dove si lega alla famiglia dei fattori di trascrizione del fattore di legame del potenziatore linfoide (LEF)/fattore delle cellule T (TCF) e avvia la trascrizione dei geni bersaglio a valle. È interessante notare che la regione del promotore del gene RAS contiene anche siti di legame LEF/TCF, che consentono alla -catenina di promuovere il legame di LEF-1 a questi siti[7].colesterolo cista,Pertanto, il targeting della via di segnalazione Wnt/ -catenina/RAS potrebbe essere una potenziale strategia terapeutica per la fibrosi renale [8,9]. Negli ultimi anni, la terapia sostitutiva della fibrosi renale con prodotti naturali ha attirato l'attenzione di molti studiosi [10] . Xiaoyan Shen et al. hanno scoperto che il ginsenoside Rgl ha migliorato la fibrosi glomerulare durante l'invecchiamento renale inibendo l'attivazione dell'inflammasoma NLRP3 nei topi SAMP8 [11]. Questo studio ha esplorato l'effetto dell'estratto di C. flabellate(CF) sulla fibrosi renale nei topi SAMP8 dalla via Wnt/-catenina/RAS.

Cistanche può antietà

La fibrosi cistica come pianta medicinale in Cina è stata registrata per la prima volta nel "Dian Nan Ben Cao. L'intera pianta è comunemente usata per il trattamento di dissenteria, eiaculazione precoce, malattia delle vescicole seminali e malattie renali nelle aree delle minoranze etniche della Cina [12]. Attualmente , ci sono pochi rapporti sulla FC nella ricerca moderna. Gli studi farmacologici nel nostro laboratorio hanno scoperto che l'estratto di FC ha avuto effetti diuretici e ha migliorato l'insufficienza epatica indotta da lipopolisaccaride/D-galattosammina e danni cerebrali nei ratti [13, 14]. E studi fitochimici su ha rivelato che i glicosidi feniletanoidi e i flavonoidi erano i principali componenti chimici della FC [15,16].Lo scopo di questo studio era di indagare l'effetto dell'estratto di FC sulla fibrosi renale nei topi SAMP8 e di chiarirne il possibile meccanismo, in modo da fornire prove sperimentali per il trattamento delle malattie renali con FC descritte nei libri antichi.

Materiali e metodi

Raccolta ed estrazione del materiale vegetale

"Yunnan Chinese Herbal Medicine" registra che la FC può essere raccolta durante tutto l'anno. Le piante CF utilizzate in questo esperimento sono state raccolte a settembre nella contea di Xixia, nella provincia di Henan, in Cina. È stato identificato dal professor Suiqing Chen dell'Università di medicina cinese di Henan e gli esemplari sono stati conservati nella biblioteca dei campioni di laboratorio.cistanche deserticola effetti collateraliLe piante (1 kg) sono state portate a riflusso con etanolo al 50 percento (3 × 12 L, ciascuna 1 ora) e la miscela è stata filtrata con 16 strati di garza. I filtrati combinati sono stati essiccati mediante evaporazione rotante usando un liofilizzatore. Infine, la resa percentuale del 50% di estratto grezzo di CF con etanolo era del 15,5%. L'estratto secco è stato conservato in frigorifero fino al nuovo utilizzo. I materiali supplementari elencano i dati rilevanti sulla designazione dell'ingrediente dell'estratto di CF.

Un altro processo di separazione precedentemente riportato è stato utilizzato in questo studio per ottenere la frazione di eluizione dell'acqua, la frazione di eluizione di etanolo al 20 percento, la frazione di eluizione di etanolo al 30 percento e la frazione di eluizione di etanolo al 40 percento da CF [13]. La frazione di etanolo al 40% è stata separata utilizzando Sephadex LH-20 e una colonna di gel di silice e purificata mediante cromatografia liquida semi-preparativa ad alte prestazioni (HPLC) per ottenere infine composti come SDC-0-14,16, SDC{ {10}}, DSC-0-60(alcool p-idrossibenzilico).

