Il ruolo del fosfato indipendente dalle proteine ​​nella progressione della malattia renale cronica

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Irene Faria Duayer¹ et al

Astratto:Diversi fattori contribuiscono alfunzione renaledeclino nei pazienti con insufficienza renale cronica e il ruolo del contenuto di fosfato nella dieta è ancora oggetto di dibattito. Questo studio si propone di analizzare il meccanismo attraverso il quale il fosfato, indipendente dalle proteine, è associato alla progressione dell'insufficienza renale cronica. Ratti AdultMunich-Wistar sono stati sottoposti a nefrectomia 5/6 (Nx), alimentati con una dieta a basso contenuto proteico e divisi in due gruppi. Solo le diete differenziate a contenuto di fosfato (basso contenuto di fosfato, LoP, 0,2 percento; alto contenuto di fosfato, HiP,0,95 percento). Dopo sessanta giorni, parametri biochimici erenel'istologia è stata analizzata. Il gruppo HiP presentava una funzione renale peggiore, con livelli più elevati di PTH, FGF-23 ed escrezione frazionata di fosfato. Nell'analisi istologica del tessuto renale, hanno anche mostrato una maggiore percentuale di fibrosi interstiziale, espressione di -actina, PCNA erenaleinfiltrazione da parte dei macrofagi. Il gruppo LoP ha presentato una maggiore espressione di beclin-1 nelle cellule dei tubuli renali, un marker di efflusso autofagico rispetto al gruppo HiP. I nostri risultati evidenziano l'azione del fosfato nell'induzione direneinfiammazione interstiziale e fibrosi, che contribuiscono alla progressione della malattia renale. Un possibile effetto del fosfato sulla disregolazione del meccanismo dell'autofagia delle cellule renali necessita di ulteriori indagini con studi clinici.

Parole chiave:fosfato;dieta; insufficienza renale cronicaprogressione;renalefibrosi; autofagia;apoptosi

Contributo chiave:I meccanismi di protezione renale, attraverso la restrizione della dieta a base di fosfati, devono ancora essere determinati. In questo studio, il sovraccarico di fosfato ha agito nella progressione dell'insufficienza renale cronica mediante l'attivazione di vie infiammatorie e l'induzione direnefibrosi interstiziale. L'effetto dell'iperfosfatemia sull'apoptosi delle cellule renali e sui compagni autofagici necessita di ulteriori indagini.

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1. Introduzione

Cronicorenepatologia (insufficienza renale cronica) è considerato un problema di salute pubblica. La sua prevalenza aumenta con l'età e varia tra l'11 e il 13% in tutto il mondo [1]. Sebbene l'insufficienza renale cronica sia generalmente una condizione irreversibile, diversi approcci possono essere utilizzati per rallentare la progressione della malattia, come il controllo della pressione sanguigna, la dislipidemia e l'iperglicemia, l'uso dell'inibitore dell'enzima di conversione dell'angiotensina e una dieta a basso contenuto proteico [2-7] . Tra queste strategie, una dieta a basso contenuto proteico è la proposta più discutibile per ritardarerenedeclino della funzione, a causa di preoccupazioni sulla sua conformità, sicurezza ed efficacia. Una mancanza di consenso sui benefici della riduzione delle proteine ​​nella dieta si basa sul ruolo sovrapponibile del contenuto di proteine ​​e fosfati nella dieta. Poiché le fonti proteiche sono ricche di fosfato, si raccomanda una riduzione dell'assunzione di proteine ​​per ottenere un apporto limitato di fosfati. È possibile limitare le proteine ​​senza limitare il fosfato, sebbene sia difficile il contrario.

In studi sperimentali, l'effetto di una dieta a basso contenuto proteico ha protetto i modelli di CKD dal danno glomerulare e dalla proteinuria [8], favorendo una maggiore conservazione della velocità di filtrazione glomerulare [9]. Va notato che le proteine ​​alimentari e il fosfato sono altamente correlati. Pertanto, sebbene alcuni studi sperimentali si siano concentrati sulla valutazione dell'effetto isolato della restrizione proteica, potrebbero anche essere stati distorti a causa della restrizione involontaria del fosfato. D'altra parte, è stato chiaramente dimostrato il contributo individuale di una dieta ricca di fosfati allo sviluppo della CKD [10,11]. È stato dimostrato che una dieta ricca di fosfati induce più interstizialerenefibrosi e atrofia tubulare, con glomerulosclerosi minima, nei ratti uremici. È interessante notare che il danno è stato attenuato dopo la restrizione del fosfato [12]. Da notare che il contenuto proteico nella dieta non è stato menzionato in questo studio.

