L'effetto protettivo della quercetina sulle cellule endoteliali danneggiate da ipossia e riossigenazione

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Sfondo: La malattia dei piccoli vasi cerebrali (CSVD) è un gruppo di sindromi cliniche che coprono tutti i processi patologici dei piccoli vasi nel cervello, che possono causare ictus e demenza grave. Tuttavia, poiché la patogenesi del CSVD non è chiara, il trattamento è limitato. La disfunzione delle cellule endoteliali è precedente ai sintomi clinici, come l'ipertensione e la leucosi. Pertanto, il trattamento delle cellule endoteliali dovrebbe essere una nuova svolta.Quercetina, un flavonoide presente in una varietà di piante, ha la funzione di antinfiammatorio e antiossidante. Questo studio mirava a studiare l'effetto protettivo della quercetina sul danno delle cellule endoteliali e fornire una teoria di base per la successiva applicazione in clinica.

Metodi: Le cellule endoteliali microvascolari del cervello umano (HBMEC) sono state coltivate in vitro e il modello di lesione delle cellule endoteliali è stato stabilito mediante ipossia e riossigenazione (H/R). Gli effetti protettivi della quercetina sugli HBMEC sono stati studiati dal punto di vista della vitalità cellulare, della migrazione cellulare, dell'angiogenesi e dell'apoptosi. Per studiare ulteriormente il meccanismo della quercetina,lo stress ossidativoe sono stati analizzati lo stress del reticolo endoplasmatico. Inoltre, è stata studiata anche l'integrità della barriera ematoencefalica (BBB).

Risultati: Quercetinapuò promuovere la vitalità, la migrazione e l'angiogenesi delle HBMEC e inibire l'apoptosi. Inoltre, la quercetina può anche attivare la via di segnalazione Keap1/Nrf2, ridurre l'espressione della proteina ATF6/GRP78. Ulteriori studi hanno dimostrato che la quercetina potrebbe aumentare l'espressione di Claudin-5 e Zonula occludens-1.

Conclusioni: I nostri esperimenti mostrano che la quercetina può proteggere gli HBMEC da H/R, che contiene la promozione della proliferazione cellulare, la migrazione cellulare e l'angiogenesi, riducendo il potenziale danno della membrana mitocondriale e inibendo l'apoptosi cellulare. Ciò può essere correlato alla sua antiossidante e inibizione dello stress del reticolo endoplasmatico. Allo stesso tempo, la quercetina può aumentare il livello di connessina BBB, suggerendo che la quercetina può mantenere l'integrità della BBB.

Parole chiave: malattia dei piccoli vasi cerebrali, cellule endoteliali, quercetina, stress ossidativo, stress del reticolo endoplasmatico, barriera ematoencefalica

INTRODUZIONE

Malattia dei piccoli vasi cerebrali(CSVD) è un termine generico che comprende tutti i processi patologici che coinvolgono i piccoli vasi nel cervello e si riferisce a un gruppo di sindromi cliniche, di imaging e patologiche con varie eziologie contenenti le arteriole intracraniche alle venule (diametro<400 μm）（wardlaw="" et="" al,2013;="" wardlaw="" et="" al,2019).="" the="" most="" common="" symptoms="" include="" mainly="" new-onset="" subcortical="" small="" infarcts,="" lacunar="" foci="" of="" vascular="" origin,="" cerebral="" white="" matter="" hyperintensities,="" microbleeds,="" cerebral="" atrophy,="" and="" enlarged="" perivascular="" spaces="" (wardlaw="" et="" al,2013).="" with="" the="" progression="" of="" the="" disease,="" subclinical="" and="" early-stage="" patients="" can="" have="" emotional="" abnormalities,="" gait,="" memory,="" disorientation,="" and="" even="" stroke="" and="" dementia="" and="" other="" serious="" consequences.="" up="" to="" 25%="" of="" stroke="" and="" 45%="" of="" dementia="" are="" caused="" by="" csvd(cannistraro="" et="" al,2019),="" which="" brings="" a="" heavy="" socioeconomic="" burden="" and="" is="" a="" major="" problem="" that="" needs="" to="" be="" addressed="" by="" slow="" disease="" and="" health="" strategies.="" scholar="" has="" used="" dynamic="" contrast="" enhanced-mri="" technique="" to="" find="" that="" blood-brain="" barrier(bbb)leakage="" is="" more="" prevalent="" in="" csvd="" patients(zhang="" et="" al,2017).="" extravasation="" of="" blood="" components="" may="" lead="" to="" local="" vascular="" changes="" and="" diffuse="" brain="" tissue="" damage.="" the="" bbb="" is="" a="" junction="" of="" endothelial="" cells,="" pericytes,="" and="" astrocyte="" tight="" junctions(keaney="" and="" campbell,="" 2015).in="" addition,="" more="" and="" more="" scholars="" also="" believe="" that="" endothelial="" dysfunction="" plays="" a="" key="" role="" in="" the="" early="" development="" of="" csvd="" (hainsworth="" et="" al,2015).="" therefore,="" protecting="" endothelial="" cells="" may="" be="" a="" potential="" therapeutic="" strategy="" for="">

