La rapida e spontanea eliminazione postpartum del Plasmodium Falciparum è correlata all'espulsione della placenta

La parassitemia tra le donne in gravidanza con immunità protettiva alla malaria da Plasmodium falciparum è spesso dominata da eritrociti infetti VAR2CSA-positivi (IE). VAR2CSA media il sequestro di IE nella placenta. Abbiamo ipotizzato che la clearance postpartum spontanea della parassitemia precedentemente osservata in tali donne sia correlata all'espulsione della placenta, che rimuove il focus di sequestro degli IE VAR2CSA-positivi. Abbiamo valutato le parassitemie e la trascrizione genica prima e subito dopo il parto in 17 donne ghanesi. Il precipitoso declino della parassitemia postpartum è stato accompagnato da una riduzione selettiva della trascrizione del gene che codifica per VAR2CSA. I nostri risultati forniscono una spiegazione meccanicistica per l'osservazione precedente.

Parole chiave.

immunità acquisita; VAR2CSA; pfEMP1; malaria placentare; Plasmodium falciparum; gravidanza; geni var; immunità variante-specifica.

I residenti di aree con trasmissione stabile dei parassiti Plasmodium falciparum acquisiscono una sostanziale immunità protettiva alla malaria durante l'infanzia, esaminata in riferimento [1]. La proteina 1 della membrana eritrocitaria di P. falciparum (PfEMP1) è una famiglia di antigeni parassitari, codificati da circa 60 geni var per genoma e che mediano il sequestro di eritrociti infetti maturi (IE) per ospitare recettori vascolari, rivisti in riferimento [2]. Nonostante l'importanza di PfEMP1 nell'immunità protettiva acquisita, le donne in tali aree diventano comunque altamente suscettibili alla malaria durante la gravidanza. Ciò è stato correlato a infezioni con parassiti che esprimono PfEMP1 di tipo VAR2CSA, che porta all'accumulo di IE nello spazio intervilloso, causando la malaria placentare [2, 3].

VAR2CSA media l'adesione degli IE al condroitin solfato (CSA) a basso contenuto di solfato, un recettore dell'ospite che normalmente è limitato alla placenta [4]. Il sequestro specifico del recettore delle IE è un'importante strategia di sopravvivenza del parassita, in quanto previene la distruzione splenica delle IE mature [2]. Gli IE VAR2CSA-positivi sono quindi in un enorme svantaggio di sopravvivenza negli ospiti non gravidi e l'immunoglobulina G (IgG) VAR2CSA-specifica non viene acquisita prima della prima gravidanza [2, 3]. Questo spiega l'elevata suscettibilità delle donne in gravidanza (e in particolare dei primigravidi) alla malaria da P. falciparum, anche in aree con trasmissione parassitaria stabile, dove una sostanziale immunità protettiva viene acquisita ben prima di raggiungere l'età fertile [3]. Le infezioni da P. falciparum nelle donne in gravidanza sono infatti spesso dominate da parassiti che esprimono VAR2CSA [5], sebbene si trovino comunemente anche parassiti che esprimono altri tipi di PfEMP1 (e presumibilmente sequestrati al di fuori della placenta) [6]. Su questa base, proponiamo di definire 2 tipi fondamentalmente diversi di malaria nelle donne in gravidanza. Uno è la malaria placentare, che è causata da parassiti che esprimono VAR2CSA e che si verifica principalmente nelle donne con bassa parità senza una sostanziale immunità protettiva specifica per VAR2CSA. L'altro tipo è la malaria causata da parassiti che esprimono altri tipi di PfEMP1 e dove gli IE si sequestrano nei tessuti non placentari. Quest'ultimo tipo non è limitato alle donne in gravidanza e può verificarsi in donne di qualsiasi parità. Riflette semplicemente le lacune nell'immunità specifica della variante (principalmente PfEMP1) in generale [7].

Con questi punti in mente, abbiamo ipotizzato che precedenti segnalazioni di risoluzione spontanea della parassitemia da P. falciparum in donne in gravidanza in Africa entro pochi giorni dal parto [8, 9] riflettano l'improvvisa scomparsa del focus di sequestro di IE positivi per VAR2CSA come la placenta viene espulsa durante il parto.

METODI

Sito di studio e partecipanti

Lo studio è stato condotto presso 5 strutture sanitarie (Abura Dunkwa, Biriwa, Mankessim, Moree e Saltpond) nella regione centrale del Ghana. La trasmissione di P. falciparum nell'area di studio è stabile, ma con sostanziali variazioni stagionali.