Animali e amministrazione

In questo studio sono stati utilizzati topi SAMP8 maschi di sei mesi e topi 1 (SAMR1) resistenti ai topi con accelerazione della senescenza del primo ospedale affiliato dell'Università di medicina tradizionale cinese di Tianjin (Tianjin, Cina). Gli animali sono stati alloggiati in condizioni di luce controllata (12-h ciclo luce/buio), temperatura (23-25 grado C) e umidità (45-55 percento) e hanno ricevuto una dieta standard e annunci di acqua libitum. Un totale di 48 topi SAMP8 sono stati suddivisi in quattro gruppi sperimentali (n=12/gruppo): topi modello SAMP8 (M), topi SAMP8 trattati con estratto di etanolo CF a basse dosi (CF-L, 387,5 mg/kg, intragastricamente), topi SAMP8 trattati con estratto di etanolo CF a dose media (CF-M,775 mg/kg, intragastricamente) e topi SAMP8 trattati con estratto di etanolo CF ad alte dosi (CF-H,1550 mg/ kg, per via intragastrica). I topi nel gruppo di controllo SAMRI (Con, n=10) e SAMP8 (M) sono stati trattati con soluzione fisiologica (0,9 percento). Tutti i topi sono stati trattati per via orale per 1 mese. Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal comitato etico dell'Università di medicina cinese di Henan ed eseguiti secondo le linee guida istituzionali (Henan, China Approval Number: HACTCM-2018009060-19). Durante l'esperimento, si è verificato un decesso di topo in ciascuno dei gruppi Con e M e due topi sono morti nel gruppo CF-H.

Collezione di campioni

Alla fine dell'esperimento, i topi sono stati alloggiati individualmente in gabbie metaboliche per 12-h raccolte urinarie. I topi sono stati quindi anestetizzati con isoflurano e campioni di sangue sono stati raccolti mediante sanguinamento retro-orbitale. I reni di ciascun topo sono stati quindi rimossi chirurgicamente e mantenuti a 80 gradi fino all'analisi.

Coltura cellulare e studio in vitro

NRK-52Le cellule E acquistate dalla Banca cellulare dell'Accademia cinese delle scienze (Shanghai, Cina) sono state coltivate per studiare l'effetto dell'estratto di FC sull'invecchiamento cellulare causato dal D-galattosio (D-gal, S11050, Yuanye, Shanghai, Cina). Le cellule NRK-52E sono state coltivate nella modifica di Dulbecco del mezzo di Eagle Dulbecco (DMEM,12,100,046, Thermo Fisher, Massachusetts, USA) fornito con il 10% di siero bovino fetale in un'incubatrice a 37 gradi C e in presenza di 5 percento, CO.Le cellule sono state coltivate in 96-piastre a pozzetti o 6-piastre a pozzetti fino al 80-85 percento di confluenza e quindi trattate con terreni di crescita contenenti diverse combinazioni di farmaci: Media più D-gal ( 20 mg/mL), Media più D-gal più CF (10, 25,50, 100 ug/mL) o Media più D-gal più composto monomerico (10 μM) rispettivamente per 48 h. Successivamente, il metil tiazolil tetrazolio ( MTT) è stato utilizzato per rilevare la vitalità cellulare e la colorazione -galattosidasi è stata utilizzata per osservare la senescenza cellulare.

Colorazione con galattosidasi associata alla senescenza

Reni congelati di topi tagliati in sezioni di 10-μm di spessore e cellule NRK-52E sono stati colorati con -galattosidasi associata alla senescenza (SA- -gal, C0602, Beyotime Biotechnology, Shanghai, Cina) seguendo i protocolli del produttore.

Analisi istologica

Le sezioni renali sono state fissate con paraformaldeide tamponata al 4% e le sezioni incluse in paraffina dello spessore di 10-μm sono state colorate con tricromo di Masson (G1006, Service, Wuhan, Cina) e osservate al microscopio. Le aree di colore blu nelle sezioni colorate con tricromia di Masson sono state misurate quantitativamente da sei campi selezionati casualmente e analizzate dal software Image-Pro Plus 6.0.