Quercetinaè un flavonoide presente in diverse piante, come Polygonum cuspidatum Sieb. et Zucc ha una forte attività antiossidante e antinfiammatoria e può esercitare effetti protettivi in ​​varie condizioni patologiche tra cui malattie cardiovascolari, disordini metabolici, malattie neurodegenerative, diabete, cancro e obesità (Dok-Go et al,2003; Comalada et al,2005; Cho et al, 2006). Il pretrattamento con quercetina ha aumentato significativamente i livelli di espressione degli enzimi antiossidanti endogeni nei neuroni piramidali CA1 dell'ippocampo di animali colpiti da ischemia, mostrando forti effetti antiossidanti e neuroprotettivi (Chen et al, 2017). Studi recenti hanno anche scoperto che la quercetina ha effetti neuroprotettivi contro il danno ischemico pur mantenendo l'integrità del BBB (Jin et al, 2019). Tuttavia, il suo effetto sulle cellule endoteliali microvascolari cerebrali (BMEC) in condizioni di ipossia e danno da riossigenazione (H/R) è scarsamente studiato e la proteina bersaglio della quercetina che protegge i BMEC non è stata segnalata.

Nel nostro studio, abbiamo esplorato l'effetto protettivo della quercetina sulle cellule endoteliali microvascolari del cervello umano (HBMEC) danneggiate da H/R in coltura. Allo stesso tempo, abbiamo ulteriormente studiato il possibile meccanismo del suo effetto protettivo, in modo da fornire una base più teorica per la promozione clinica della quercetina e fornire nuove idee per il trattamento della CSVD.