Le donne in gravidanza a breve termine, che hanno acconsentito per iscritto a partecipare allo studio dopo aver ricevuto informazioni orali e scritte sui suoi obiettivi, sono state reclutate tra novembre 2020 e febbraio 2021. Le donne con qualsiasi forma di complicanze della gravidanza sono state escluse dalla partecipazione. Sebbene la maggior parte delle donne abbia ricevuto un trattamento preventivo intermittente come parte dell'attuale politica di assistenza prenatale in Ghana (tabella supplementare 1), nessuna di loro ha ricevuto alcuna forma di trattamento antimalarico per la durata dello studio (vale a dire, da poco prima del parto fino alla fine del la loro partecipazione pochi giorni dopo). Lo studio è stato approvato dal comitato di revisione istituzionale del Noguchi Memorial Institute for Medical Research (NMIMR-IRB CPN 005/20-21) e dal comitato etico di ricerca del Ghana Health Service (GHS-ERC 005/08/20).

Rilevazione e quantificazione dell'infezione da P. falciparum

L'infezione da parassiti di P. falciparum è stata determinata mediante test diagnostico rapido, mediante microscopia di strisci di sangue colorati con Giemsa e mediante reazione a catena della polimerasi quantitativa (qPCR) essenzialmente come precedentemente descritto [10, 11], utilizzando i campioni di sangue periferico raccolti. Il DNA estratto da diluizioni sei 10- volte di una coltura in vitro di P. falciparum IT4 ad anello all'1% di parassitemia è stato utilizzato per stabilire una curva standard per consentire la quantificazione qPCR della parassitemia.

Analisi della trascrizione del gene var

Parasite RNA was preserved in the field and used for quantification of var gene transcript levels essentially as described [11, 12], but using universal 1-step reverse transcription-qPCR (RT-qPCR) kits (E3005X, NEB Inc), a Quant Studio 5 thermal cycler system and fructose-bisphosphate aldolase as endogenous control. Data points were not considered if the cycle threshold (Ct) value for the endogenous control was >30 and/or if the Tm for the var gene amplicon for each pair of primers diverged >2 gradi dal valore atteso. L'abbondanza di trascrizione è stata calcolata utilizzando 2-ΔCt, dove media ΔCt=media coppia di primer Ctvar - controllo medio Ctendogeno.

Analisi statistica

Le associazioni tra la trascrizione di var2csa e le variabili cliniche sono state testate dalla correlazione di rango di Spearman con correzione per test multipli. La correlazione tra le parassitemie rilevate dalla microscopia e dalla PCR è stata valutata mediante il test di correlazione momento-prodotto di Pearson. I dati ottenuti in diversi punti temporali sono stati confrontati mediante analisi della varianza a misure ripetute (RM-ANOVA) o mediante RM-ANOVA sui ranghi (RM-ANOVA-R) a seconda dei casi, seguiti da test post hoc per differenze a coppie. Il software SigmaPlot versione 14 (Systat Inc) è stato utilizzato per analizzare i dati e i valori P<.05 were considered significant.

RISULTATI

Partecipanti allo studio

Un totale di 377 donne consenzienti sono state sottoposte a screening per l'infezione da P. falciparum durante il travaglio. Di questi, 15 (4,0 percento) erano positivi al parassita al microscopio dello striscio di sangue periferico prelevato dal dito, 24 (6,4 percento) al test diagnostico rapido e 50 (13,3 percento) alla PCR. Sulla base di questi risultati, 17 donne positive al test diagnostico rapido sono state arruolate e selezionate per il follow-up a 8-16 ore dopo il parto, 24-48 ore dopo il parto e 48-72 ore dopo il parto. Le informazioni cliniche dei partecipanti allo studio sono riassunte nella Tabella supplementare 1. Non sono state rilevate associazioni statisticamente significative tra la proporzione di parassiti che trascrivono var2csa e nessuna delle variabili cliniche elencate.

Eliminazione postpartum della parassitemia

Al momento del parto, tutti i partecipanti allo studio erano parassitari mediante striscio di sangue e/o qPCR (Tabella Supplementare 1). Da 8 a 16 ore dopo il parto, la parassitemia rilevabile al microscopio era diminuita spontaneamente (cioè senza intervento terapeutico) in 14/17 donne (Figura 1A). Entro 24-48 ore dopo il parto, le parassitemie erano diminuite ulteriormente ed erano molto basse o non rilevabili nella maggior parte delle donne (P=.03 rispetto al preparto, Friedman RM-ANOVA-R). Altre 24 ore dopo, tutte le donne tranne 1 erano senza parassitemia rilevabile (P=0,005 rispetto al preparto, RM-ANOVA-R). Per quanto riguarda le parassitemie rilevate dalla PCR (Figura 1B), le parassitemie postpartum erano significativamente inferiori di 24-48 ore e 48-72 ore rispetto al preparto (P <.001, RM-ANOVA-R). I livelli erano anche significativamente più bassi entro 48-72 ore dopo il parto rispetto a 8-16 ore dopo il parto (P <.001, RM-ANOVA-R). Le parassitemie stimate mediante microscopia e qPCR erano significativamente correlate (P <.001). Questi dati confermano precedenti segnalazioni di rapida e spontanea eliminazione postpartum della parassitemia da P. falciparum tra le donne che vivono in aree con trasmissione stabile di questo parassita [8, 9].