Misure biochimiche

I campioni di siero e omogenato renale sono stati scongelati a temperatura ambiente e i livelli di superossido dismutasi (SOD, CSB-E08556m, Wuhan Huamei, Wuhan, Cina), glutatione perossidasi (GSH-Px, A005-1-2, Nanjing Jiancheng, Nanchino, Cina), interleuchina-1 (IL-1 , RK00006, ABclonal, Wuhan, Cina), fattore di necrosi tumorale- (TNF- , RK00027, ABclonal, Wuhan, Cina), azoto ureico (C{ {10}}, Nanchino Jiancheng, Nanchino, Cina), creatinina (Cr, C011-2-1, Nanchino Jiancheng, Nanchino, Cina) nel siero di topo, proteine ​​urinarie totali (C035-2-1, Nanchino Jiancheng, Nanchino , Cina) nell'urina di topo e i livelli di espressione del collagene di tipo I (Col-I, MU30364, Bio-Swamp, Wuhan, Cina), -actina muscolare liscia (-SMA, MU30359, Bio-Swamp, Wuhan, Cina), fibronectina (FN, MU30179, Bio-Swamp, Wuhan, Cina) nei tessuti renali del topo sono stati misurati in sequenza secondo il protocollo del produttore del kit di analisi.

Analisi immunoistochimica

L'analisi immunoistochimica è stata eseguita utilizzando il metodo di routine [17]. Gli anticorpi utilizzati includevano: Wnt4 (14371-1-AP, Proteintech, Chicago, USA), -catenin(17565-1-AP,Proteintech,Chicago, USA), recettori dell'angiotensina II di tipo 1 (AGTR1,{{ 7}}AP, Proteintech, Chicago, USA), fattore p-nucleare eritroide 2-fattore correlato 2 (p-Nrf2, ab76026, Abcam, Cambridge, Regno Unito),pc-Fos(ab27793,Abcam,Cambridge, Regno Unito ), fattore di crescita del tessuto connettivo (CTGF, GB11078, Service, Wuhan, Cina). Le sezioni sono state osservate al microscopio (Olympus, Tokyo, Giappone).cistance dosaggio redditMisurare l'area e la densità ottica integrata (IOD) dell'area con l'espressione dell'abbronzatura utilizzando il software Image-Pro Plus 6.{2}} e calcolare la densità ottica media (MOD, MOD=IOD/area) per semi -analisi quantitativa.

Analisi Western blot

Il test Western blot è stato condotto come descritto in uno studio precedente [18]. In breve, i tessuti renali sono stati omogeneizzati nel tampone di lisi e quantificati utilizzando un kit di dosaggio delle proteine ​​Bradford (AR0197, Boster Biological Technology, Wuhan, Cina). Gli omogenati sono stati quindi sottoposti a elettroforesi su gel di sodio dodecil solfato-poliacrilammide, trasferiti su membrana di polivinilidene fluoruro e bloccati in tampone bloccante (4% di latte in polvere senza grassi) per 90 minuti. Sono stati quindi incubati con anticorpi primari (Wnt4; renina; AGTR1; p-Nrf2; pc-Fos; proteina 1 associata a ECH simile a Kelch (Keapl, GB11847, Service-bio, Wuhan, Cina); -actina (AC026, Abclonal, Wuhan, Cina); e gliceraldeide{17}}fosfato deidrogenasi (GAPDH, AC033, Abclonal, Wuhan, Cina)) per una notte a 4 gradi, seguita da incubazione con un anticorpo secondario coniugato con fluopresenza appropriato per 1 ora a temperatura ambiente . Le proteine ​​di interesse sono state scansionate con uno scanner IR Odyssey (LI-COR Biosciences, Nebraska, USA) e le intensità del segnale sono state quantificate utilizzando il software Image Studio. I livelli proteici sono stati normalizzati contro -actina o GAPDH.