MATERIALI E METODI

Mezzi, reagenti e anticorpi

Quercetina(purity>Il 98 percento) è stato acquisito da Best Biological Technology Co, Ltd. (Chengdu, Cina). Gli HBMEC sono stati acquistati da Qingqi Biotechnology Development Co., Ltd (Shanghai, Cina). Il siero fetale bovino (FBS) è stato ottenuto da Biological Industries (Kibbutz Beit Haemek, Israele). La penicillina/streptomicina e il medium eagle modificato di Dulbecco (DMEM) sono stati acquistati da Hyclone (GA, Stati Uniti). Il kit per il test del potenziale di membrana mitocondriale (JC-1), il kit per il test della proteina BCA, il 2,7-dicloruro-idrofluoresceina diacetato (DCFH-DA) e il lisato NP40 sono stati acquistati da Beyotime Biotechnology (Shanghai, Cina). La preparazione della fosfatasi e l'inibitore della proteasi completo sono stati acquistati da Roche (Shanghai, Cina). Apoptosis Kit è stato acquistato da BD Biosciences (Sparks, MD, Stati Uniti). Malondialdeide (MDA), Superossido dismutasi (SOD), Molecola di adesione cellulare intercellulare-1 (ICAM-1), Molecola di adesione cellulare vascolare-1 (VCAM{{0}} )saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA) era (Cambridge, Abcam ha acquistato la società dfrom1"一Regno Unito). Anticorpi contro il fattore 2 correlato al fattore nucleare E2-(Nrf2), Kelch Like ECH Associated Protein 1 (Keap1), Attivando il fattore di trascrizione 6 (ATF6), la proteina 78 regolata dal glucosio (GRP78), Zonula occludens 1 (ZO-1), Claudin-5, GAPDH è stato acquistato da Cell Signaling Technology (Danvers, Stati Uniti). IgG anti-coniglio coniugato con perossidasi di rafano (HRP) è stato ottenuto dalla società Jackson (Pennsylvania, Stati Uniti).Il kit di erogazione rapida SDS-PAGE e la soluzione cromogenica ECL sono stati acquistati da EpiZyme Biotechnology (Shanghai, Cina). sono stati coltivati ​​​​in DMEM contenente l'10 percento di FBS e l'1 percento di penicillina-streptomicina, a 37 incubatore con il 5 percento di CO2. Per causare endoteli danno cellulare, le HBMEC sono state trattate con 12 ore di ipossia seguite da 8 ore di riossigenazione e le procedure specifiche erano le seguenti (Warpsinski et al.,2020): le HBMEC sono state prima incubate con il mezzo privo di siero in un'incubatrice per ipossia (1 percento O,5 percento di CO,94 percento di N) per 12 ore, quindi il mezzo è stato cambiato in un terreno normale contenente il 10 percento di FBS, mentre sono stati incubati in un'incubatrice di normossia (95 percento di O2,5 percento di CO2) per 8 ore. Trattamento con quercetina 2 mg di quercetina sono stati disciolti in 331μL di DMSO per formare una soluzione madre con una concentrazione di 1 mmol/L e conservata a -20 gradi . La soluzione di lavoro è stata diluita a 0,1,0,5,1,2,5,10umol/L con DMEM, in cui la percentuale di DMSO era inferiore a 0,1%. Una volta che le cellule erano state aderenti, è stata aggiunta la quercetina con il mezzo privo di siero e le piastre sono state successivamente poste nell'incubatrice per ipossia. Dopo 12 ore, le cellule sono state rimosse, cambiate in quercetina con mezzo di siero e poste in un'incubatrice di normossia per 8 ore.

Test di vitalità cellulare

Gli effetti diquercetinasulla fattibilità degli HBMEC sono stati esaminati dal Cell Counting Kit-8 secondo il manuale dell'operatore. Sono state prima valutate le dosi sicure di quercetina alle cellule in assenza di danno alle cellule endoteliali, quindi sono stati testati gli effetti protettivi della stessa in condizioni di danno cellulare. Tutti i risultati sperimentali sono stati ripetuti almeno tre volte.

Scratch Healing e Tube Formation Assay Gli esperimenti di migrazione sono stati eseguiti utilizzando un metodo di scratch cellulare. Prima del trattamento con quercetina, una linea retta perpendicolare è stata tracciata sul fondo della piastra di coltura e fotografata per la registrazione per 0 h, e le cellule sono state successivamente sottoposte a quercetina e trattamento di modellazione prima di scattare fotografie per la registrazione. Le aree anteriore e posteriore sono state contrastate due volte.

Formazione di tubi che imitano la capacità angiogenica delle cellule, il Matrigel ({0}} mg/ml) è stato posizionato sul fondo della piastra di coltura, quindi sono state placcate quercetina e cellule trattate modellanti, dopo 8 ore sono state scattate le foto. La generazione ramificata dei vasi sanguigni è stata analizzata e confrontata utilizzando ImageJ.

Potenziali della membrana mitocondriale e analisi dell'apoptosi

Il cambiamento del potenziale della membrana mitocondriale e il kit di apoptosi sono stati utilizzati per rilevare l'apoptosi cellulare. L'alterazione del potenziale della membrana mitocondriale è stata rilevata colorando gli HBMEC con la sonda fluorescente JC-1. La soluzione di lavoro di colorazione JC-1(1×) è stata aggiunta e incubata in un incubatore a 37 gradi per 20 minuti prima di essere lavata due volte con il tampone di colorazione JC-1(1×) e infine aggiunta a ciascun pozzetto per PBS . Quindi, l'imager cellulare ad alto contenuto è stato utilizzato per l'analisi.

Gli HBMEC sono stati raccolti dalle 6-piastre a pozzetti, centrifugati per rimuovere il surnatante, successivamente aggiungere 1 × soluzione legante l'annessina V per soffiare e mescolare le cellule, quindi aggiungere il colorante FITC Annexin V per incubare al buio a temperatura ambiente per 10 min, aggiungere la soluzione colorante di ioduro di propidio (PI) 5 min prima della macchina e il citometro a flusso Beckman è stato impiegato per rilevare.

