Il percorso per progredire negli studi preclinici sulle malattie neurodegenerative legate all'età: una prospettiva sui modelli derivati ​​dai roditori e dalle HiPSC, parte 5

Vantaggi dei sistemi cellulari e dei modelli di malattia derivati ​​da hiPSC

Piattaforme migliorate per la modellazione delle malattie e la scoperta di farmaci

Il potenziale per i modelli in vitro basati su hiPSC di essere altamente informativi per le NDD con un'indagine sulla componente genetica umana è elevato.

Il rapporto tra genetica umana e memoria è una questione molto dibattuta, soprattutto nella società moderna, dove ci si concentra sullo sviluppo personale e sull’apprendimento. Sebbene le nostre informazioni genetiche determinino le nostre caratteristiche di base alla nascita, la memoria è diversa dalle caratteristiche fisse come l’altezza e il colore della pelle. Può invece essere coltivata e migliorata, e gioca un ruolo importante nella vita quotidiana.

Innanzitutto, la ricerca scientifica dimostra che la memoria non è direttamente correlata ai geni genetici. Sebbene alcune persone nascano più intelligenti di altre, a lungo termine la memoria può essere gradualmente migliorata attraverso l’apprendimento e la coltivazione. Nel nostro processo di apprendimento, dalla scuola elementare all'università, dobbiamo utilizzare e migliorare costantemente la nostra memoria per migliorare il nostro rendimento scolastico. Ad esempio, ricordiamo problemi e soluzioni attraverso ripetuti ripassi e pratiche, che aiutano a esercitare la nostra capacità di memoria.

In secondo luogo, uno stile di vita sano aiuta molto anche la nostra memoria. La salute fisica ha un grande impatto ed effetto sulla memoria, come un sonno adeguato, una dieta sana e un esercizio fisico moderato. Iniziamo dal nostro corpo e ci manteniamo in salute attraverso l'esercizio fisico e uno stile di vita sano, che renderà la nostra memoria più chiara e nitida.

Infine, possiamo anche espandere la nostra capacità di memoria ampliando costantemente i nostri orizzonti e partecipando a varie cose nuove. Ad esempio, possiamo provare a imparare una nuova lingua e partecipare ad attività sociali come i viaggi, e queste esperienze possono creare più ricordi nella nostra mente.

In breve, la relazione tra la genetica umana e la memoria è complessa e diversificata e, naturalmente, ci saranno differenze corrispondenti basate sulle differenze genetiche personali. Ma non dobbiamo ignorare ciò che possiamo fare: migliorare la nostra memoria e la capacità di autogestione attraverso l’apprendimento continuo, una vita sana e l’espansione costante dei nostri orizzonti è il modo migliore per superare le differenze genetiche. Si può vedere che dobbiamo migliorare la nostra memoria e Cistanche può migliorare significativamente la memoria perché Cistanche è una medicina tradizionale cinese con molti effetti unici, uno dei quali è quello di migliorare la memoria. L'efficacia di Cistanche deriva dai suoi vari principi attivi, tra cui acido tannico, polisaccaridi, glicosidi flavonoidi, ecc. Questi ingredienti possono promuovere la salute del cervello in molti modi.

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La capacità di correlare i geni candidati NDD ai fenotipi cellulari, come i profili di espressione di RNA e proteine, i cambiamenti morfologici e le firme biochimiche nelle cellule derivate da hiPSC, facilita gli studi che affrontano il modo in cui i componenti genetici umani di NDD complessi, come AD e PD, sono espressi su un livello cellulare.

Inoltre, le hiPSC consentono l'incorporazione nel modello della complessità genetica del background genetico sottostante del paziente, che è spesso negato (ad esempio, modelli chimici) o eccessivamente semplificato (ad esempio, modelli animali con varianti monogenetiche).

È risaputo che l’esordio, la progressione e la gravità della neurodegenerazione sono determinati da fattori genetici complessi e dall’interazione di diverse varianti genetiche con effetti relativamente minori.

Questo paesaggio genetico innato catturato in modelli hiPSC derivati ​​dai pazienti ci consente di studiare determinanti genetici e fattori biologici, abbinati alla capacità di generare modelli NDD in vitro modulari e ad alta fedeltà, per sviluppare la nostra attuale comprensione della biologia delle malattie. La tecnologia hiPSC rappresenta attualmente l'unica tecnologia umana disponibile modelli basati su modelli in cui viene catturato l'intero panorama genetico dei pazienti.

Inoltre, la possibilità di applicare tecnologie di modifica del genoma, come CRISPR-Cas9, utilizzando hiPSC ha consentito la generazione di modelli isogenici per la valutazione di precise varianti genetiche. Oltre alla scalabilità, gli hiPSC sono auto-rinnovabili.

