Il ruolo dei test genetici nel flusso di lavoro diagnostico dei pazienti pediatrici con malattie renali: l’esperienza di una singola istituzione

AstrattoScopoLe malattie renali ereditarie sono tra le principali cause di insufficienza renale nei bambini, con conseguente aumento della mortalità, elevati costi sanitari e necessità di trapianto di organi. Le tecnologie di sequenziamento di nuova generazione possono aiutare nella diagnosi di rare condizioni monogeniche, consentendo una gestione medica e scelte terapeutiche ottimizzate.

Metodi Il sequenziamento clinico dell'esoma (CES) è stato eseguito su una coorte di 191 pazienti pediatrici provenienti da un singolo istituto, seguito dal sequenziamento Sanger per confermare le varianti identificate e per studi sulla segregazione familiare. Risultati Tutti i pazienti avevano una diagnosi clinica di malattia renale: le principali categorie di malattia erano malattie glomerulari (32,5%), ciliopatie (20,4%), CAKUT (17,8%), nefrolitiasi (11,5%) e malattia tubulare (10,5%). Il 7,3% dei pazienti presentava altre condizioni. Un test genetico conclusivo, basato sulla validazione CES e Sanger, è stato ottenuto nel 37,1% dei pazienti. Il tasso di rilevamento più elevato è stato ottenuto per le ciliopatie (74,4%), seguite dalla nefrolitiasi (45,5%) e dalle malattie tubulari (45%), mentre la maggior parte delle malattie glomerulari e la CAKUT sono rimaste non diagnosticate. Conclusioni I risultati indicano che i test genetici utilizzati in modo coerente nel flusso di lavoro diagnostico dei bambini con malattia renale cronica possono (i) confermare la diagnosi clinica, (ii) fornire una diagnosi precoce in caso di condizioni ereditarie, (iii) e la causa genetica di patologie precedentemente non riconosciute malattie e (iv) programmi di trapianto personalizzati.

Parole chiave Sequenziamento clinico dell'esoma, Sequenziamento di nuova generazione,Malattie renali, Test genetici, Coorte pediatrica

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introduzione

Le nefropatie pediatriche comprendono entità patologiche molto diverse in termini di presentazione clinica, evoluzione e opzioni terapeutiche [1–4]. Circa il 30% dei bambini con malattia renale cronica (CKD) soffre di una condizione monogenica, una percentuale che aumenta se si considerano i bambini con malattia renale allo stadio terminale (ESRD) [5, 6]. Molti di questi bambini non vengono diagnosticati al momento del trapianto [4, 6, 7]. Raggiungere una diagnosi per questi pazienti non solo implica la fine di un’odissea diagnostica, ma presenta numerosi vantaggi per la prognosi, la gestione e il trattamento

Studi pionieristici hanno costantemente dimostrato che l’implementazione di tecniche di sequenziamento di nuova generazione (NGS) ha migliorato significativamente la resa diagnostica nei pazienti con malattie renali ereditarie (IKD) [8]. Più recentemente, l’uso diffuso dell’NGS ha reso disponibile la diagnosi genetica in tempi ragionevoli e a costi accessibili, sollevando la questione se e quando debba essere integrata nel flusso di lavoro diagnostico di routine [5].

La diagnosi genetica nei bambini è della massima importanza sotto diversi aspetti. Il primo è che può essere rilevante nell’approccio clinico alla malattia, l’esempio tipico è quello delle sindromi nefrosiche in cui l’identificazione di varianti strutturali nei geni correlati ai podociti depone contro le terapie immunosoppressive che altrimenti verrebbero utilizzate di routine per un periodo di diversi mesi [9]. La seconda è che potrebbe essere molto rilevante per la famiglia del bambino e per l'identificazione di altri membri portatori della variante potenzialmente trasmissibile alle generazioni future. Una volta identificata una variante patogena in un probando, i test a cascata sui membri della famiglia e la consulenza genetica nei portatori della variante rappresentano una pratica standard nella genetica clinica [5]. Il terzo è che conoscere la variante patogenetica è fondamentale nel contesto del trapianto dove il donatore può essere un parente. Infatti, è fondamentale escludere la presenza della stessa variante nel donatore di organi, così come è fondamentale identificare tutti i membri della famiglia potenzialmente bisognosi di un trapianto. Il quarto è che alcune malattie presentano un alto rischio di recidiva dopo il trapianto d’organo, come la glomerulosclerosi focale segmentale [10] oppure il loro esito può essere migliorato da una scelta più mirata del trapianto da eseguire, come nel caso del trapianto primario iperossaluria in cui un trapianto combinato di rene e fegato può portare a un risultato migliore [11]. Infine, avere una diagnosi chiara della malattia può essere utile affinché il paziente possa prendere parte a studi clinici e beneficiare di nuove opzioni terapeutiche [12, 13].