Analisi UPLC-Q-TOF-MS per campioni renali

I tessuti renali sono stati pesati e omogeneizzati in soluzione fisiologica ghiacciata (w/v=1:1). Quindi, 1 mL di acetonitrile è stato aggiunto a 200 μL di campioni di omogenato di tessuto, seguito da estrazione ad ultrasuoni per 30 minuti. L'estratto è stato centrifugato a 12,{7}} ge 4 gradi per 10 min. Il supernatante è stato portato nella fiala per l'analisi. La separazione cromatografica è stata eseguita su cromatografia liquida ultraprestazioni (UPLC) (Dionex UltiMate 3000 System, Thermo Scientific, Massachusetts, USA), con il sistema LC comprendente una colonna Acclaim RSLC 120 C18 （2,2 μm, 2,1 × 100 mm; termoscientifico).Benefici dell'estratto di cistancheLa fase mobile era costituita da solvente A(acetonitrile) e acqua con {{0}},1 percento di acido formico (B). La separazione è stata eseguita mediante eluizione a gradiente come segue:10-70 percentuale A da 0 a 3 min,70-78 percentuale A da 4 a 13 min,78-90 percentuale A da 14 a 15 min, 90 percento -10 percento A da 15 a 16 min e 10 percento A da 16 a 20 min. Il volume di iniezione del campione di prova era 2μL. L'analisi della spettrometria di massa (MS) è stata eseguita utilizzando una sorgente ESI nelle seguenti condizioni: la tensione capillare in modalità positiva era 3,5 kV e la tensione capillare in modalità negativa era 3,2 kV. La pressione del nebulizzatore era di 2,0 bar, la temperatura del gas secco era di 230 gradi e la portata era di 8 L/min.

analisi statistica

The acquired raw data from ultra-performance liquid chromatography coupled to quadrupole time-of-flight mass spectrometry (UPLC-Q/TOF-MS) analysis were first preprocessed using profile analysis(version 2.1, Bruker, Germany). The"bucket table" was obtained and imported into the SIMCA-P software(version13.0 Umetrics AB, Sweden)for principal component analysis (PCA). Other results were presented as mean±stand-ard deviation(SD). The data were processed using IBM SPSS Statistics 26.0. The normal distribution of the data used the Levene test, which required the average value, P>{{0}}.05; l'analisi della varianza unidirezionale è stata utilizzata per il confronto tra i gruppi. Un valore AP inferiore a 0,05 è stato considerato statisticamente significativo.

Risultati

La fibrosi cistica ha migliorato l'invecchiamento e la fibrosi dei reni nei topi SAMP8

Per studiare l'effetto della FC sui reni dei topi SAMP8, è stata misurata l'attività di SA- -gal nei reni. In Fig. la, l'attività di SA- -gal nei tessuti renali è aumentata significativamente nel gruppo M (potenziamento blu). La somministrazione di CF-L e CF-M ha inibito significativamente l'attività della galattosidasi nei reni dei topi SAMP8 mentre il miglioramento di CF-H non era significativo. Inoltre, l'indice renale del gruppo modello era significativamente inferiore a quello del gruppo di controllo (Fig. 1b, P<0.05). after="" treatment="" with="" cf-m,="" the="" kidney="" index="" of="" samp8="" mice="" was=""><0.01). next,="" the="" results="" of="" masson's="" trichrome="" staining="" (fig.="" lc,=""><0.01)and the="" expression="" of="" fibrosis="" indicators="" col-i,="" α-sma,="" and="" fn="" revealed="" that="" m-group="" mice="" had="" more="" severe="" renal="" fibrosis="" than="" con-group="" mice,="" and="" cf-l="" and="" cf-m="" significantly="" attenuated="" renal="" fibrosis="" in="" samp8="" mice(fig.leg,=""><>

La FC ha migliorato la funzione renale, lo stress ossidativo e i livelli di infiammazione nei topi SAMP8