ELISA

Dopo che le cellule sono state trattate con H/R o quercetina, è stato raccolto il surnatante. ICAM-1, VCAM-1, SOD e MDA sono stati rilevati utilizzando i kit ELSA in base al manuale dell'operatore.

Saggio di specie reattive dell'ossigeno (ROS) La capacità di generazione di ROS è stata rilevata dalla sonda DCFH-DA, che è stata valutata dall'imager cellulare ad alto contenuto e analizzata mediante fluorescenza utilizzando ImageJ. macchia occidentale

Gli HBMEC sono stati raccolti da piastre di coltura, il lisato NP40 aggiungendo la preparazione di fosfatasi e l'inibitore della proteasi completo è stato utilizzato per estrarre le proteine ​​dalle cellule. È stato determinato il contenuto proteico e sono state prelevate 30 ug di proteine ​​per esperimenti di immunoblotting. Il gel SDS-PAGE è stato utilizzato per l'elettroforesi, bloccato con il 5% di latte in polvere senza grassi dopo l'elettrotrasferimento su membrana PVDF per 1 ora a temperatura ambiente. Quindi anti-Nrf2(coniglio, 1:1,000), anti-Keapl(coniglio,1:1,000), anti-ATF6(coniglio,1:1,000 ), anti-GRP78(coniglio,1:1,000), anti-ZO-1(coniglio,1:1,000), anti-Claudin-5( coniglio,1:1,{33}}) sono stati incubati durante la notte a 4°C. Dopo il lavaggio il giorno successivo, gli anticorpi secondari anti-coniglio di capra diluiti (IgG HRP, 1:10,{38}}) sono stati aggiunti e incubati per 1 ora. Infine, il rilevamento è stato sviluppato dopo il lavaggio tre volte in TBST.

Analisi proteomica

Gli HBMEC sono stati trattati con H/R in presenza di quercetina (l umol/L). Successivamente, le cellule sono state delicatamente raschiate dalla piastra di coltura con un raschietto cellulare, raccolte in criovali, poste rapidamente in azoto liquido e quindi conservate a -80 gradi per 5 minuti la tecnologia iTRAQ è stata utilizzata per eseguire l'analisi proteomica, il proteine ​​con valore p<0.05 and="" ratio="" multiple="" changes="">1.2 o<0.83 were="" defined="" as="" differentially="" expressed="">

Analisi statistica

I dati erano adatti alla distribuzione normale e per esprimere i dati è stata utilizzata la media ± deviazione standard. GraphPad Prism 8 è stato utilizzato per l'analisi statistica. Due campioni indipendenti sono stati analizzati mediante t-test e i dati di misurazione sono stati descritti come media ± deviazione standard (SD). Il confronto tra i gruppi è stato condotto mediante l'analisi della varianza unidirezionale (ANOVA). valore p<0.05 indicated="" that="" the="" difference="" was="" statistically="">

RISULTATI

Risultati

Effetto della quercetina sulla vitalità cellulare

Per testare l'effetto della quercetina sulla vitalità cellulare, abbiamo prima esaminato una dose sicura di quercetina sulle cellule, come mostrato nella Figura 1A, che non ha avuto alcun impatto sulla vitalità cellulare a 0.1-10 umol/L . Successivamente, per cercare una dose efficace sulla base del danno cellulare endoteliale, abbiamo dimostrato che la quercetina a 0.1-1 μmol/L potrebbe promuovere la vitalità cellulare negli H/R-HBMEC, come mostrato nella figura 1B. Successivi esperimenti sono stati condotti intorno a questo intervallo di concentrazione. Vale la pena notare che quando la concentrazione del farmaco ha raggiunto 10 μmol/L, è comparsa la citotossicità. Abbiamo pensato che quando gli HBMEC sono stati danneggiati da H/R, la loro tolleranza diminuisce. Pertanto, quando la concentrazione del farmaco era leggermente superiore, il danno alle cellule aumentava. Pertanto, la citotossicità si è verificata quando la concentrazione del farmaco è di 10 μmol/L.