Nello scenario clinico, una dieta a basso contenuto proteico ha ridotto la concentrazione di tossine uremiche e preservato la funzione renale residua, anche nel passaggio dalle cure conservative ai regimi dialitici incrementali [13].dieteticoproteinala restrizione ha anche ritardato la progressione della CKD in una recente meta-analisi [14]. Tuttavia, poiché la restrizione proteica era correlata a livelli sierici di fosfato più bassi, questo effetto benefico della dieta potrebbe essere stato in parte spiegato dalla restrizione di fosfato. Il più grande studio prospettico finora, l'MDRD [15], ha mostrato solo un piccolo beneficio di una dieta a basso contenuto proteico nei pazienti con insufficienza renale moderata, mentre la progressione della malattia renale non è stata influenzata nei pazienti con insufficienza renale grave. Tuttavia, il contenuto di fosfato nella dieta non è stato affrontato in questo studio e l'impatto del suo contributo individuale nel rallentamentoinsufficienza renale cronicala progressione rimane sconosciuta.

È noto che il fosfato può abbassare il Klotho renale e circolante [16], una proteina antietà coinvolta nella citoprotezione e antifibrosi, con effetti antiossidanti e antiapoptotici [17]. Inoltre, è già stata dimostrata un'autofagia difettosa nelle cellule renali dovuta alla carenza di Klotho [18]. L'autofagia è un processo catabolico con funzioni critiche nel mantenimento dell'omeostasi cellulare e nel preservare la vitalità cellulare in condizioni di stress. Alcune evidenze suggeriscono una relazione tra l'autofagia e la progressione dell'insufficienza renale cronica attraverso vie diverse, inclusa la segnalazione del TGF [19], un potente fattore fibrogenico per lo sviluppo della fibrosi renale. Il TGF- influenza diversi processi biologici, regolando la proliferazione e la differenziazione cellulare, l'apoptosi e agisce legandosi a specifici recettori transmembrana che inducono segnali intracellulari mediati dalle proteine ​​SMAD [20]. L'apoptosi è un meccanismo di morte cellulare programmata diverso dalla necrosi. Il fosfato è stato descritto come un mediatore dell'apoptosi in modelli sperimentali di cellule endoteliali [21], osteoblastiche [22] e mesoteliali peritoneali [23]. Vi sono prove della partecipazione della morte cellulare apoptotica alla progressione direnedanno [24], ma l'effetto del fosfato sull'apoptosi delle cellule renali non è stato ancora chiarito.

Poiché il meccanismo con cui una dieta ricca di fosfati accelera la progressione della CKD non è ancora completamente chiarito, abbiamo ipotizzato che potrebbe essere associato a un soggetto autofagico disfunzionale. Pertanto, nel presente studio, abbiamo valutato due gruppi di ratti Munich-Wistar in base al contenuto di fosfato nella loro dieta (basso 0,2 percento contro alto0,95 percento) e testato l'impatto di un dieta a basso contenuto di fosfati sulreni' alterazioni istologiche e immunoistochimiche, incluso un marker dell'autofagia, beclin-1.

2. Risultati

I parametri emodinamici, morfologici e biochimici ottenuti dai gruppi di dieta a basso (LoP) e ad alto contenuto di fosfati (HiP) sono riportati nella Tabella 1. Come previsto, la nefrectomia 5/6- ha indotto una riduzione della clearance della creatinina e un aumento nell'urea sierica e nella creatinina in entrambi i gruppi. Gli animali del gruppo HiP presentavano una funzione renale inferiore, come evidenziato da una creatinina più elevata e una clearance della creatinina inferiore; hanno anche mostrato un ematocrito inferiore e un peso finale inferiore. Il gruppo HiP ha presentato un aumento dell'escrezione sierica e frazionata di fosfato, nonché dell'ormone paratiroideo (PTH) e del fattore di crescita dei fibroblasti-23 (FGF-23). Da notare che la pressione caudale, il peso iniziale e l'escrezione urinaria di albumina erano simili tra i gruppi.