Alla fine del 2018, in una collaborazione tra nefrologi pediatrici e genetisti, abbiamo iniziato a eseguire test genetici per condizioni monogeniche che potenzialmente portano all’ESRD e quindi al trapianto. Il nostro ospedale è il più grande del Nord Ovest italiano, interessando un territorio di circa 5 milioni di abitanti. Abbiamo selezionato un tipo di analisi "one size fits all", con il sequenziamento dell'esoma clinico, ovvero circa 6700 geni associati a condizioni monogeniche, concentrando l'analisi su pannelli genetici adattati al sospetto clinico e quindi limitando risultati incidentali e riducendo il tempo per l'analisi della sequenza.

Nel complesso, applicando questa pipeline, abbiamo ottenuto una resa diagnostica in linea con i dati pubblicati, con una certa eterogeneità tra i diversi sospetti clinici, come previsto. I risultati ottenuti confermano l’importanza di includere i test genetici di routine e la consulenza nel flusso di lavoro diagnostico dei pazienti pediatrici affetti da nefropatie. In effetti, l’identificazione delle varianti causali è fondamentale per la loro gestione clinica e potenzialmente per la selezione ottimale dei donatori vivi.

Materiali e metodi

Reclutamento dei pazienti

Lo studio si è basato su una coorte diagnostica di 191 pazienti pediatrici consecutivi (età al reclutamento < 18 anni), reclutati dall'Unità Pediatrica di Nefrologia, Dialisi e Trapianti dell'Ospedale Pediatrico Regina Margherita e riferiti al Servizio di Immunogenetica e Biologia dei Trapianti per analisi genetica. Tutti i pazienti inclusi nello studio hanno fornito, quando possibile, un consenso informato scritto firmato da entrambi i genitori.

Preparazione dei campioni, sequenziamento e analisi bioinformatiche

L'estrazione dell'acido nucleico dal sangue periferico, l'analisi della qualità del DNA, la preparazione delle librerie e il sequenziamento sono stati eseguiti come precedentemente riportato [14]. I dati grezzi ottenuti dal sequenziamento sono stati convertiti in file FASTQ e quindi allineati con Enrichment 3.1.0 o con gli strumenti DRAGEN Enrichment (Illumina) e mappati sul manifest TruSight One Expanded v2.0 utilizzando il genoma di Homo Sapiens UCSC GRCh37 come un riferimento per ottenere varianti a singolo nucleotide, varianti del numero di copie (CNV) e varianti strutturali dei file. Per l'identificazione del numero di copie, è stata utilizzata una linea di base composta da dati di sequenziamento di 5 pazienti diversi, tutti negativi per CNV (come da dati comparativi di ibridazione genomica dell'array). Questo approccio consente di rilevare la CNV anche nei cromosomi sessuali poiché il gruppo di riferimento era composto sia da individui di sesso femminile che maschile e il sesso del soggetto da analizzare è stato sempre specificato durante la fase di allineamento. L'identificazione delle varianti e la definizione delle priorità sono state effettuate seguendo criteri definiti. L'allineamento delle letture e la copertura degli esoni del gene di interesse sono stati controllati e visualizzati da Integrative Genomics Viewer IGV, disponibile gratuitamente presso l'UC San Diego, Università della California e il Broad Institute del MIT e l'Università di Harvard, Boston (https://software.broadinstitute. org/software/igv/). Le varianti da includere nel rapporto genetico finale sono state classificate secondo i criteri dell'American College of Medical Genetics and Genomics (ACMG).

Generazione di un elenco di malattie genetiche in silico

I geni da considerare per l'identificazione delle varianti e la definizione delle priorità sono stati definiti sulla base dei sospetti clinici. Sono stati generati elenchi di geni in silico corrispondenti (i) a dati provenienti da diversi database, che correlano genotipo a fenotipo (OMIM, PanelApp England, ClinGen, Malacards) e (ii) a dati provenienti dalla letteratura. Gli elenchi dei geni disponibili vengono aggiornati una volta all'anno sulla base di nuove prove di associazione gene-malattia.