Effetto della quercetina sulla migrazione cellulare e sull'angiogenesi

Per esaminare gli effetti della quercetina sulle capacità migratorie e angiogeniche delle cellule endoteliali, gli HBMEC sono stati sottoposti a trattamento H/R mentre veniva somministrata la quercetina. Abbiamo eseguito un test scratch per testare la capacità di migrazione cellulare, che ha dimostrato che il trattamento H/R ha indebolito la capacità di migrazione di H/R-HBMEC rispetto al controllo e la quercetina potrebbe promuovere significativamente la migrazione cellulare a una concentrazione di 0 .1-1 μmol/L. La tubulogenesi è stata utilizzata per imitare l'angiogenesi in vitro e la sua lunghezza del ramo rappresenta la capacità angiogenica. I risultati hanno mostrato che il trattamento H/R ha comportato una riduzione della capacità angiogenica, ma la quercetina 0.1-1 μmol/L potrebbe invertire questa lesione, come mostrato nella Figura 2.

Effetto della quercetina sull'apoptosi cellulare

Per testare il potenziale della quercetina di inibire l'apoptosi delle cellule endoteliali, abbiamo impiegato il potenziale della membrana mitocondriale e l'apoptosi per la valutazione. Quando le cellule sono state danneggiate per subire eventi apoptotici, il potenziale di membrana mitocondriale è stato ridotto, la fluorescenza rossa citoplasmatica è stata significativamente ridotta, la fluorescenza verde è stata aumentata e il rosso/verde (R/G) è stato infine adottato per rappresentare l'alterazione del potenziale di membrana mitocondriale, che diminuirà quando il potenziale della membrana mitocondriale è compromesso. I nostri risultati hanno mostrato che dopo il trattamento con H/R, il potenziale della membrana mitocondriale delle cellule è diminuito, come indicato dall'aumento della fluorescenza verde. Con l'aumento delle dosi di quercetina, la fluorescenza rossa è stata costantemente migliorata, indicando che la quercetina può elevare in modo dose-dipendente il potenziale della membrana mitocondriale (Figura 3A, C). Inoltre, la citometria a flusso è stata impiegata per esaminare direttamente l'apoptosi cellulare. I risultati hanno mostrato che gli HBMEC hanno mostrato un tasso elevato di apoptosi dopo il trattamento con H/R, mentre la quercetina a 0.1-1 umol/L ha mostrato una chiara capacità di inibire l'apoptosi (Figura 3B, D).

Effetto della quercetina sull'adesione cellulare

Una volta danneggiate le cellule endoteliali, vengono prodotte alcune molecole di adesione, come ICAM{{0}} e VCAM-1, che adsorbono sostanze tossiche nel BBB e danneggiano il parenchima cerebrale (Hauptmann et al,2020 ). Per esaminare l'effetto della quercetina sulla capacità degli H/R-HBMEC di produrre molecole di adesione, sono stati misurati ICAM-1 e VCAM-1 mediante ELISA. Nel nostro studio, H/R ha comportato un aumento dei livelli di ICAM-1 e VCAM{7}}, ma l'aggiunta di quercetina a una concentrazione di 0.1-1 umol/L ha ridotto questo effetto (Figura 4).

La quercetina potrebbe inibire lo stress ossidativo

La quercetina è un flavonoide con una forte capacità antiossidante, quindi abbiamo utilizzato una sonda DCFH-DA per rilevare i ROS. Abbiamo osservato

aumento della generazione di ROS negli HBMEC esposti a H/R, che è stata notevolmente ridotta dal trattamento con quercetina alle concentrazioni di {{0}}.1-1 umol/L Nel frattempo, abbiamo rilevato le variazioni di livello dello stress ossidativo prodotti SOD e MDA con ELISA e i risultati hanno mostrato che la quercetina alla concentrazione di 0.1-1 μmol/L era in grado di ridurre SOD e MDA, che erano elevati da H/R, indicando così che la quercetina potrebbe ridurre il danno degli HBMEC da stress ossidativo (Figura 5).