I risultati istologici sono mostrati nelle Figure 1–3. La glomerulosclerosi (GS) è stata riscontrata a malapena in entrambi i gruppi. Tuttavia, la percentuale di fibrosi interstiziale era significativamente più alta tra i ratti nel gruppo HiP. Di conseguenza, questi animali avevano anche una percentuale più alta di - area colorata con actina della muscolatura liscia e una maggiore infiltrazione renale da parte dei macrofagi, valutata dall'espressione ED-1, come mostrato nella Tabella 2. Espressione SMAD fosforilata (p-SMAD), un marker dell'attivazione della via TGF-beta, non era diverso tra i gruppi.

Le cellule positive all'antigene nucleare delle cellule proliferative (PCNA) erano predominanti nel gruppo HiP, suggerendo che il sovraccarico di fosfato promuoveva una proliferazione delle cellule renali più intensa. Al contrario, il numero di cellule apoptotiche tendeva ad essere più alto nel gruppo LoP. Allo stesso modo, le cellule beclin 1-positive erano significativamente più elevate nelle lesioni tubulointerstiziali nel gruppo LoP, il che indica un possibile effetto di fosfato più elevato nell'inibire il processo autofagico rigenerativo surenefazzoletto di carta.

3. Discussione

Questo studio sperimentale ha valutato se la restrizione alimentare del fosfato sia un passo efficace per rallentare la progressione dell'insufficienza renale cronica, indipendentemente dalla concomitante restrizione proteica nella dieta. Abbiamo esaminato l'effetto di diete con diversi contenuti di fosfato ({{0}}.2 vs.0,95 percento) in un modello animale 5/6-nefrectomia, con tutti gli animali che ricevevano una dieta a basso contenuto proteico (12 per cento). I nostri risultati hanno mostrato che una dieta ricca di fosfati era associata a iperfosfatemia, nonostante l'aumento di PTH, FGF-23 e, di conseguenza, dell'escrezione frazionata di fosfato. Inoltre, HiP ha causato una compromissione della funzione renale e un aumento della fibrosi interstiziale, che era associata a una maggiore espressione di actina, infiltrazione dei macrofagi e proliferazione cellulare, nonché un'inibizione dell'autofagia.

Una meta-analisi di 12 studi di coorte che hanno coinvolto 25.546 pazienti con insufficienza renale cronica non in dialisi ha dimostrato un'associazione indipendente tra i livelli sierici di fosfato,renefallimento e mortalità [25]. Inoltre, uno studio di coorte retrospettivo su 13.772 pazienti con dialisi ha rivelato un'associazione tra iperfosfatemia e altre anomalie dell'insufficienza renale cronica e del disturbo osseo con un declino più marcato del residuorenefunzione [26]. Il meccanismo con cui la restrizione del fosfato ritarda la progressione della CKD deve ancora essere stabilito. In uno studio sperimentale, abbiamo dimostrato che una dieta arricchita di fosfato era associata a una funzione renale più compromessa, rispetto a una dieta a basso contenuto di fosfati nei ratti Wistar sottoposti a paratiroidectomia e 5/6-nefrectomia, utilizzando una paratiroide fissa supplementazione di ormone (PTH) [11]. Kusano et al. [10] hanno mostrato che la protezione della funzione renale era associata a una dieta a basso contenuto di fosfati (0,3 percento), indipendentemente dal contenuto proteico nella dieta nei ratti uremici. I ratti con le normali diete a base di fosfato (0,5 per cento), tuttavia, presentavano questi benefici solo se alimentati con una dieta a bassissimo contenuto proteico (8,4 per cento). Presi insieme, questi risultati indicano che il ruolo del fosfato alimentare potrebbe essere più potente delle proteine ​​alimentari. Tuttavia, nessuno degli studi sopra menzionati ha cercato di indagare sui potenziali percorsi che potrebbero essere coinvolti nel danno renale correlato al fosfato.