Sequenziamento di Sanger e amplificazione della sonda dipendente dalla legatura multiplex (MLPA)

Sono state eseguite analisi di sequenziamento Sanger e/o MLPA per convalidare le varianti identificate da NGS e per studi sulla segregazione familiare. In breve, il DNA è stato estratto a partire da una seconda aliquota indipendente del sangue periferico del probando e dai genitori. Le regioni del DNA di interesse sono state amplificate mediante PCR utilizzando specifiche condizioni sperimentali. La purezza e la specificità delle regioni amplificate sono state controllate mediante gel di agarosio 0,8 o 1,5%. I prodotti della PCR amplificati sono stati quindi sequenziati da Sanger utilizzando gli stessi primer. Per le varianti PKD1, la validazione è stata eseguita utilizzando una PCR a lungo raggio seguita da una PCR annidata per evitare qualsiasi inferenza dagli pseudogeni.

Risultati

Definizione dei criteri per la restituzione dei risultati delle analisi genetiche

We previously reported on the design and set-up of a "kidney" gene panel that comprises>400 geni tutti coinvolti in diverse forme di malattie renali [14]. Per questo studio, abbiamo implementato l'analisi con sottopannelli focalizzati sulla specifica categoria clinica di sospetto (ad esempio, CAKUT, glomerulopatia, tubulopatia, ecc.) e abbiamo dato priorità a un gruppo specifico di geni per l'analisi. Questo approccio ha limitato il numero di geni analizzati, semplificando le analisi e riducendo il numero di risultati accidentali. Solo quando, al termine del campo analitico con relativo/i panel/i, il risultato genetico era negativo e (i) il fenotipo clinico non chiaramente indicato o (ii) si sovrapponevano diverse categorie di malattie, l'analisi genetica veniva estesa alle cosiddette "lista completa dei reni o renalema", un super-pannello comprendente tutti i geni inclusi nei sottopannelli.

Come primo passo, abbiamo definito una serie di criteri per l’interpretazione dei risultati NGS. Dopo aver eseguito il sequenziamento clinico dell'esoma (CES) e l'allineamento dei dati, è stata determinata una pipeline di analisi per filtrare le varianti rilevanti. Nello specifico, sulla base del sospetto clinico, le varianti identificate sono state filtrate sulla base di liste di geni in silico, specifici per le diverse macrocategorie di malattie. Sono state escluse le varianti sinonime che non influiscono sul meccanismo di splicing o le varianti introniche che non mappano all'interno della regione di splicing, tenendo in considerazione solo le varianti non sinonime, senza senso, frameshift e che influenzano lo splicing. Sono state incluse dieci varianti rare (frequenza inferiore all'1% nella popolazione) e varianti con una frequenza allelica nel paziente di almeno 0.2 e una copertura di almeno 20 letture. Le restanti varianti sono state annotate e ulteriormente curate in base a (i) modalità di ereditarietà, (ii) conservazione dei nucleotidi, (iii) impatto sulle proteine, sfruttando diversi database per verificare i punteggi e (iv) letteratura, se presente. A questo punto le varianti filtrate sono state elencate in una cosiddetta "relazione tecnica". Il rapporto tecnico è stato interpretato da un genetista medico per produrre il rapporto genetico finale per il paziente e la sua famiglia. Durante la consulenza genetica, sono stati proposti studi di segregazione familiare per (i) confermare le varianti nel probando e (ii) includere/escludere varianti non causative in base alla loro segregazione nella famiglia (Fig. 1).

Adottando questi criteri abbiamo potuto definire tre diverse categorie di referti genetici. Innanzitutto, un "rapporto conclusivo" che includeva varianti patogene (C5) e probabilmente patogene (C4). Segnalazioni di varianti di significato sconosciuto (C3) sono state considerate conclusive solo se pienamente compatibili con il quadro clinico e se studi sulla segregazione familiare ne hanno confermato il possibile ruolo. In secondo luogo, un "rapporto incerto" che includeva varianti C3 identificate dal CES che non sono ancora o non potevano essere convalidate nel contesto di studi sulla segregazione familiare o varianti C4/C5 che non erano completamente in linea con il fenotipo clinico. In terzo luogo, un "rapporto inconcludente" che includeva (i) un'analisi CES negativa, il che significa che nessuna variante è stata identificata da NGS; (ii) singole varianti nei geni recessivi; e (iii) varianti C3 non in linea con il fenotipo clinico, identificate quando l'analisi è stata estesa a tuttigeni correlati alle malattie renali(Fig. 1).