La quercetina potrebbe regolare le proteine ​​Keap1/Nrf2 e ATF6/GRP78

Per esplorare ulteriormente il meccanismo protettivo della quercetina sugli HBMEC, abbiamo analizzato i livelli di espressione dilo stress ossidativoe proteine ​​legate allo stress del reticolo endoplasmatico. Keap1/Nrf2 è noto per regolare le risposte antiossidanti in vivo. Il danno da stress ossidativo costringe le cellule endoteliali a subire una risposta allo stress, con conseguente aumento dei livelli di Keapl/Nrf2 (Warpsinski et al, 2020). Nel presente studio, H/R ha determinato l'attivazione di meccanismi di risposta antiossidante cellulare e un aumento dei livelli di Keapl e Nrf2, che potrebbero essere ulteriormente rafforzati dalla quercetina a 0.5-1 umol/L per migliorare la capacità antiossidante degli HBMEC .ATF6/GRP78 è uno dei percorsi che regolano l'omeostasi del reticolo endoplasmatico (ER). Lo stress ER può aggravare il danno delle cellule endoteliali (Nie et al, 2020). Nel nostro studio, lo stress ER è stato attivato da H/R e i livelli di ATF6 e GRP78 sono stati aumentati. La quercetina a lumol/L è stata in grado di ridurre significativamente i livelli proteici di entrambi, inibire lo stress ER e proteggere gli HBMEC da lesioni H/R (Figura 6).

La quercetina potrebbe mantenere l'integrità della BBB

I BMEC sono la spina dorsale della struttura del BBB e la loro morte o apoptosi dopo la lesione H/R influisce sull'integrità e sulla funzionalità del BBB (Ding et al, 2019). In questo articolo, la funzione delle cellule endoteliali è stata riflessa dal rilevamento di cambiamenti nell'espressione delle proteine ​​associate a BBB ZO-1 e Claudin-5. Rispetto al gruppo di controllo, l'espressione di ZO-1 e Claudin-5 era

è diminuito nella lesione H/R, indicando che il BBB è stato danneggiato e questo danno potrebbe essere invertito dalla quercetina alle concentrazioni di 0.5-1 μmol/L, indicando che la quercetina può mantenere la funzione delle cellule endoteliali (Figura 7).

Analisi proteomica

Per trovare le proteine ​​di espressione differenziale (DEP) di HBMEC danneggiati da H/R in presenza di quercetina o meno, è stato utilizzato ITRAO per condurre l'analisi proteomica. Proteine ​​che esibiscono ap<0.05 and="" a="" ratio="" fold="" change="">1.2 o<0.83 were="" defined="" as="" deps.="" in="" our="" study,="" the="" differences="" in="" protein="" among="" the="" control,="" h/r,="" and="" quercetin="" groups="" were="" compared.="" the="" results="" showed="" that="" 172="" proteins="" were="" identified="" as="" deps="" between="" the="" control="" and="" h/r="" groups,="" among="" which="" 94="" were="" upregulated="" and="" 78="" were="" downregulated="" in="" the="" h/r="" group.="" there="" were="" 1,016="" proteins="" identified="" as="" deps="" between="" the="" h/r="" group="" and="" the="" quercetin="" group,="" of="" which="" 553="" were="" up-regulated="" and="" 463="" were="" down-regulated="" in="" the="" quercetin="" group,="" as="" shown="" in="" figure="" 8a.="" between="" control="" vs="" h/r="" and="" h/r="" vs="" quercetin="" group,56="" of="" the="" same="" deps="" were="" shared="" between="" the="" two="" groups.="" the="" expressions="" of="" these="" deps="" were="" analyzed="" by="" hierarchical="" clustering="" as="" shown="" in="" figure="" 8b.="" among="" these="" deps,="" the="" top="" 20="" were="" shown="" in="" table="" among="" these="" 20="" commons,="" insulin="" receptor-related="" protein="" (insrr),="" dual-specificity="" protein="" phosphatase="" 3="" (dusp3),="" annexin="" a2(anxa2),="" hemoglobin="" subunit="" alpha="" (hba1),="" phosphoglycerate="" kinase="" 1="" (pgk1),="" vitronectin="" (vtn),="" glucose-6-phosphate="" isomerase="" (gpi)="" are="" related="" to="" endothelial="">

DISCUSSIONE

Il CSVD, in quanto crescente onere medico e socioeconomico, ha rapidamente attirato l'attenzione. Ma sorprendentemente, la patogenesi del CSVD rimane al momento oscura, e nemmeno uno schema chiaro per il suo trattamento. Dato che le fasi successive della CSVD possono progredire verso esiti gravi come ictus e demenza, prendere di mira le lesioni precoci per il trattamento può ritardare efficacemente la progressione della CSVD (Cannistraro et al, 2019). È stato dimostrato che i primi cambiamenti patologici del CSVD risiedono nella disfunzione delle cellule endoteliali e i farmaci che stabilizzano la sua disfunzione possono migliorare la vulnerabilità della sostanza bianca cerebrale nelle lesioni del CSVD (Rajani et al, 2018). Dato il ruolo svolto dalle cellule endoteliali nel CSVD, abbiamo deciso di studiare gli effetti protettivi della medicina tradizionale cinese sulle cellule endoteliali utilizzando HBMEC.