Pertanto, i modelli derivati ​​da hiPSC rappresentano un sistema promettente all’avanguardia per gli studi preclinici. Inoltre, la diversità genetica umana catturata nella capacità hiPSC derivata dal paziente li rende adatti alla valutazione di approcci di “medicina personalizzata”.

La capacità di monitorare in modo efficace le reazioni individuali ai trattamenti e di identificare i non-responder o i pazienti con scarsa risposta prima della somministrazione in un contesto clinico sottolinea ulteriormente l'idoneità dei modelli derivati ​​da hiPSC per le valutazioni precliniche (Figura 2).

Nel complesso, le informazioni potenziali generate attraverso gli studi preclinici nei modelli hiPSC sono robuste, rilevanti per i soggetti umani ed essenziali da implementare nella progettazione degli studi clinici (ad esempio, stratificazione dei soggetti dello studio) per migliorare l'accuratezza dei risultati.

Superare i limiti dei modelli animali

Le hiPSC offrono un modo per superare molti dei problemi presenti negli attuali modelli basati sugli animali, come discusso in precedenza. In primo luogo, i modelli derivati ​​da iPS forniscono una piattaforma basata sull’uomo per valutare potenziali terapie nell’attuale panorama genetico della malattia umana.

In secondo luogo, derivando cellule dai pazienti, molti problemi tecnici riguardanti il ​​modo migliore per modellare le mutazioni delle malattie umane vengono aggirati perché il modello contiene il background genetico unico del paziente. In terzo luogo, le cellule hiPSC sono facilmente accessibili alla manipolazione genetica e farmacologica, consentendo analisi strutturali e funzionali ad alto rendimento che valutano il fenotipo della malattia.

A tal fine, abbiamo recentemente sviluppato un modello neuronale DA derivato da hiPSC ottenuto da un paziente con malattia di Parkinson con triplicazione di SNCA per valutare un GT LV all-in-one volto a ridurre i livelli di SNCA. Il nostro intervento sul LV ha ridotto con successo i livelli di SNCA e salvato i fenotipi correlati alla malattia attraverso la generazione di specie ossidative reattive (ROS) e la preservazione della vitalità cellulare.140

In quarto luogo, rispetto al modello standard dei roditori, la generazione di modelli basati su hiPSC in vitro può essere ottenuta in un arco temporale significativamente più breve, nell'ordine di 30 giorni rispetto ai modelli animali che possono variare ampiamente da mesi ad anni.

In quinto luogo, e in linea con il punto precedente, i modelli basati su hiPSC sono notevolmente meno costosi e consumano energia rispetto ai modelli sui roditori, in particolare se si considerano gli obblighi e le infrastrutture di mantenimento degli animali in corso, le normative, nonché i requisiti di formazione e conformità. La modellizzazione preclinica della malattia, sempre più economica, aumenta l’accessibilità da parte dei gruppi di ricerca per valutare le possibili terapie, migliorare la traducibilità e, in definitiva, migliorare l’efficienza dello sviluppo della DMT.202

Nel complesso, questi vantaggi danno ai modelli derivati ​​dalle hiPSC un netto vantaggio nello studio della neurodegenerazione, e tali modelli hanno il potenziale per generare nuove scoperte che erano inaccessibili nei precedenti modelli di colture cellulari e malattie animali.

Gli studi qui esaminati dimostrano la necessità e il valore dell'incorporazione di modelli 2D e 3D basati su hiPSC negli studi meccanicistici NDD che chiariscono i fattori coinvolti nella causa della malattia e nei percorsi patogeni, nonché negli studi traslazionali e di scoperta di farmaci, come l'identificazione e la validazione di bersagli terapeutici .

Insieme, i modelli NDD derivati ​​da hiPSC rappresentano un passo avanti nella ricerca medica attraverso una migliore modellizzazione delle malattie che è considerevolmente fattibile, con esperimenti relativamente più brevi che sono economicamente vantaggiosi e, cosa forse più importante, accurati e adatti per modellare le malattie umane.

Figura 2. Schema di una pipeline di sviluppo di farmaci DMT migliorata per NDD attraverso una maggiore incorporazione e/o sostituzione di modelli derivati ​​da hiPSC Lo sviluppo di qualsiasi presunto DMT inizia con la fase di scoperta, che comprende sia l'identificazione dei bersagli genetici pertinenti sia i meccanismi della malattia.