Trascrizione del parassita dei geni var

To identify the likely sequestration focus of the IEs detected, we measured parasite transcription of the PfEMP1-encoding var gene groups. Prior to delivery, var2csa, which encodes VAR2CSA-type PfEMP1 mediating placental IE sequestration [2, 3], was the primary transcript (up to >Il 90 percento della trascrizione var totale) in 9/17 donne e la trascrizione var2csa potrebbero essere rilevate in tutte (Figura 2 e Figura 1 supplementare). La trascrizione di geni var che non sono associati alla malaria placentare è stata quindi rilevata (oltre a var2csa) in tutte le partecipanti prima del parto e dominata in alcune donne, in accordo con precedenti osservazioni [6].

La percentuale di trascrizioni di var2csa è diminuita durante il follow-up postpartum in tutte le donne (Figura 2 e Figura 1 supplementare), parallelamente alla diminuzione delle parassitemie (Figura 1). C'è stato quindi un marcato spostamento dalla trascrizione di var2csa prima della consegna verso la trascrizione di altri geni var dopo il parto. Le uniche eccezioni (tra quelle donne in cui erano disponibili i dati di trascrizione postpartum) erano i partecipanti B213, S003, S001 e B201 (Figura supplementare 1). Tuttavia, sulla base dell'osservazione che anche le parassitemie postpartum sono diminuite notevolmente tra quelle donne (Figura 1), riteniamo probabile che si sarebbe verificato un corrispondente allontanamento dalla trascrizione di var2csa se fossero stati disponibili dati di punti temporali successivi. Nel complesso, i dati sono pienamente coerenti con una scomparsa selettiva di IE positivi per VAR2CSA come avevamo ipotizzato.

DISCUSSIONE

PfEMP1 è una famiglia di proteine ​​esportate dai parassiti intraeritrocitici di P. falciparum sulla superficie delle IE, dove funzionano come ligandi di adesione per diversi recettori vascolari dell'ospite [2]. Questi ligandi sono codificati dalla famiglia di geni var a variante clonale con circa 60 membri per genoma del parassita aploide. I geni vengono trascritti e tradotti in modo mutuamente esclusivo, assicurando che solo un singolo PfEMP1 sia espresso sulla superficie IE in un dato momento. Tuttavia, ogni parassita ha il potenziale per cambiare tra i suoi diversi geni var, consentendo cambiamenti nella specificità dell'adesione IE e nelle proprietà antigeniche [2].

Le proteine ​​PfEMP1 possono essere raggruppate e sottoraggruppate secondo una serie di criteri strutturali, che ne influenzano le caratteristiche funzionali [2]. Pertanto, il gruppo A PfEMP1 (codificato da circa una dozzina di geni var per genoma) media l'adesione di IE ai recettori dell'ospite come EPCR e ICAM -1 e sono stati implicati nella patogenesi della malaria infantile grave in generale e della malaria cerebrale in particolare [2]. Al contrario, la trascrizione dei geni appartenenti al gruppo B e C sembra essere associata a malaria non complicata e infezioni asintomatiche. Infine, la PfEMP1 di tipo VAR2CSA, codificata da uno o pochi geni var2csa per genoma del parassita, è funzionalmente e antigenicamente completamente distinta da tutte le altre PfEMP1 ed è fortemente implicata nella patogenesi, così come nell'immunità acquisita, della placenta malaria [2, 3, 13].

Inoltre, la maggior parte delle prove disponibili indica VAR2CSA come il principale e probabilmente unico ligando CSA in buona fede. Infine, è stato precedentemente dimostrato che la parassitemia periferica nelle donne in gravidanza con esposizione permanente a P. falciparum include, ed è spesso dominata da, IE che sono VAR2CSA-positivi e hanno il fenotipo caratteristico generale delle infezioni placentari da P. falciparum [5, 13– 15]. Su questa base, abbiamo ipotizzato che la spiegazione più convincente per l'eliminazione spontanea della parassitemia nelle donne in gravidanza entro pochi giorni dal parto [8, 9] sia la distruzione splenica selettiva di IE VAR2CSA-positivi a seguito dell'espulsione della placenta durante il parto, che rimuove efficacemente il loro recettore di adesione affine.