Inoltre, sono stati testati gli indicatori della funzionalità renale di ciascun gruppo di topi, che includevano il volume di urina nei topi per 12 ore, i livelli di Cr e di azoto ureico nel siero e i livelli di proteine ​​nelle urine. Come mostrato in Fig. 2a-d, i livelli di proteina urinaria, Cr sierico e azoto ureico sierico del gruppo modello erano significativamente più alti di quelli del gruppo di controllo (Fig.2a, P<0.01), while="" the="" urine="" volume="" of="" the="" model="" group="" was="" significantly="" lower="" than="" that="" of="" the="" control="" group(fig.2b-d,=""><0.01). cf="" supplementation="" down-regulated="" the="" levels="" of="" urine="" protein,="" serum="" cr="" and="" urea="" nitrogen="" in="" the="" model="" group(fig.2b-d,=""><0.05 or=""><0.01) while="" increasing="" the="" urine="" output="" of="" model="" mice.="" collectively,="" the="" results="" indicated="" that="" samp8="" mice="" had="" kidney="" damage="" associated="" with="" aging,="" and="" treatment="" with="" cf="" effectively="" ameliorated="" this="" injury.="">cistanche gengis khanSuccessivamente, è stato studiato se la FC ha modulato in modo benefico lo stress ossidativo e l'infiammazione nei reni di topi che invecchiano rapidamente. Come mostrato in Fig.2e-h, i livelli di SOD e GSH-Pxin nei reni del gruppo M erano significativamente inferiori a quelli del gruppo Con e i livelli di IL-1 erano significativamente superiori a quelli di il gruppo Con. Dopo il trattamento della FC, gli indicatori di cui sopra sono stati migliorati, in particolare l'effetto di miglioramento di CF-L e CF-M è migliore.

CF ha attivato la via Nrf2 nel rene dei topi SAMP8

Il livello di espressione di p-Nrf2 è stato misurato nei tessuti renali per indagare se il percorso Nrf2 fosse coinvolto nell'effetto protettivo di CF (Fig. 3a-c) nel presente studio. Il livello di espressione di p-Nrf2 è diminuito significativamente nel solo gruppo SAMP8 (P<0.01, fig.="" 3c),="" and="" the="" downregulation="" was="" reversed="" to="" some="" extent="" by="" the="" treatment="" of="" cf="" crude="" extract.="" there="" was="" no="" significant="" change="" in="" the="" expression="" level="" of="" keapl="" among="" the="" groups(fig.="" 3b="" and="" d).="" further,="" the="" expression="" level="" of="" p-c-fos="" was="" detected="" and="" analyzed="" by="" immunohistochemical="" and="" western="" blot="" analyses.="" it="" was="" found="" that="" the="" expression="" level="" of="" p-c-fos="" in="" the="" kidneys="" of="" mice="" in="" the="" m="" group="" was="" significantly="" higher="" than="" that="" in="" the="" con="" group;="" while="" cf="" treatment="" significantly="" reduced="" the="" expression="" levels="" of="" p-c-fos="" in="" the="" kidneys="" of="" the="" mice="" (fig.3a-b="" and="">

CF attenuato l'attivazione del segnale Wnt/-catenina/RAS nel rene dei topi SAMP8

Al fine di esplorare ulteriormente il potenziale meccanismo della FC che esercita l'effetto anti-fibrosi. La localizzazione delle proteine ​​è stata eseguita mediante immunoistochimica. Come mostrato in Fig. 4a, il livello di espressione di Wnt4 e

-catenina è stata indotta prevalentemente nelle cellule tubulari renali. Risultati simili sono stati osservati quando sono stati valutati AGTR1, gli obiettivi del percorso a valle della segnalazione Wnt (Fig. 4a). Successivamente, il livello di espressione proteica è stato quantificato e i risultati hanno mostrato che le proteine ​​Wnt4, -catenina, renina e AGTR1 sono state accumulate nel tessuto renale dei topi nel gruppo modello, mentre CF ha inibito significativamente tali alterazioni (Fig. 4b-f ). Inoltre, è stato individuato e analizzato quantitativamente anche il livello di espressione di CTGF. Coerentemente con i suddetti risultati, il CTGF è stato espresso principalmente nei tubuli renali e la FC ha inibito notevolmente l'attività del CTGF (Fig.4d g).

La CF e i suoi composti hanno inibito la senescenza delle cellule NRK-52E indotte da D-gal

Le cellule NRK-52E indotte da D-gal sono state utilizzate per selezionare alcuni principi attivi nella FC, per determinare la base materiale per il trattamento dei reni senili mediante l'estratto di FC. I risultati hanno mostrato che la CF ha migliorato la vitalità cellulare in modo dose-dipendente e i composti

SDC-0-14,16 e SDC-1-8 isolati da CF hanno avuto effetti migliori sulla proliferazione cellulare. Inoltre, 25 ug/mL CF e i composti SDC-0-14,16 e SDC-1-8 hanno mostrato tutti l'effetto di inibire l'attività della galattosidasi (Fig.5).