I successivi modelli di malattia vengono ideati nella fase preclinica iniziale per esplorare la patofisiologia della malattia cellulare e convalidare i bersagli farmacologici, nonché lo screening precoce e l'ottimizzazione dei primi CGT-IP/DMT. Lo sviluppo progressivo delle DMT, compreso l'ulteriore sviluppo del modello e la validazione del target, nonché l'indagine sugli effetti fuori target, avviene durante la fase preclinica intermedia.

Con il progredire della DMT, ulteriori informazioni sull’attività farmacocinetica e farmacodinamica vengono ottenute nella fase tardiva preclinica. Il maggiore utilizzo di modelli derivati ​​da hiPSC in queste fasi rappresenta un miglioramento interessante per l’attuale percorso di sviluppo di farmaci per diverse ragioni; vale a dire, sono economici, versatili e, soprattutto, superano molti dei limiti innati dei modelli animali esistenti di NDD.

In questa fase, le domande IND possono essere presentate per presunti DMT, che attualmente contengono 4 obiettivi critici che devono essere raggiunti con qualsiasi DMT emergente, in particolare CGT-IP: (1) selezione del target, (2) sviluppo e ottimizzazione del composto principale, (3) iniziale e aumento del regime di dosaggio e (4) determinazione della fattibilità e del ROA.

Ognuno di questi può essere affrontato in modo accurato e appropriato con la sostituzione di modelli basati su hiPSC negli studi preclinici. I DMT potrebbero quindi ricevere l’approvazione della FDA per iniziare gli studi clinici.

Potrebbe essere inclusa l’incorporazione di modelli basati su hiPSC in un’ulteriore fase 1a, che facilita un migliore screening dei candidati nella fase di reclutamento e l’identificazione di potenziali non-responder o scarsamente responsivi sulla base di studi genetici preclinici.

I DMT con sicurezza dimostrabile nella fase 1a progrediscono poi attraverso gli studi clinici di fase 1, 2 e 3, dopo di che, quelli con un effetto positivo significativo ricevono l'approvazione normativa New Drug Application (NDA) e vengono rilasciati per l'uso da parte dei consumatori con continua farmacovigilanza per identificare qualsiasi farmaco precedentemente non identificato. esiti negativi nel tempo.

Limitazioni dei modelli in vitro derivati ​​da hiPSCTempo e riproducibilità

Le tecnologie di coltura delle hiPSC sono emerse nell'ultimo decennio e la loro utilità per la modellazione della malattia e la valutazione preclinica di presunti DMT è relativamente nuova.

Come con qualsiasi tecnologia emergente, è necessario considerare diverse limitazioni quando si tenta di ricreare accuratamente le caratteristiche biologiche delle NDD. Innanzitutto, la coltivazione di hiPSC e la generazione di modelli cellulari accurati e affidabili possono essere costose, laboriose e dispendiose in termini di tempo. In media, convalidare le linee hiPSC secondo uno standard adeguato per la ricerca medica costa da $ 10,000 a USD 25,000.203

I processi di riprogrammazione, differenziazione e maturazione sono prolungati. La riprogrammazione cellulare del tessuto iniziale in hiPSC può richiedere almeno dai 20 ai 30 giorni,151 e la successiva differenziazione e maturazione cellulare variano a seconda del tipo cellulare desiderato e del metodo utilizzato; ad esempio, la generazione di neuroni maturi, astrociti e microglia può richiedere rispettivamente da 6 a 15 settimane,204 4 a 9 settimane,205,206 o da 5 a 9 settimane,164,207.

Di conseguenza, i ricercatori spesso preferiscono l’uso di cellule progenitrici come intermedi stabili per la sperimentazione, poiché sono ampiamente rappresentative del tipo di cellula bersaglio e possono essere generate in un arco di tempo più rapido.204 Pertanto, i vincoli di tempo e i costi necessari per stabilire il sistema modello hiPSC possono rappresentano una preoccupazione per molti gruppi di ricerca.

Inoltre, anche il tempo richiesto per lo sviluppo di fenotipi cellulari chiave associati alla malattia nelle cellule derivate da hiPSC è una considerazione nella modellizzazione delle NDD. Considerando che sono necessari decenni di vita di un paziente per presentare sintomi clinici e patologici, i fenotipi molecolari correlati alla malattia nei modelli derivati ​​da hiPSC sono stati rilevati circa 2 mesi dopo la maturazione.208

Tuttavia, i vincoli derivano dalla durata limitata dei modelli in coltura basati su hiPSC che potrebbero non essere sufficienti per sviluppare un quadro completo che somigli alla malattia a livello cellulare e tissutale.

