La relazione tra struttura e funzione APOL1: implicazioni cliniche

Astratto 

Varianti comuni nel gene APOL1 sono associate a un aumentato rischio di malattia renale non diabetica in individui di origine africana. I meccanismi con cui le varianti APOL1 mediano la patogenesi della malattia renale non sono ben compresi. I cambiamenti degli aminoacidi derivanti dalle varianti APOL1 associate alla malattia renale alterano la struttura tridimensionale e le dinamiche conformazionali del dominio a-elicoidale C-terminale della proteina, che può razionalizzare le conseguenze funzionali. La comprensione della struttura tridimensionale della proteina, con e senza le varianti di rischio, può fornire informazioni sulla patogenesi delle malattie renali mediate dalle varianti APOL1.

introduzione

Studi basati sulla popolazione hanno stabilito una forte associazione di due varianti nel gene APOL1 con l'eccesso di rischio di CKD non diabetico in individui di origine africana (1-5). Una variante prevede la sostituzione di due aminoacidi (S342G e I384M; denominati G1), mentre l'altra comporta la delezione di due aminoacidi consecutivi (N388 e Y389; denominati G2) rispetto all'allele ancestrale non di rischio denominato G0 . Le varianti APOL1 G1 e G2 sono comuni negli individui con origini africane, con almeno il 50% di individui portatori di una copia dell'allele di rischio e il 15% con due copie dell'allele di rischio (1,3). Nonostante la forte associazione delle varianti APOL1 con la malattia renale, i meccanismi molecolari con cui queste varianti APOL1 contribuiscono alla patogenesi e alla progressione della CKD rimangono poco chiari. In questa recensione, discutiamo gli studi che hanno caratterizzato le proprietà strutturali di APOL1 e l'effetto delle varianti APOL1-G1 e -G2 sulla struttura.

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Biologia dell'APOL1

APOL1 è un membro del cluster genico APOL a sei membri situato nel cromosoma umano 22 (6–8). APOL1 ha caratteristiche uniche rispetto ad altre proteine ​​della famiglia APOL. APOL1 è stato inizialmente identificato nel pancreas umano ma è ampiamente espresso, con l'espressione più abbondante nella placenta, nei polmoni, nella prostata e nella milza (9). A differenza degli altri membri della famiglia APOL, il gene APOL1 è limitato agli esseri umani e ad alcuni primati non umani (7,8). Inoltre, sebbene l'APOL1 sia sintetizzato prevalentemente nel fegato, viene secreto e circola nel sangue in complesso con le particelle HDL (9,10). È noto che l'APOL1-G0 circolante funziona come un fattore immunitario innato conferendo protezione dal Trypanosoma brucei brucei, un parassita che causa la malattia del sonno endemica in Africa (11,12). Tuttavia, altre specie di tripanosomi si sono evolute con una glicoproteina di superficie variante troncata chiamata proteina SRA (Serum Resistance-Associated), che neutralizza l'effetto tripanolitico dell'APOL1-G0 (12,13). Nel rene umano sano, APOL1 è sintetizzato ed espresso nei podociti e nelle cellule endoteliali vascolari glomerulari ed extraglomerulari (14-17). L'espressione di APOL1 nei podociti umani in coltura e nelle linee cellulari endoteliali è bassa, ma l'espressione è sovraregolata da stimoli immunitari, come le citochine (15,18). La funzione intracellulare di APOL1 resta da comprendere appieno, ma sono state proposte molteplici funzioni, tra cui un ruolo nella regolazione dell'autofagia, nel traffico di vescicole intracellulari, nell'attività dei canali ionici e nel fornire un effetto protettivo dall'infezione da HIV (14,19– 23).