I risultati qui presentati confermano la rapida clearance postpartum precedentemente riportata [8, 9] della parassitemia periferica di P. falciparum (Figura 1). Inoltre supportano le osservazioni secondo cui la parassitemia periferica nelle donne incinte africane include, ed è spesso dominata da, parassiti che trascrivono var2- csa [6, 15] (Figura 2 e Figura 1 supplementare). Ancora più importante, tuttavia, i nostri dati estendono queste osservazioni precedenti fornendo prove convincenti per la prima volta per una spiegazione meccanicistica della rapida eliminazione postpartum dei parassiti periferici nelle donne con immunità acquisita naturalmente alla malaria da P. falciparum. A parte una differenza numericamente molto minore, e solo borderline significativa, nella trascrizione del gruppo var A1 (Figura 2 supplementare), l'unico cambiamento importante e statisticamente significativo nella trascrizione dei geni var dopo il parto è stata la ridotta trascrizione relativa di var2csa (Figura 2B e Supplemento Figura 2).

Il nostro studio ha dei limiti. La dimensione del campione è piccola. Ciò è dovuto principalmente al successo dell'implementazione del trattamento preventivo intermittente della malaria per le donne incinte, che ha reso la malaria placentare molto meno diffusa e ha reso necessario lo screening di molte donne per trovare partecipanti idonei. Inoltre, le strutture limitate presso il nostro sito di studio hanno impedito la valutazione diretta della specificità del recettore di adesione degli IE raccolti o del loro fenotipo immunologico. Tuttavia, le prove attuali e le scoperte precedenti si combinano perfettamente.

In conclusione, abbiamo presentato prove del fatto che l'improvvisa scomparsa del focus di sequestro di IE positivi per VAR2CSA quando la placenta viene espulsa contribuisce in modo significativo alla rapida e spontanea eliminazione postpartum della parassitemia da P. falciparum nelle donne con esposizione naturale a questi parassiti. I parassiti che trascrivono altri geni var e mostrano PfEMP1 non di tipo VAR2CSA sulla superficie IE spesso non sono in grado di prosperare e causare malattie negli adulti nelle aree endemiche, a causa dell'immunità protettiva specifica per PfEMP1- alla malaria acquisita durante l'infanzia [2] . La continua sopravvivenza degli IE non-VAR2CSA dopo il parto può essere ulteriormente compromessa da processi fisiologici associati al parto come le risposte immunitarie proinfiammatorie. Infine, l'assunzione non dichiarata di farmaci antimalarici immediatamente prima del parto potrebbe plausibilmente contribuire. Qualunque sia la ragione, la parassitemia è diminuita notevolmente dopo il parto in alcune donne, dove i parassiti che trascrivono var2csa costituivano solo una minoranza della parassitemia preparto, e questa scoperta merita ulteriori studi. Il nostro studio sostiene il ruolo chiave di PfEMP1 nell'immunità acquisita alla malaria in generale, e in particolare di VAR2CSA nella patogenesi e immunità della malaria placentare.

Dati supplementari

I materiali supplementari sono disponibili su The Journal of Infectious Diseases online. Costituiti da dati forniti dagli autori a beneficio del lettore, i materiali pubblicati non sono copiati e sono di esclusiva responsabilità degli autori, pertanto domande o commenti devono essere indirizzati all'autore corrispondente.

Appunti

Contributi d'autore.

NGA, MPQ, MFO e LH hanno contribuito all'ideazione e alla progettazione dello studio. NGA ha eseguito la raccolta dei campioni. NGA, MPQ e LH hanno eseguito l'analisi dei dati. NGA, MPQ e LH hanno preparato il manoscritto. Tutti gli autori hanno letto e approvato la versione finale del manoscritto.

Ringraziamenti.

Siamo grati a tutte le donne che hanno accettato di partecipare al nostro studio. Ringraziamo anche tutte le ostetriche, i medici, gli assistenti medici e gli infermieri delle diverse strutture sanitarie per il loro aiuto nella raccolta dei campioni.

Disconoscimento.

I finanziatori non hanno avuto alcun ruolo nella progettazione dello studio, nella raccolta e nell'analisi dei dati, nella decisione di pubblicare o nella preparazione del manoscritto. Il finanziamento per pagare le spese di pubblicazione ad accesso aperto per questo articolo è stato fornito da Danida.

Sostegno finanziario.

Questo lavoro è stato sostenuto da Danida (numero di borsa 17-02-KU al progetto MAVARECA-II), inclusa una borsa di dottorato per NGA L'Agenzia esecutiva per la ricerca della Commissione europea ha sostenuto MPQ (numero di borsa 101028915, Marie Skłodowska-Curie Individual Fellowship 2020 , progetto PAMSEQ).

Potenziali conflitti di interesse.

Tutti gli autori: nessun conflitto di interessi segnalato. Tutti gli autori hanno presentato il modulo ICMJE per la divulgazione di potenziali conflitti di interesse. I conflitti che gli editori considerano rilevanti per il contenuto del manoscritto sono stati divulgati.

Riferimenti