L'azione del sovraccarico di fosfati nella progressione dell'insufficienza renale cronica è stata oggetto di numerosi studi. Etichette et al. inizialmente suggerì questa possibilità in un modello animale, ma la proteina dietetica [27] non era controllata, il che forse mascherava l'effetto isolato del fosfato. Un presunto beneficio di una restrizione indipendente dal fosfato, piuttosto che una restrizione proteica nello scenario di CKD, è di grande interesse perché il rischio di controllare il fosfato sierico insieme a una ridotta assunzione di proteine ​​può portare alla malnutrizione e causare una maggiore mortalità.

Il contenuto di fosfati nella dieta non determina necessariamente la concentrazione sierica di fosfato nei pazienti con insufficienza renale cronica [28], evidenziando l'importanza della restrizione della dieta indipendente dalla concentrazione sierica di questo elemento. Gli effetti patologici del fosfato sulle ossa e sul sistema cardiovascolare motivano gli interventi per il trattamento dell'iperfosfatemia. Nella pratica clinica, gli interventi per ridurre i livelli di fosfato consistono in restrizioni dietetiche e leganti del fosfato. Sebbene i benefici di questo approccio sugli endpoint clinici fossero discutibili in uno studio su piccolo campione [29], di fronte alla consapevolezza che l'eccesso di fosfato è responsabile della sovrapproduzione di PTH e FGF-23, è ragionevole mantenere livelli di fosfato più bassi possibile nei pazienti con insufficienza renale cronica [30].

Una dieta a basso contenuto proteico induce una bassa biodisponibilità del fosfato e diminuisce l'FGF sierico-23 [31,32], un mediatore del riassorbimento del fosfato sodio-dipendente sulle cellule tubulari renali. Ciò suggerisce che il meccanismo di regolazione del fosfato nell'insufficienza renale cronica avanzata può in qualche modo essere influenzato dall'assunzione di fosfato in modo del tutto indipendente dal contenuto proteico della dieta. Per questo motivo, abbiamo valutato l'effetto del contenuto di fosfati nella dieta sulla progressione dell'insufficienza renale cronica, in un modello 5/6-nefrectomia. Un precedente studio sperimentale ha già dimostrato che il fosfato può modificare la risposta antiproteinurica a una dieta a bassissimo contenuto proteico (0,3 g/kg), mostrando una correlazione tra i livelli sierici di fosfato e la fosfaturia con la risposta antiproteinurica a un dieta proteica limitata, indipendente dalla funzione renale [33]. In uno studio crossover che ha incluso 11 pazienti con insufficienza renale cronica (eGFR 30–55 ml/min/m2), il ritmo circadiano del fosfato sierico è stato alterato con una dieta ricca di fosfati, il che non è stato spiegato dall'escrezione urinaria di fosfato, PTH o FGF -23 [34]. Questo risultato rafforza l'importanza della restrizione della dieta a base di fosfati nei pazienti con insufficienza renale cronica come obiettivo terapeutico indipendente.

Lo stato emodinamico non sembra essere coinvolto nel peggioramento della funzione renale nel gruppo HiP, poiché la pressione arteriosa era simile in entrambi i gruppi. Inoltre, nel nostro modello non abbiamo riscontrato un danno glomerulare significativo, che potrebbe essere spiegato dalla restrizione proteica. Tuttavia, abbiamo notato più fibrosi interstiziale nel gruppo dieta HiP.

La fibrosi interstiziale è ben correlata con la perdita della funzione renale nell'uomo e nel ratto.

Uno studio precedente ha associato lo sviluppo di fibrosi renale indotta da una dieta ricca di fosfati tramite peptidil-prolil isomerasi Pin 1 [35], mentre altri articoli hanno evidenziato il ruolo dannoso della carenza di aKlotho surenefibrosi tissutale [36,37]. La delezione genetica di Klotho, in modelli sperimentali, provoca invecchiamento, ritardo della crescita e calcificazioni [38]. FGF23-La segnalazione di Klotho inibisce il riassorbimento renale del fosfato. Nell'impostazione CKD, l'espressione di Klotho è ridotta nei tubuli renali [39]. Inoltre, la dieta ricca di fosfato ha esacerbato la carenza di aKlotho in un modello di danno renale acuto da ischemia-riperfusione e ha ulteriormente promosso un aumentorenefibrosi tissutale, accelerando la progressione della CKD [18]. L'influenza della dieta a base di fosfato sull'espressione renale di Klotho è stata già dimostrata in modelli murini [40]. Forse, tra le altre vie, il sovraccarico di fosfato peggiora la funzione renale modulando l'espressione di Klotho sulle cellule tubulari; dovrebbe essere ulteriormente studiato in studi futuri.