Varianti APOL1 e rischio di malattie renali

Il rischio di malattia renale associata alle varianti APOL1 varia in base al fenotipo CKD e si adatta meglio a un modello recessivo (1-3). Un singolo allele di APOL1 G1 o G2 mostra attività tripanolitica contro ulteriori sottospecie di tripanosomi, come T. brucei rhodesiense, fornendo un vantaggio di sopravvivenza (1). A livello proteico, le varianti APOL1-G1 e -G2 non sono riuscite a legare la proteina tripanosomiale SRA, spiegando in parte l'estesa attività tripanolitica e perché le varianti sono selezionate positivamente nelle aree in cui la tripanosomiasi è endemica (1,24). Tuttavia, quando sono presenti due copie di queste varianti (alleli omozigoti), vi è una maggiore predisposizione al rischio di malattia renale oltre all'estesa attività tripanolitica. Questo scenario ricorda l'emoglobina S (HbS) e l'anemia falciforme, in cui un singolo allele di HbS risulta in un tratto falciforme che è parzialmente protettivo contro la malaria, mentre due alleli di HbS provocano anemia falciforme clinicamente evidente (25,26 ). I livelli circolanti di APOL1 non si associavano al rischio di CKD (27,28). Quindi, si ipotizza che l'omeostasi cellulare disregolata sia causata dalla variante APOL1, che è sintetizzata ed espressa nel podocita stesso. L'effetto di rischio dipende dal fenotipo della malattia renale con il rischio più elevato di sviluppare nefropatia associata all'HIV (odds ratio: 29, 95% CI: da 13 a 68), seguito da FSGS (odds ratio: 17, 95% CI: da 11 a 26 ) e malattia renale associata all'ipertensione (odds ratio: 7, IC 95%: da 5,6 a 9,5) (1-3). Anche altri fenotipi della CKD, tra cui la glomerulopatia collassante correlata al LES e la nefropatia correlata all'anemia falciforme, sono stati associati alla presenza di genotipi APOL1 ad alto rischio (29,30). Con circa il 15% degli americani di origine africana portatori di due copie di varianti APOL1 ad alto rischio, circa 5 milioni di individui sono a rischio di sviluppare CKD. Tuttavia, la CKD clinicamente evidente si sviluppa in una proporzione inferiore, suggerendo che, oltre allo sfondo delle varianti omozigoti APOL1 ad alto rischio, è necessario un "secondo colpo" per manifestare la CKD.

Meccanismi dell'APOL1-malattia renale mediata

Negli ultimi dieci anni, numerosi studi hanno migliorato la nostra comprensione della malattia renale mediata dalla variante APOL1. Questi studi hanno stabilito una localizzazione subcellulare variabile delle proteine ​​​​APOL1 e dimostrato l'attivazione di cascate di segnalazione cellulare spazialmente diverse che interrompono l'omeostasi cellulare. La citotossicità, che deriva da una maggiore attività del canale cationico, alterato traffico vescicolare intracellulare, induzione di percorsi di protein chinasi attivati ​​dallo stress, stress del reticolo endoplasmatico e ridotta frequenza respiratoria mitocondriale, è stata proposta come meccanismo per APOL1-G1– e patogenesi della CKD indotta da -G2 (14,20,21,31-36). Manca ancora un meccanismo unificato che spieghi l'effetto disregolato di APOL1-G1 e -G2, che porta alla patogenesi e alla progressione della CKD.

Correlazione struttura-funzione delle varianti APOL1: perché è importante?

Comprendere la struttura tridimensionale delle proteine ​​e gli effetti delle variazioni genetiche sulla loro struttura può fornire indizi preziosi per svelare la patogenesi della malattia e identificare potenziali strategie terapeutiche. Anche un singolo cambiamento di amminoacido causato da variazioni genetiche può modificare la struttura di una proteina, con conseguenze funzionali devastanti. Ciò è ben illustrato negli studi strutturali volti a comprendere la biologia dell'emoglobina e l'effetto funzionale della variazione di HbS sulla struttura dell'emoglobina. La struttura dell'emoglobina ha rivelato le proprietà allosteriche della proteina riguardo al legame con l'ossigeno, con conseguente formazione di ossiemoglobina (37,38). Studi strutturali sull'HbS hanno rivelato che una singola variazione dell'amminoacido dal glutammato alla valina nella catena b dell'emoglobina determina la polimerizzazione della deossiHbS, che, a sua volta, è la causa della falce dei globuli rossi (39). Questi studi basati sulla struttura hanno guidato con successo lo sviluppo di strategie terapeutiche volte a invertire la polimerizzazione anormale dell'emoglobina per trattare l'anemia falciforme (40-42). Come altro esempio, una caratterizzazione completa della struttura dell'acquaporina ha fatto avanzare la comprensione della funzione e lo sviluppo di molecole che possono modulare la sua funzione nei tubuli renali (43).