Le strategie mirate ad accelerare il processo di differenziazione e maturazione, come l'incorporazione di Notch e degli inibitori della g-secretasi per abbreviare il tempo di maturazione,209 e la sovraespressione di neurogenina-2 (Ngn2) o NeuroD1158 hanno avuto parzialmente successo e hanno introdotto altre preoccupazioni sollevate dall'espressione ectopica.

Altre limitazioni sono legate alla riproducibilità dei sistemi in esperimenti ripetitivi e alla variabilità intrinseca da modello a modello, compresi gli inconvenienti riguardanti la purezza delle colture derivate da hiPSC e la presenza di popolazioni cellulari eterogenee indesiderate.210

Pertanto, è importante tenere conto dell'eterogeneità nelle popolazioni cellulari quando si utilizzano modelli di malattia derivati ​​da hiPSC, in particolare nello screening DMT e nella valutazione dell'efficacia. Inoltre, è stato segnalato che le colture hiPSC mostrano instabilità genomica e sono inclini ad acquisire aberrazioni e mutazioni genetiche durante l'espansione e la riprogrammazione cellulare.211

È inoltre necessario prestare attenzione nell'uso di linee isogeniche generate da varie tecniche di modifica del genoma, poiché possono verificarsi potenziali effetti fuori bersaglio (ad esempio, variabilità clonale involontaria tra linee isogeniche e mutagenesi fuori bersaglio).212,213 Pertanto, è importante valutare periodicamente la stabilità genomica delle hiPSC per garantire uno screening DMT rigoroso.

Sfide nel ricapitolare la fisiopatologia della NDD sporadica e i fenotipi cellulari

La complessità delle NDD e la mancanza di una caratterizzazione completa e di una comprensione meccanicistica dei loro fenotipi cellulari pongono sfide alla capacità di ricapitolarli con modelli cellulari, compresi i sistemi basati su hiPSC.

Le cause delle NDD sono complesse e multifattoriali, compresi fattori di rischio poligenici (cioè geni multipli e varianti), segni epigenetici, invecchiamento, sesso e fattori ambientali, come fattori scatenanti dello stress ossidativo, alcuni dei quali sono difficili da indurre, in particolare in un elenco infinito di vari fattori. combinazioni, in un sistema di laboratorio.

Inoltre, la maggior parte dei modelli AD-PD derivati ​​da hiPSC deriva da pazienti con mutazioni familiari che rappresentano solo una percentuale molto piccola dei casi complessivi.214,215 Poiché i meccanismi alla base delle forme familiari rispetto a quelle sporadiche possono essere distinti, è necessario stabilire modelli derivati ​​da hiPSC e fibroblasti ottenuti da pazienti con sAD o PD sporadici.

Verso questo obiettivo, negli ultimi anni sono emerse iniziative di archivi di cellule dei pazienti; questi includono Applied StemCell (ASC), California Institute for Regenerative Medicine (CiRA), Cedars Sinai Induced Pluripotent Stem Cell Core, European Bank for Induced Pluripotent StemCells (EBiSC), Korea National Stem Cell Bank (KSCB), National Institute of Aging (NIA) , Istituto nazionale per i disturbi neurologici e l'ictus (NINDS), Istituto nazionale di scienze mediche generali (NIGMS) e WiCell Research Institute (WiCell) (Tabella S2).

La crescita prevista di queste collezioni faciliterà la creazione di modelli derivati ​​da hiPSC più adatti per la ricerca sui sAD comuni e sul PD sporadico.

Tuttavia, i modelli hiPSC derivati ​​da pazienti NDD sporadici producono fenotipi cellulari appropriati caratteristici di AD181 e PD216 in seguito a manipolazioni ambientali, come l'esposizione a neurotossine e l'induzione chimica dello stress ossidativo.

Inoltre, uno studio recente ha rivelato alterazioni nell'espressione delle proteine ​​mitocondriali e un elevato stress ossidativo nelle hiPSC generate da pazienti con sAD, nonostante una marcata mancanza di patologia Ab e tau,217 suggerendo che i modelli hiPSC possono rivelare preziose informazioni sulla patofisiologia sfumata specifica dei sottotipi NDD sporadici.

Inoltre, uno studio recente di Meyer et al.218 ha utilizzato hiPSC derivate da pazienti con sAD e ha scoperto che MAPT, che codifica per la proteina tau, era significativamente aumentato nelle cellule derivate da sAD rispetto ai controlli sani.

Pertanto, nonostante queste sfide, gli attuali modelli derivati ​​da hiPSC sono eccellenti surrogati che offrono l’opportunità di imitare la patofisiologia della malattia e stabilire caratteristiche di malattia standard con le basi genetiche complete nei pazienti sporadici, che possono essere sfruttate come misure di esito per migliorare i successivi modelli di malattia.

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