CF ha migliorato l'analisi PCA del tessuto renale nei topi SAMP8 È stata eseguita l'analisi dei componenti principali (PCA) per esplorare gli effetti della CF sui topi SAMP8. Come mostrato in Fig.6a, c'era un raggruppamento ovvio tra il gruppo di controllo e il gruppo modello (R2X=0.542; Q2=0.38), suggerendo che i metaboliti endogeni dei topi SAMP8 erano diversi da SAMR1 topi, che li fa deviare dal gruppo SAMR1. Come mostrato in Fig.6b, i diversi gruppi CF si sono raggruppati anche in classi diverse dai gruppi di controllo e modello, e i gruppi CF si sono avvicinati al gruppo di controllo, indicando che il

metaboliti endogeni dei topi SAMP8 intervenuti con CF erano simili a quelli dei topi SAMR1.

Discussione

L'invecchiamento gioca un ruolo importante nella progressione dell'insufficienza renale cronica [19]. Con il progredire della fibrosi CKD, le cellule senescenti esprimono e secernono fattori pro-fibrotici (TGF-, CTGF e così via) e fattori pro-infiammatori (IL-1 , IL-6, TNF- e così via ), che sono fattori fenotipici secretori associati alla senescenza, accelerando così la fibrosi renale [20, 21]. Attualmente, la medicina tradizionale cinese ha ottenuto buoni risultati nel trattamento della fibrosi renale con minori effetti collaterali [22]. Questo studio ha esplorato gli effetti interventistici dell'estratto di FC sulla fibrosi renale nei topi SAMP8. Il ceppo murino selezionato per questo studio era SAMP8, che è stato sviluppato sulla base della durata della vita, della senescenza e dei punteggi di grading fenotipico patologico dei topi AKR/ ed era un modello di invecchiamento accelerato esclusivamente di origine genetica [23,24]. Gli studi hanno dimostrato che i cambiamenti nella patologia renale dei topi SAMP8 (9 mesi) includono la fibrosi tubulointerstiziale e la glomerulosclerosi focale segmentale [25]. Ed è stato scoperto che la fibrosi renale nei topi SAMP8 era correlata all'età [6]. Pertanto, abbiamo testato l'attività di -galattosidasi e

il livello di fibrosi renale nei topi SAMP8 e ha scoperto che CF-L e CF-M hanno migliorato la fibrosi renale e l'attività della galattosidasi nei topi SAMP8 (Fig.1). E abbiamo anche testato la produzione di urina dei topi. Coerentemente con studi precedentemente pubblicati che indicavano che la FC ottenuta con due diversi processi aveva effetti diuretici [13], l'estratto aumentava significativamente il volume di urina dei topi SAMP8. Inoltre, il presente studio ha dimostrato che l'integrazione con CF ha migliorato la funzione renale, l'attività degli enzimi antiossidanti e i livelli di fattori infiammatori nei topi SAMP8 (Fig.2).

Il sistema Keap{0}}Nrf2 ha attirato l'attenzione di molti studiosi negli ultimi anni grazie alle sue proprietà antiossidanti e antinfiammatorie. Il suo potenziale farmacologico nel trattamento delle malattie renali è stato ampiamente studiato in studi non clinici e clinici [26]. Nrf2 è un regolatore trascrizionale principale per i geni relativi allo stato redox e agli effetti antiossidanti [27]. Gli studi hanno dimostrato che la fosforilazione è necessaria per l'attivazione di Nrf2 e l'induzione del gene bersaglio [28]. L'attivazione di Nrf2 ha migliorato la progressione della CKD prevenendo lo stress ossidativo e mantenendo l'omeostasi redox cellulare [29]. Come fattore chiave di trascrizione, Nrf2 svolge un ruolo cruciale nella difesa contro lo stress ossidativo regolando i suoi antiossidanti a valle e gli enzimi di disintossicazione [30]. Kim et al. hanno riferito che il resveratrolo, come potente attivatore di Nrf2, ha migliorato il danno renale progressivo correlato all'invecchiamento [31]. Nel presente studio, CF ha migliorato l'attenuazione di Nrf2 nel rene dei topi SAMP8 senza influenzare il livello di espressione di Keapl, suggerendo che l'estratto grezzo di CF potrebbe migliorare il danno ossidativo nei reni attivando la via Nrf2 (Fig. 3).