La quercetina è un flavonoide presente in una varietà di piante (Nawrot-Hadzik et al, 2019). Ha una spiccata attività antiossidante e antinfiammatoria e può esercitare effetti protettivi in ​​diverse condizioni patologiche. In questo studio, abbiamo dimostrato che la quercetina può migliorare il danno H/R e diversi dati sperimentali confermano la nostra conclusione che la quercetina può promuovere la vitalità cellulare, la migrazione cellulare, l'angiogenesi, aumentare il potenziale della membrana mitocondriale e inibire l'apoptosi.

Considerando che la quercetina ha una forte attività antiossidante, abbiamo studiato il meccanismo con cui la quercetina protegge gli HBMEC in termini di antiossidante. I livelli di ROS possono essere significativamente aumentati dallo stress ossidativo (Wu et al.,2018) e l'accumulo di ROS può causare molte malattie, comprese malattie cardiovascolari, disfunzione endoteliale e malattie legate all'invecchiamento e malattie neurodegenerative (Chen et al, 2015; Jakaria et al., 2018; Santos et al., 2018). Inoltre, lo stress ossidativo si verifica nella perossidazione lipidica, producendo MDA, che distruggerà l'equilibrio ossidativo antiossidante del corpo e aumenterà il danno delle cellule endoteliali (Yang et al, 2021).

Keapl/Nrf2 è attualmente considerato il più importante percorso di stress auto-antiossidativo e l'attivazione di questo percorso può migliorare significativamente la disfunzione delle cellule endoteliali. In particolare, i ROS aiutano a promuovere l'attivazione della via di segnalazione Nrf2 (Selimoglu-Buet et al, 2017). Abbiamo dimostrato che la quercetina può ridurre la generazione di ROS e MDA, aumentando l'espressione della proteina Keapl e Nrf2, suggerendo che la quercetina può attenuare il danno delle cellule endoteliali diminuendo le risposte allo stress ossidativo attraverso l'attivazione della via di segnalazione Keapl/Nrf2.

Non solo, lo stress ER sostenuto attiva la risposta proteica spiegata e altera l'espressione dei geni antiossidanti, portando all'apoptosi delle cellule endoteliali (Tang et al, 2019). Inoltre, lo stress ossidativo può anche causare il disturbo del ripiegamento delle proteine ​​nel RE, provocare lo stress del RE e aggravare il danno delle cellule endoteliali (Hetz,2012). Lo stress ER può essere attivato da questi tre percorsi: chinasi ER simile a PKR (PERK), inositolo che richiede l'enzima 1 (IRE1) e ATF attivante-6, che proteggono le cellule dallo stress ER in condizioni omeostatiche (Hetz et al ,2020). Ma quando influenzati da stimoli avversi esterni, questi tre percorsi attiverebbero la risposta allo stress ER e indurrebbero l'apoptosi cellulare. Inoltre, gli studi hanno dimostrato che l'inibizione della risposta allo stress ER può invertire la disfunzione delle cellule endoteliali indotta da H/R (Chen et al, 2020). Nel nostro studio, la quercetina potrebbe ridurre l'elevato contenuto di ATF6/GRP78 causato da H/R, inibire la risposta allo stress del reticolo endoplasmatico e proteggere le cellule endoteliali.