Apoptosi e fibrosi sono mediate da citochine, come il TGF- [41,42]. Abbiamo descritto l'associazione di iperparatiroidismo secondario e conseguente maggiore espressione di TGF nel processo di rimodellamento cardiaco [43]. Presumibilmente, esiste un'associazione tra l'attivazione del PTH e la segnalazione del TGF che stimola la proliferazione dei fibroblasti, la sintesi del collagene e la fibrosi. Esistono anche prove sperimentali di un'azione integrata dei recettori TGF- e PTH sulle cellule ossee, regolando la segnalazione del rimodellamento osseo [44]. Il ruolo della segnalazione TGF-/Smad inrenela malattia è già stata descritta. Il TGF- si lega a un recettore transmembrana, innesca la fosforilazione delle proteine ​​Smads e ne promuove la traslocazione nel nucleo per effetti trascrizionali. Pertanto, sono essenziali per la trasduzione del segnale dei membri della famiglia TGF. In effetti, è già stata dimostrata la sovraespressione delle proteine ​​Smad2 e Smad3 nel rene fibrotico in modelli animali con CKD [45]. È interessante notare che ci sono prove dell'attivazione di Smad da parte di altri mediatori indipendenti dal TGF-, come i prodotti finali della glicazione avanzata [46] e l'angiotensina II [47]. Poiché l'effetto dell'iperfosfatemia sulla progressione dell'insufficienza renale cronica non è stato influenzato dalla sostituzione del PTH in un modello sperimentale [11], ci chiediamo se il fosfato avrebbe un ruolo diretto nella segnalazione renale di Smad. Nel nostro modello, non vi è stata alcuna influenza dell'iperfosfatemia sull'espressione di p-Smad nelle cellule tubulari renali.

Tuttavia, ciò non esclude la possibilità di attivazione del percorso del TGF indipendentemente dalla fosforilazione di Smad. Sono necessari ulteriori studi per studiare questo percorso alternativo.

Nella valutazione del tessuto osseo, il sovraccarico di fosfato ha indotto l'apoptosi delle cellule simil-osteoblastiche [22]. Rojas et al. dimostrato nelle biopsie ossee di pazienti trapiantati che il numero di cellule apoptotiche era maggiore in quelle con bassi livelli di fosfato e PTH avrebbe un effetto nell'aumentare gli osteoblasti e prevenire l'apoptosi [48]. Questo effetto inibitorio del PTH sull'apoptosi delle cellule ossee è stato dimostrato in precedenza [49]. Oltre agli effetti sul tessuto osseo, le vie apoptotiche sono anche legate all'insufficienza renale acuta [48] e potrebbero essere un possibile mediatore sulla progressione dell'insufficienza renale cronica. Nel nostro modello, abbiamo osservato una percentuale superiore di cellule in fase di apoptosi nel gruppo LoP, senza rilevanza statistica. Queste considerazioni suggeriscono un meccanismo di apoptosi alterato causato dall'iperfosfatemia. Tuttavia, dobbiamo tenere presente che non è stato possibile valutare l'effetto esclusivo del fosfato sureneapoptosi tissutale una volta che anche gli animali hanno sviluppato un aumento di PTH e FGF-23.

Nel presente studio, abbiamo affrontato un altro possibile meccanismo di insufficienza renale da una dieta ricca di fosfati, la disfunzione dell'autofagia, misurando la proteina beclin-1, una proteina regolatrice richiesta per la nucleazione della membrana autofagosomica [50]. L'autofagia è una via catabolica che coinvolge la degradazione dei componenti cellulari attraverso i lisosomi [51,52]. La fosforilazione di Beclin-1 è stata considerata come il segnale specifico dell'autofagia per l'attivazione del complesso fosfatidilinositolo-3-fosfato chinasi e il reclutamento nei siti della membrana di biogenesi dell'autofagosoma [53]. Il knockdown di beclin-1 sopprime l'autofagia [54] e l'ischemia-riperfusione ne aumenta i livelli [55]. La riduzione di beclin- 1 e la concomitante sovraregolazione di mTOR riducono la crescita delle cellule maligne, evidenziando l'effetto pro-sopravvivenza dell'autofagia [52].