La fibrosi renale è caratterizzata da un'eccessiva deposizione di matrice extracellulare (ECM) che porta alla formazione di cicatrici nel parenchima renale [32]. Si ritiene che il fattore di crescita trasformante (TGF-) sia una citochina chiave nell'iperattivazione dei fibroblasti [33, 34]. Naturalmente, prendere di mira solo la via di segnalazione del TGF non è sufficiente per ridurre la fibrosi renale. Alcuni studi hanno indicato che CTGF, Wnt/ -catenina, sistema renina-angiotensina, stress ossidativo e così via, erano implicati nella fibrosi renale [35-37]. Wnt/ -catenina è una via di segnalazione evolutivamente conservata coinvolta nella regolazione dell'omeostasi dei tessuti, nello sviluppo degli organi e nella riparazione delle lesioni[38]. Cisterna et al. discusso l'effetto pro-fibrotico della segnalazione Wnt sia nel muscolo scheletrico che nel rene [39]. Prove crescenti hanno stabilito che la via di segnalazione Wnt/-catenina gioca un ruolo cruciale nella regolazione dello sviluppo e della progressione delle lesioni fibrotiche renali a seguito di una lesione [40-42]. Il segnale Wnt/-catenina è relativamente silenzioso nei reni di adulti sani e si attiva una volta che i reni sono soggetti a vari tipi di danno [43].

Nei mammiferi, la famiglia Wnt ha almeno 19 membri della famiglia critici per lo sviluppo del rene. E almeno 15 di questi membri della famiglia sono sovraregolati in modo differenziale nel rene che invecchia, incluso Wnt4 [6]. I risultati del presente studio hanno mostrato che il livello di espressione della proteina Wnt4 nei reni dei topi SAMP8 era significativamente superiore a quello dei topi SAMR1, che è stato verificato sia da Western blot che da analisi immunoistochimiche (Fig. 4a, d e f). Per coincidenza, anche il livello di espressione della proteina -catenina è stato sovraregolato. Inoltre, sia Wnt4 che -catenina erano espressi nelle cellule epiteliali tubulari renali, come rivelato dall'analisi immunoistochimica (Fig. 4a e f). Wnt/-catenina ha provocato fibrosi renale inducendo più geni fibrogenici come componenti RAS, metalloproteinasi della matrice-7 (MMP-7), inibitore dell'attivatore del plasminogeno 1 (PAI-1) e lumaca [37 ]. Zhou et al. descritto Wnt/-catenina come il principale regolatore a monte, che controlla l'espressione di tutti i componenti RAS testati nei reni [44]. Zhou et al. hanno utilizzato un modello di ratto 5/6 nefrectomia (5/6 NX) per mostrare i livelli di espressione dei principali componenti di RAS nel cervello e nei reni, come l'angiotensinogeno, l'enzima di conversione dell'angiotensina e l'angiotensina II AT{{25 }}recettore è stato notevolmente sovraregolato. Il livello di espressione sovraregolato è stato inibito da un bloccante centrale di Wnt, che era un vettore virale adeno-associato che sovraesprimeva il gene DKK1 [45]. Allo stesso modo, il presente studio ha rilevato che AGTR1 era ancora espresso nell'epitelio tubulare renale e che i livelli di espressione di renina e AGTRl nei tessuti renali dei topi SAMP8 erano significativamente maggiori di quelli dei topi SAMR1 (Fig. 4a e dg). Questi risultati hanno indicato che la via di segnalazione Wnt/-catenina/RAS è stata attivata nei reni dei topi SAMP8 e la CF ha effettivamente inibito l'attivazione di questa via.