Come componente principale del BBB, le funzioni delle cellule endoteliali includono il mantenimento della loro integrità. La disfunzione del BBB provoca la fuoriuscita di liquidi, proteine ​​e altri componenti del plasma nei tessuti perivascolari, compromettendo ulteriormente la vasodilatazione cerebrale e il trasporto dei nutrienti (Wardlaw et al, 2019). Quando le cellule endoteliali vengono danneggiate e l'integrità del BBB viene distrutta, la protezione delle cellule endoteliali può mantenere ulteriormente l'integrità del BBB. Claudin-5 è altamente espresso nei BMEC ed è coinvolto nella costituzione della spina dorsale delle catene di giunzioni strette per regolare Permeabilità BBB (Yang et al, 2020). Le cellule endoteliali sono ancorate al citoscheletro di actina da proteine ​​di ponteggio come ZO-1, rendendo le giunzioni strette tra le cellule endoteliali che mantengono la tenuta del BBB (Zhang et al,2020). Nel nostro studio, l'espressione di claudin-5 e ZO-1 è stata utilizzata per rappresentare l'integrità di BBB. I nostri risultati hanno mostrato che i livelli proteici di claudina-5 e ZO-1 erano diminuiti negli HBMEC soggetti a danno H/R, indicando che l'integrità del BBB è stata interrotta e la quercetina potrebbe ridurre questo danno aumentando la claudina{{ 9}} e livelli di proteine ​​ZO 1.

Inoltre, per trovare i potenziali bersagli della quercetina sugli HBMEC, i-TRAQ è stato etichettato nelle cellule. Dopo l'analisi proteomica, sono state studiate le prime 20 delle comuni proteine ​​differenzialmente espresse. Tra questi, INSRR, DUSP3,

ANXA2, HBA1, PGK1, VTN, GPI sono correlati alle cellule endoteliali. L'INSRR è considerato un marker endoteliale tumorale e la sua sovraespressione può promuovere l'angiogenesi (Nowak-Sliwinska et al, 2019). L'ANXA2 ricombinante può ridurre la permeabilità endoteliale in stati di danno ipossico e infiammatorio, indicando che l'ANXA2 può essere coinvolto nel mantenimento della tenuta delle cellule endoteliali (Li et al, 2019). Nella colorazione di sezioni cervicali umane, è stata trovata una forte espressione di DUSP3 nelle cellule endoteliali e gli esperimenti hanno anche dimostrato che DUSP3 è necessario per la crescita microvascolare indotta dal fattore di crescita dei fibroblasti di base (Amand et al. 2014). È stato dimostrato che l'espressione di HBAl nelle cellule endoteliali controlla il tono e la funzione vascolari (Sangwung et al.,2017). Si ritiene inoltre che PGK1 riduca l'aterogenesi (Zhang et al,2020). Inoltre, la VTN è considerata fondamentale per la formazione di trombi nel contesto di lesioni vascolari (Bowley et al, 2017). GPI è arricchito nelle cellule endoteliali microvascolari del tessuto sinoviale di pazienti con artrite reumatoide in ambiente ipossico e regola la secrezione del fattore di crescita endoteliale vascolare dai fibroblasti sinoviali dell'artrite reumatoide per indurre l'angiogenesi (Lu et al, 2017). Inoltre, lo studio di differenzialmente le proteine ​​espresse relative all'infertilità mediata dal varicocele hanno mostrato che Nrf2 era un regolatore a monte di ANXA2 (Panner Selvam et al, 2021). L'inibizione di PGK1 può attivare la via Keapl/Nrf2 e stimolare la risposta antiossidante protettiva delle cellule (Bollong et al, 2018). Le due proteine ​​​​potrebbero essere i potenziali bersagli della quercetina attraverso il percorso Keapl/Nrf2. Ulteriori studi possono verificare il ruolo di queste proteine ​​sull'effetto della quercetina sugli H/R-HBMEC.

È vero che la quercetina può esercitare effetti protettivi sulle cellule endoteliali. Ma gli obiettivi d'azione specifici richiedono ancora ulteriori indagini e non si sa se vi siano ulteriori percorsi d'azione.

In conclusione, questo studio ha dimostrato che la quercetina ha mantenuto l'integrità della barriera ematoencefalica proteggendo le cellule endoteliali. A livello molecolare, la quercetina può svolgere un ruolo nella protezione delle cellule endoteliali proteggendo dallo stress ossidativo attraverso la via Keapl/Nrf2 e inibendo lo stress del reticolo endoplasmatico attraverso la via ATF6/GRP78. Questo studio pone le basi per la MTC per il trattamento di CSVD proteggendo le cellule endoteliali.