Gli effetti antifibrotici di Klotho erano anche associati a un processo autofagico sovraregolato, un percorso attraverso il quale il danno ischemico era attenuato nel modello AKI e alterato da livelli elevati di fosfato [18]. Studi sperimentali hanno dimostrato che il flusso autofagico attenua l'infiltrazione dei macrofagi e la fibrosi renale indotta da fosfato. Inoltre, un ambiente ricco di fosfato induce la mitofagia nelle cellule tubulari in vitro [56]. I nostri dati hanno mostrato che il contenuto di fosfato nella dieta modulava anche l'espressione di beclin-1 nei tubuli renali in vivo. Una dieta HiP è stata anche associata a una maggiore proliferazione cellulare e una tendenza verso un tasso apoptotico inferiore, come illustrato rispettivamente dall'analisi PCNA e TUNEL. Tuttavia, nel nostro modello, non è stato possibile identificare se ciò si sia verificato come effetto diretto del sovraccarico di fosfato oa causa di anomalie nei livelli di PTH e FGF-23, indotte dall'iperfosfatemia. Questo risultato deve essere confermato in uno scenario clinico.

Un vantaggio chiave di questo studio è stato quello di valutare l'impatto della restrizione del fosfato in una dieta a basso contenuto proteico sulla progressione dell'insufficienza renale cronica, che includeva lo studio della sua influenza sui modelli istologici e sui fenotipi molecolari direnefazzoletto di carta. Per quanto ne sappiamo, questo è il primo studio a dimostrare la modulazione dell'espressione di beclin-1, un marcatore dell'autofagia sulle cellule tubulari renali, mediante la dieta con fosfato in vivo. Il limite principale era l'impossibilità di districare l'effetto dell'iperfosfatemia da altre anomalie correlate a CKD-MBD, come l'aumento di PTH e FGF-23. Non siamo stati inoltre in grado di valutare una dieta con contenuto di fosfato intermedio o espressione renale di Klotho. Tuttavia, il nostro modello riproduce la condizione della vita reale, in cui una dieta HiP è solitamente associata a iperparatiroidismo e livelli elevati di FGF-23.

4. Conclusioni

In sintesi, questo studio ha fornito prove del fatto che la dieta a base di fosfati svolge un ruolo nella progressione dell'insufficienza renale cronica, aumentando forse la fibrosi interstiziale. Inoltre, una dieta ricca di fosfati potrebbe modificare lareneprocesso di autofagia. L'identificazione di una via proteica-indipendente attraverso la quale il fosfato peggiora la funzione renale può aprire una strada importante per lo sviluppo di nuovi approcci volti a prevenire o ridurre la progressione dell'insufficienza renale cronica in ambito clinico.

5. Materiali e metodi

In questo studio sono stati inclusi ratti maschi adulti Munich-Wistar ottenuti da una struttura locale. I ratti sono stati mantenuti a 23 ± 1 ◦C, con un'umidità dell'aria al 60 ± 5 percento, con un ciclo luce-buio di 12:{6}}h. Tutti gli animali avevano libero accesso all'acqua del rubinetto e venivano nutriti con una dieta a basso contenuto proteico (12% di proteine). Gli animali sono stati sacrificati due mesi dopo quando sono stati analizzati sangue, urina e tessuto renale. La pressione della cuffia della coda, la clearance della creatinina e l'escrezione giornaliera di albumina urinaria sono state determinate in tutti i ratti. Il disegno sperimentale è mostrato nell'Appendice A (Figura A1).

5.1. Tecniche Analitiche

Sessanta giorni dopo Nx, gli animali sono stati anestetizzati con tiopentale di sodio (50 mg/kg di peso corporeo) e sono stati raccolti campioni di sangue. La concentrazione sierica di creatinina è stata valutata con un metodo colorimetrico. L'albumina sierica, il fosfato, l'urea, il calcio e l'ematocrito sono stati misurati con metodi standard. Il PTH è stato misurato mediante ELISA (Immutopics, San Clemente, CA, USA). L'FGF-23 è stato misurato utilizzando un kit ELISA (KAINOS, Giappone) secondo il protocollo del produttore. Abbiamo calcolato la filtrazione glomerulare per clearance della creatinina in base ai livelli di creatinina sierica e urinaria ed espressa in ml/min, calcolata con la formula: creatinina urinaria (mg/dl) × compagno urinario (mL/min)/creatinina sierica (mg/dl). L'albumina urinaria è stata determinata mediante immunodiffusione radiale.