La struttura di APOL1 non è stata finora risolta sperimentalmente. La spettroscopia di risonanza magnetica nucleare (NMR), la cristallografia a raggi X e la microscopia crioelettronica (crio-EM) sono i principali metodi consolidati per determinare sperimentalmente la struttura tridimensionale delle proteine. I vantaggi di ciascuno di questi metodi variano con le proprietà intrinseche della proteina studiata. Ad esempio, sebbene la struttura e la dinamica delle proteine ​​possano essere studiate in soluzione utilizzando la spettroscopia NMR, non è un metodo adatto allo studio di strutture proteiche di grandi dimensioni. La cristallografia a raggi X e la crio-EM, d'altra parte, sono adatte per studiare grandi complessi biomolecolari, ma non forniscono informazioni su interazioni di legame più deboli o dinamiche proteiche. La nostra attuale comprensione della struttura di APOL1-G0 e dell'effetto delle varianti G1 e G2 sulla struttura e sulla dinamica delle proteine ​​è stata ottenuta da modellazione computazionale, simulazioni di dinamica molecolare (MD) e studi biofisici su APOL1 ricombinante. La modellazione computazionale utilizza tre metodi principali per prevedere la struttura di una proteina. Il primo e più efficace è il modello comparativo o di omologia, in cui la struttura tridimensionale di una proteina evolutivamente correlata viene utilizzata come modello per generare un modello strutturale per la proteina di interesse (44,45). Il secondo metodo di modellazione si basa sull'osservazione che le proteine ​​provenienti da diversi background evolutivi possono avere strutture simili. Quindi, in assenza di una proteina modello strettamente correlata, la previsione della struttura può essere ottenuta modellando ("threading") la sequenza della proteina bersaglio in molte possibili strutture proteiche conosciute: le strutture che sono più compatibili con le sequenze proteiche filettate sono considerate ulteriormente ( 46). Il terzo, e meno accurato, metodo è la modellazione ab initio, in cui la struttura proteica è prevista sulla base di proprietà fisiche (stime energetiche derivate dalla sequenza proteica utilizzata per prevedere strutture secondarie, giri, ecc.) senza utilizzare un modello e, quindi, questo quest'ultimo metodo è computazionalmente esaustivo (47,48). Il modello strutturale previsto da questi metodi potrebbe non riflettere accuratamente la conformazione fisiologica della proteina, che può variare in base alla posizione e alla funzione cellulare specifica. Per far progredire la comprensione di una struttura proteica, è possibile applicare simulazioni MD per perfezionare ulteriormente i modelli di struttura proteica ottenuti da questi metodi. La simulazione MD è un metodo computazionale per studiare il comportamento conformazionale dipendente dal tempo delle biomolecole utilizzando la fisica dei movimenti degli atomi a una certa temperatura (14,49-51). La proteina APOL1 è divisa in quattro domini e la nomenclatura è stata stabilita nel contesto della sua funzione nota come fattore di uccisione tripanosomico (11-13,52,53). I domini includono una regione peptidica di segnale (M1-R26), un dominio di formazione dei pori (M60-W235), un dominio di indirizzamento della membrana (A238-P304) e un terminale C dominio di interazione con la proteina SRA tripanosomica (A339-L398). Le varianti APOL1 G1 e G2 si trovano nel dominio di interazione SRA C-terminale e la maggior parte degli studi si è concentrata sulla definizione della struttura di questa regione (Figura 1). Poiché la struttura di qualsiasi proteina simile ad APOL1 non è stata finora risolta sperimentalmente, i modelli strutturali proposti hanno utilizzato metodi di threading e modellazione ab initio in combinazione con simulazioni MD (12,14,54).