Principali caratteristiche della coorte reclutata

Questo studio descrive una coorte di 191 pazienti pediatrici (0-18 anni di età) che sono stati consecutivamente indirizzati dall'Unità di Nefrologia Pediatrica per analisi genetiche da novembre 2018 a maggio 2022, con una media di 50 nuovi pazienti arruolati ogni anno . I criteri per i test genetici erano (i) nefropatia associata ad un'anamnesi familiare positiva per malattia renale o (ii) sospetto clinico di una condizione monogenica o (iii) necessità di escludere una condizione monogenica (come nel caso delle sindromi nefrotiche, dove distinguere malattie monogeniche rispetto a malattie non monogeniche è clinicamente significativo per la prognosi e il trattamento).

La coorte è stata divisa sulla base del sospetto clinico, considerando 6 diverse macrocategorie di malattie: anomalie congenite del rene e delle vie urinarie (CAKUT; n=34), ciliopatie (n=39), glomerulopatie (n=62), nefrolitiasi (n=22), tauopatie (n=20) e altre malattie che includevano anche fenotipi sindromici (n=14). Fatta eccezione per CAKUT e tubulopatie che hanno mostrato un'equa distribuzione tra femmine e maschi, in tutte le altre categorie si è riscontrata una prevalenza di soggetti di sesso maschile (Fig. 2a). Osservando l'età di reclutamento, non è stata evidenziata una distribuzione significativamente diversa tra i diversi gruppi, con un'età media compresa tra 6,7 ​​e 10 anni rispettivamente nelle “Altre malattie” e nelle glomerulopatie. Tuttavia, se si considera l’età media, le malattie CAKUT hanno mostrato il valore più basso (4,6 anni), in linea con un fenotipo congenito. Dal punto di vista etnico, indipendentemente dalla macrocategoria di malattia considerata, la maggior parte dei pazienti erano europei, seguiti da africani, con solo pochi pazienti asiatici, latino-americani o meticci (Fig. 2b). Nella coorte, solo 8 pazienti avevano genitori consanguinei.

Fig. 1 Pipeline di analisi dei dati genetici e criteri per l'inclusione delle varianti. Rappresentazione schematica della pipeline analitica adottata per l'identificazione e la definizione delle priorità delle varianti, inclusi tutti i criteri di filtraggio e filtraggio. Le varianti risultanti sono state incluse nel rapporto genetico finale. Quando possibile, sono stati eseguiti studi di validazione delle varianti e di segregazione familiare. Le segnalazioni genetiche sono state classificate come conclusive, incerte o inconcludenti in base ai criteri indicati. Sulla base di questa classificazione è stato calcolato il tasso diagnostico del nostro flusso di lavoro di sequenziamento di nuova generazione (NGS). 1 KG: database di 1000 genomi; Alt fr: frequenza alterata; C3: variante di significato sconosciuto; C4: probabile variante patogena; C5: variante patogena; AR: autosomico recessivo

Infine, prendendo in considerazione l'anamnesi familiare per malattie renali considerando separatamente soggetti maschi e femmine, era evidente l'eterogeneità nella distribuzione tra casi positivi e negativi considerando le diverse categorie di malattie. Nel complesso, la maggior parte della coorte reclutata e indipendentemente dal sesso non era caratterizzata da una storia familiare positiva, come dimostrato per CAKUT, glomerulopatie, tauopatie e altri disturbi renali. Tuttavia, nelle ciliopatie e nefrolitiasi, una quota significativa di casi presentava un'anamnesi familiare positiva con una diversa distribuzione tra femmine e maschi (13 casi su 22 per le ciliopatie e 5 su 12 per la nefrolitiasi; Fig. 2c).

Dal punto di vista clinico, la coorte era piuttosto eterogenea con diverse malattie primarie incluse (Fig. 2d). Tra questi, i sospetti clinici più ricorrenti erano la malattia del rene policistico (n=27), la CAKUT (n=25), la sindrome nefrosica (n=19), la glomerulosclerosi focale segmentale (FSGS; n =14) e sindrome di Alport (n=13; Fig. 2d).

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