-terzi di sinistrarenedalla chiusura di due o tre rami dell'arteria renale sinistra. I ratti operati con la simulazione sono stati sottoposti ad anestesia e manipolazione dei peduncoli renali senza riduzione della massa renale. Dopo essersi ripresi dall'anestesia, gli animali sono stati riportati nelle loro gabbie originali, che sono state riscaldate durante le 24 h successive.

L'escrezione frazionaria di fosfato (FEP) è stata ottenuta attraverso l'urina e il sierofosfato (mg/dL), l'urina e la creatinina sierica (mg/dL), ed espressa in percentuale, con la seguente formula: (urina/fosfato sierico)/ (urina/siero creatinina) × 100.

5.2. Gruppi sperimentali

Gli animali sono stati divisi in due gruppi in base al contenuto di fosfati nella dieta, come specificato di seguito: Dieta a basso contenuto di fosfati (LoP): n=20; gli animali hanno ricevuto TD-90016, dieta proteica al 12%, modificata per una concentrazione di fosfato del 0,2%. Dieta ad alto contenuto di fosfato (HiP): n=19; gli animali hanno ricevuto TD-90016, dieta proteica al 12%, modificata per una concentrazione di fosfato del 0,95%.

5.3. Tecniche istologiche

Il restoreneè stato perfuso in situ alla MAP osservata con soluzione salina e quindi con soluzione Duboscq-Brasil per la fissazione. Dopo essere state pesate, due fette renali midcoronali sono state postfissate in formaldeide tamponata al 4%. Il tessuto renale è stato quindi incorporato in paraffina e preparato per l'istomorfometria e l'immunoistochimica come descritto in precedenza [57].

Tutte le valutazioni morfometriche sono state eseguite in sezioni spesse 4-µm da un singolo osservatore in cieco rispetto ai gruppi. Per ogni ratto è stata stimata la gravità della glomerulosclerosi (GS), in sezioni colorate con acido periodico Schiff (PAS), assegnando a ciascun glomerulo (sono stati esaminati almeno 120 per ratto) un punteggio per stimare la frazione sclerosata dell'area del ciuffo e derivando un indice GS (GSI) per ciascun ratto come descritto in precedenza [58]. Per valutare il grado di espansione interstiziale, la percentuale di area corticale renale occupata da fibrosi interstiziale (percentuale IF) è stata stimata nelle sezioni colorate con Masson mediante una tecnica di conteggio dei punti [59].

5.4. Immunoistochimica

Quattro sezioni renali spesse µm, incluse in paraffina, sono state montate su vetrini rivestiti con il 6% di silano. Le sezioni sono state deparaffinate, reidratate e quindi riscaldate in tampone citrato per migliorare il recupero dell'antigene. Sono stati preincubati con il 5% di siero di coniglio normale (per ED-1) o di cavallo (per -actina) in soluzione salina tamponata con Tris (TBS) o una soluzione di blocco proteico a base di caseina (blocco proteico; DAKO Corporation, Santa Clara, CA, USA (per PCNA, pSmad e Beclin)), per prevenire il legame non specifico. L'incubazione con l'anticorpo primario è stata effettuata durante la notte a 4 ◦C. I controlli negativi sono stati eseguiti omettendo l'anticorpo primario.

Sono stati utilizzati i seguenti anticorpi primari: un anticorpo monoclonale murino anti-ratto ED-1 (Serotec, Oxford, Regno Unito), per il rilevamento dei macrofagi; topo monoclonale anti-alfa liscio (Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, USA), per il rilevamento dell'actina; anticorpo policlonale anti-Beclin 1 (Boster, Pleasanton, CA, USA), per l'analisi dell'autofagia. Dopo essere state lavate, le sezioni sono state incubate con IgG anti-topo biotinilato (H più L), (Vector, Burlingame, CA, USA) per 45 minuti, seguite da VECTASTAIN® ABC-AP Kit, Vector® Red (Vector, Burlingame, CA , USA) per 30 min. Le sezioni sono state quindi sviluppate con una soluzione di colorante rosso veloce.