Un modello iniziale dell'APOL1 C-terminus è stato pubblicato ben prima che fosse scoperta la sua associazione con la malattia renale. È stato dimostrato che il dominio C-terminale che interagisce con SRA di APOL1-G0 (P340-L398) forma un'a-elica anfipatica che interagisce con la proteina SRA nel compartimento endosomiale di tripanosomi (12). Il modello strutturale per questa interazione ha fornito approfondimenti sulla neutralizzazione dell'attività di APOL1 da parte delle sottospecie di tripanosoma che causano la malattia umana. Il modello strutturale ha suggerito mutazioni che sono state poi ingegnerizzate per convalidare la presunta interfaccia di legame nella proteina SRA. Allo stesso modo, le varianti APOL1-G1 e -G2 associate a malattie renali naturali provocano una formazione complessa instabile e, quindi, l'estesa attività tripanolitica della variante APOL1 (1,12,24). Sharma et al. (54) hanno avanzato gli studi strutturali a una porzione estesa (P{{2{0}}L398) del C-terminale di APOL1-G0, -G1 e -G2 utilizzando la modellazione computazionale. I loro studi hanno mostrato che il C-terminale di APOL1 formava una struttura a forcina elicoidale. In questo modello, la sostituzione e la delezione dell'amminoacido, corrispondenti alle varianti G1 e G2, hanno provocato la perdita dei legami idrogeno interelicoidali, che si sono poi manifestati come una maggiore mobilità conformazionale della forcina a-elicoidale (Figura 2). Coerentemente con queste osservazioni, gli spettri NMR bidimensionali di G1 variavano considerevolmente da quelli di G0. I nostri studi hanno modellato un frammento più grande dell'APOL1 C-terminus (R305-L398) utilizzando algoritmi di threading seguiti da simulazioni MD di tutti gli atomi (14). Analogamente agli altri modelli, il C-terminale di APOL1 formava un fascio a-elicoidale con cambiamenti di aminoacidi indotti dalle varianti G1 e G2, con conseguente ridotta flessibilità conformazionale della proteina variante. Sebbene il modello iniziale di riferimento e la variante APOL1 C-termini proposti dai due ultimi studi siano simili, le simulazioni MD hanno mostrato un diverso comportamento conformazionale dipendente dal tempo. Esistono molteplici spiegazioni per queste apparenti differenze, incluso il frammento proteico più lungo (residui 305-398) - che ha aggiunto a-elica - e un Fifield di forza più attuale (metodo computazionale per stimare l'energia tra gli atomi) utilizzato nei nostri studi (14). Recentemente, Jha et al. (55) hanno modellato la struttura a lunghezza intera delle proteine ​​APOL1 utilizzando metodi ab initio seguiti da simulazioni MD. Oltre a confermare la conformazione elicoidale C-terminale adottata da APOL1, il modello ha mostrato il ruolo dei residui varianti (S342 e I384 in G1 e Y389 in G2) nello stabilire la funzione del canale di APOL1. Nel complesso, i cambiamenti conformazionali proteici indotti dalle varianti G1 e G2 potrebbero interrompere l'interazione proteina-proteina necessaria per la funzione omeostatica cellulare di APOL1 che predispone alla patogenesi della CKD.