Il CTGF esercita molteplici funzioni biologiche, inclusa la promozione della mitosi delle cellule chemiotattiche, l'induzione dell'adesione e la promozione della proliferazione cellulare e della sintesi di ECM [35,46]. Segnalazione Wnt modulata CCN2(CTGF) legandosi alla proteina correlata al recettore delle lipoproteine ​​a bassa densità 5/6 (LRP5/6) per mediare ulteriormente la fibrosi [39, 47]. Altri studi hanno utilizzato il silenziamento genico per scoprire e confermare che Nrf2 regolava la via Wnt regolando il livello di espressione di CTGF, influenzando la malattia interstiziale renale. Inoltre, Nrf2 ha regolato il livello di trascrizione CTGF principalmente tramite il regolatore trascrizionale CTGF c-Fos [48]. L'analisi immunoistochimica ha rivelato che CTGF e pc-Fos erano espressi principalmente nelle cellule epiteliali tubulari renali e pc-Fos erano anche distribuiti nei glomeruli. L'analisi quantitativa ha mostrato che i livelli di espressione di entrambe le proteine ​​erano inibiti da CF (Figg.3b ed e e 4a e c). Infine, l'analisi PCA è stata utilizzata per verificare ulteriormente che la fibrosi cistica ha migliorato il danno renale nei topi SAMP8 (Fig.6). Il presente studio ha fornito prove che la FC non solo ha attivato la segnalazione Nrf2, ma si è anche affidata a Nrf2 per bilanciare lo stress ossidativo e l'infiammazione, inibire la segnalazione Wnt/-catenina/RAS e migliorare l'invecchiamento renale e la fibrogenesi renale. Tuttavia, abbiamo anche riscontrato un miglioramento incoerente nell'effetto della CF sulla colorazione di Masson e SA- -gal in questo esperimento. Si ipotizza che ciò possa essere dovuto alla progressione incoerente dell'invecchiamento renale e della fibrosi renale nei topi SAMP8. Il grado di invecchiamento renale nei topi in questo esperimento può essere più grave della fibrosi. Pertanto, l'effetto migliorativo del CF-H sull'invecchiamento renale nei topi SAMP8 non era così evidente come quello della fibrosi renale.

Come monosaccaride riducente, il D-galattosio è ampiamente utilizzato in varie malattie legate all'età in vivo e in vitro. È stato scoperto che D-gal causa senescenza e lesioni nelle cellule NRK-52E [49], induce senescenza delle cellule epiteliali tubulari prossimali del rene umano (cellule HKC-8) e aumenta i livelli di espressione di due proteine ​​​​marcatori della fibrosi FN e a-SMA [6]. In questo studio, D-gal è stato utilizzato per indurre cellule NRK-52E in vitro. Utilizzando il test MTT e la colorazione della -galattosidasi per rilevare i composti isolati da CF, è stato riscontrato che SDC-0-14,16 e SDC-1-8 miglioravano la vitalità cellulare indotta da D-gal e inibivano D-gal indotta senescenza cellulare (Fig.5). Questi hanno suggerito che la DSC-0-14,16 e la DSC-1-8 potrebbero essere la base materiale per la fibrosi cistica per ritardare l'invecchiamento renale. SDC-1-8 è uno dei glicosidi feniletanoidi. è stato riscontrato che i glicosidi feniletanoidi prolungano la durata della vita di Caenorhabditis Elegans [50], con effetti anti-invecchiamento, [51] e neuroprotettivi [52-54]. Questi forniscono una direzione per il nostro studio di follow-up sugli effetti farmacologici della FC.

Conclusioni

In conclusione, studi in vivo hanno dimostrato che la fibrosi renale riduce la fibrosi renale nei topi anziani. Alcuni potenziali principi attivi sono stati trovati in esperimenti in vitro. Questi risultati hanno fornito supporto farmacologico per il trattamento della malattia renale utilizzando la FC e una direzione per ulteriori ricerche sui principi attivi della FC.

Questo articolo è tratto da Cao et al. Medicina e terapie complementari BMC (2022) 22:52