Per l'antigene nucleare monoclonale murino anti-proliferante cellulare (Dako, Danimarca) e l'anticorpo fosforo-smad2 (Ser465/467) (Cell Signaling, Danvers, MA, USA), l'inibizione della perossidasi endogena è stata eseguita con una soluzione di perossido di idrogeno al 3% e metanolo per 30 min. Le sezioni sono state quindi incubate per una notte con l'anticorpo primario in una camera umidificata a 4 ◦C. Il giorno successivo le sezioni sono state incubate con IgG anti-topo biotinilato (H più L) o IgG anti-topo biotinilato (H più L) (Vector, Burlingame, CA, USA) per 45 minuti, seguiti da incubazione con VECTASTAIN® ABC- Kit HRP (Vector, Burlingame, CA, USA) per 30 min. Le sezioni sono state quindi sviluppate utilizzando un cromogeno substrato 3-ammino-9-etilcarbazolo (AEC) (Sigma Chemical, St. Louis, MO, USA). Tutte le sezioni sono state risciacquate in acqua distillata, controcolorata con soluzione di Hemalum di Mayer (Merck, Darmstadt, Germania) ricoperte con gelatina di glicerina di Kaiser (Merck, Darmstadt, Germania).

Per la stima della densità renale interstiziale di ED-1, p-Smad, Beclin e PCNA, il numero di cellule positive/mm2 è stato valutato in cieco con un ingrandimento di 400×. Per valutare la -actina abbiamo utilizzato una tecnica di conteggio dei punti, utilizzando un microscopio con un 100-oculare puntiforme collegato a un monitor video. Abbiamo analizzato 25 campi con un ingrandimento di 3200. I risultati sono stati espressi in percentuale considerando la superficie totale.

5.5. Apoptosi

L'apoptosi è stata determinata nelle cellule tubulari renali mediante la tecnica TUNEL (TdT mediated X-dUTP Nick end labelling) utilizzando le istruzioni fornite da Apoptag plusPeroxidase in Situ Apoptosis Detection Kit (S7101, Millipore Sigma, MA, USA). Le cellule apoptotiche sono state analizzate in 25 campi, con un ingrandimento di 1000×, per ottenere il valore finale espresso in cellule/mm2.

5.6. Analisi statistica

Le differenze tra i gruppi LoP e HiP sono state testate utilizzando un test di Student indipendente o un test di Mann-Whitney di conseguenza. Le relazioni tra le variabili sono state esaminate dal coefficiente di correlazione di Spearman. I dati sono presentati come media ± SE se non diversamente indicato. Un p-value di<0.05 was="" considered="" significant.="" analyses="" were="" performed="" using="" ibm="" spss="" statistics,="" version="" 20.0.1="" (ibm="" corp.,="" armonk,="" ny,="" usa)="" and="" graphpad="" prism9.1.2="" statistical="" software="" (graphpad,="" san="" diego,="" ca,="">

Finanziamento:Questo studio è stato sostenuto dalla Sáo Paulo Research Foundation (FAPESP—Grant #. 2010/05409-6). Moyses, Jorgetti, Zatz ed Elias sono supportati dal CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientifico e Tecnol6gico), ma questo supporto finanziario non ha avuto alcun ruolo nella stesura di questo articolo.

Dichiarazione del comitato di revisione istituzionale:Questo studio è stato condotto in conformità con le raccomandazioni del locale comitato di revisione etica. Il protocollo è stato approvato dal Comite detica em Pesquisa do Hospital das Clinicas da Faculdade de Medicina da USP (CEUA, processo n. 090/10 e data di approvazione 10 agosto 2010). Tutte le procedure sperimentali hanno seguito rigorosamente gli standard internazionali per la manipolazione e la cura degli animali da laboratorio.

Dichiarazione sulla disponibilità dei dati:I dati presentati in questo studio sono disponibili su richiesta dell'autore corrispondente.

Ringraziamenti:Gli autori ringraziano Wagner Dominguez per la sua esperta assistenza tecnica. Conflitti di interesse: Gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi.

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