APOL1 è una proteina associata alla membrana con diversi presunti domini transmembrana (21,56-58) che si localizza in più ambienti di membrana cellulare, inclusi endolisosomi, reticolo endoplasmatico del Golgi, mitocondri e membrane plasmatiche (14,20, 23,31,32,34–36,55,58–61). In questo ambiente di membrana, le proteine ​​​​APOL1 a lunghezza intera, in particolare le varianti G1 e G2, formavano grandi oligomeri di peso molecolare, come determinato dalla PAGE nativa non riducente. Tali oligomeri possono mediare le cascate cellulari, portando a citotossicità (36). Studi recenti che caratterizzano la funzione del canale di APOL1 hanno suggerito che l'a-elica C-terminale di APOL1 (D337- E355) media il gating del pH e l'inserzione della membrana (57,58). Questo gruppo ha proposto un modello in cui l'inserimento nella membrana di APOL1 espone il C-terminale della proteina al lume dell'organello quando APOL1 è localizzato negli endo-/lisosomi (nella via secretoria) e al lato extracellulare quando la proteina è localizzata a la membrana plasmatica. Sebbene plausibile, una tale topologia di membrana non consentirà interazioni proteina-proteina del C-terminale di APOL1 con proteine ​​effettrici e domini proteici localizzati nel citoplasma (14). Le prove attuali suggeriscono che APOL1-G1 e -G2 espressi dai reni sono i mediatori chiave della patogenesi della malattia renale (27,28). Inoltre, APOL1 si localizza in compartimenti subcellulari diversi dagli endolisosomi e dalla membrana plasmatica (34,36,6{{9{0}},62). L'orientamento delle proteine ​​sulle membrane è dinamico e può variare nei diversi organelli a causa dei cambiamenti nella composizione lipidica delle membrane degli organelli (63,64). Quindi, si è tentati di ipotizzare che APOL1 si inserisca nelle membrane e che il C-terminale di APOL1 sia esposto al citoplasma, dove può partecipare alle interazioni a spirale con le proteine ​​facilitatrici. Ulteriori studi incentrati sulla caratterizzazione della struttura APOL1 saranno fondamentali per comprendere la topologia dei domini APOL1 dopo l'inserimento della membrana. Per scoprire i partner proteici interagenti di APOL1, abbiamo cercato proteine ​​​​con somiglianza strutturale con la proteina SRA tripanosomiale, che è l'interazione proteica nota dell'APOL1 C-terminale. Ciò ha portato all'identificazione della famiglia di proteine ​​SNARE come potenziali partner di interazione di APOL1. Le proteine ​​della famiglia SNARE sono proteine ​​di membrana integrali che costituiscono il macchinario molecolare che media la fusione di membrana tra i compartimenti cellulari e si localizzano prevalentemente nel compartimento endolisosomiale. La fusione della membrana mediata da SNARE e il traffico intracellulare contribuiscono alle funzioni biologiche, come l'autofagia, il rilascio di neurotrasmettitori e l'endocitosi virale (65,66). Il nostro e altri studi hanno dimostrato che APOL1-G0 interagiva con la proteina SNARE, la proteina di membrana 8 associata alla vescicola (VAMP8), mentre la presenza delle varianti G1 e G2 attenuava questa interazione (14,2{ {110}}). VAMP8 è noto per essere una proteina SNARE localizzata prevalentemente endosoma-lisosoma che è coinvolta nelle funzioni cellulari, inclusa la regolazione del traffico di vescicole mediando la maturazione di endosomi e autofagosomi. Gli eventi di fusione della membrana di VAMP8 e di altre proteine ​​SNARE sono mediati dall'interazione a spirale con i partner proteici affini tramite il dominio SNARE. Questo dominio ha una struttura ad elica, molto simile al dominio al C-terminale di APOL1. Presi insieme, questi studi suggeriscono che i cambiamenti conformazionali proteici associati alla malattia renale, mediati dalla variante, potrebbero ostacolare la capacità della variante APOL1 di attivare le reti proteiche di risposta allo stress dei podociti, portando allo sviluppo e alla progressione della malattia renale cronica. È ancora dibattuto se la patogenesi della malattia renale causata da APOL1-G1 e -G2 sia secondaria alla perdita di funzione in presenza di un secondo colpo, allo stress dei podociti o a un guadagno di funzione. L'APOL1-G0 sembra essere superfluo per lo sviluppo renale e l'omeostasi e una funzione fisiologica, fatta eccezione per la sua attività tripanolitica, non è stata evidente (67,68). L'APOL1-G0 nei modelli di coltura cellulare ha dimostrato di fornire un'immunità innata contro le infezioni virali come l'HIV (22), una funzione che viene persa dalle varianti associate alla malattia renale in un modello murino di nefropatia associata all'HIV (69 ). Pertanto, è possibile che i processi cellulari protettivi correlati ad APOL1-G0 vengano "attivati" in risposta a un secondo stress esterno, il che spiega perché non tutti gli individui con due copie di APOL1-G1 e /o le varianti -G2 sviluppano una malattia renale. Tuttavia, APOL1-G1 e -G2 sembrano modificare la localizzazione cellulare e il modello di oligomerizzazione (36) con citotossicità associata, che non è stata salvata da APOL1-G0 (70) negli studi in vitro, suggerendo un guadagno di funzione dominante potrebbe anche mediareMRCpatogenesi.

Prove recenti hanno mostrato l'importanza critica del background aplotipico naturale di tutti i genotipi APOL1 durante la conduzione di questi studi e hanno anche suggerito che i polimorfismi genetici situati lontano dai siti G1 e G2 influenzano la funzione della proteina (71). Ognuno di questi può influenzare il meccanismo di piegatura di APOL1, se non la piega stessa. Ciò sottolinea l'importanza di comprendere la struttura completa di APOL1 oltre alla struttura del dominio individuale.

Direzioni future

Saranno necessari ulteriori studi per caratterizzare la funzione cellulare di APOL{{0}}G0 e le vie omeostatiche interrotte innescate dalle varianti G1 e G2, che provocano malattie renali. Uno degli obiettivi principali sarà quello di tradurre queste informazioni nello sviluppo di strategie terapeutiche che modificheranno il decorso della CKD associata ad APOL1-. Comprendere la struttura proteica tridimensionale di APOL1 fornirà informazioni chiave che ci aiuteranno a risolvere questo enigma. Tuttavia, le proprietà cellulari di APOL1 pongono diverse sfide nella conduzione di questi studi strutturali. L'oligomerizzazione di APOL1 in forme ad alto peso molecolare è un grosso ostacolo per l'utilizzo di studi strutturali basati su NMR per risolvere la struttura proteica a lunghezza intera perché le sue grandi dimensioni aumentano la sovrapposizione spettrale e le misurazioni della larghezza della linea risultanti da un gran numero di segnali e lenti caduta delle proteine, rispettivamente. Tuttavia, la spettroscopia NMR rimane uno strumento prezioso per studiare le proprietà strutturali dei singoli domini proteici e sondare il comportamento dipendente dal tempo (comportamento di dinamica proteica interna) del riferimento e della variante APOL1. Le proprietà interagenti con la membrana, le modifiche post-traduzionali e la citotossicità pongono limitazioni per l'espressione e la purificazione della proteina APOL1 ripiegata in modo nativo, necessaria per gli studi strutturali, tra cui la cristallografia a raggi X e la crio-EM. Sebbene esistano queste sfide, gli sforzi per definire la struttura delle proteine ​​​​APOL1 utilizzando più metodologie faranno progredire la nostra comprensione della malattia renale mediata dalla variante APOL1 e aiuteranno nello sviluppo di bersagli farmacologici.

Divulgazioni

Tutti gli autori non hanno nulla da rivelare.

Finanziamento

Nessuno.

Contributi dell'autore

M. Buck ha fornito la supervisione; M. Buck e SM Madhavan hanno rivisto e curato il manoscritto; e SM Madhavan hanno concettualizzato lo studio e scritto la bozza originale.

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Ricevuto: 27 aprile 2020, Accettato: 4 novembre 2020

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