Il ruolo dei macrofagi renali, dell'AIM e dell'espressione del TGF-b1 nella progressione della fibrosi renale nei pazienti con IgAN

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Obbiettivo: analizzare l'espressione di macrofagi, AlM e TGF- 1 nel rene di pazienti affetti da lgAN ed esplorare il ruolo di macrofagi, AlM e TGF- 1 nella progressione della fibrosi renale nei pazienti affetti da lgAN .

Metodi: I campioni di paraffina di tessuto renale di 40 pazienti con lgAN sono stati selezionati come gruppo di osservazione. Allo stesso tempo, come gruppo di controllo normale sono stati selezionati campioni di paraffina di tessuto renale normale da 11 pazienti trattati con nefrectomia. Abbiamo osservato la distribuzione dei macrofagi e l'espressione di AlM e TGF- 1 mediante colorazione immunoistochimica e/o immunofluorescenza.

Risultato: Il numero di macrofagi MO, M1 e M2 potrebbe aumentare nei pazienti con lgAN. I macrofagi M0 sono principalmente polarizzati verso i macrofagi M2. L'espressione di AlM e TGF- 1 era significativamente più alta nei pazienti con lgAN rispetto a NC. Il macrofago M2, l'AlM e il TGF- 1 erano correlati positivamente con la creatinina sierica e la proteinuria dell'24-ora, ma erano correlati negativamente con l'eGFR. I macrofagi M2, AlM e TGF- 1 erano correlati positivamente con l'area fibrotica.

Conclusione: I macrofagi M2, AlM e TGF- 1 svolgono ruoli importanti nel processo di fibrosi lgAN e i tre si influenzano a vicenda.

Parole chiave: IgAN, fibrosi renale, macrofagi, AlM, TGF- 1

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INTRODUZIONE

La nefropatia da IgA (IgAN) è una glomerulonefrite immunitaria sistemica comune, caratterizzata dalla deposizione di immunocomplessi a base di IgA o IgA nella regione mesangiale con proliferazione cellulare mesangiale ed espansione della matrice mesangiale (1,2). Sebbene l'IgAN progredisca lentamente, fino al 50% dei pazienti si sviluppa fino allo stadio terminale ed è il tipo principale che causa ESRD(3).Fibrosi renaleè il percorso comune nella progressione dimalattia renale cronica(MRC)(4). Negli ultimi anni, è stato riscontrato che i macrofagi, l'inibitore dell'apoptosi dei macrofagi (AIM) e il fattore di crescita trasformante- 1(TGF- 1) svolgono tutti ruoli importanti nella fibrosi renale.

I macrofagi sono coinvolti nello sviluppo di molte malattie renali. Alcuni studiosi ritengono che la deposizione di macrofagi nel rene possa essere utilizzata come un importante indicatore per giudicare lo sviluppo e la prognosi delle malattie renali. I macrofagi sono divisi in tipi M0, M1 e M2(5). I macrofagi ml promuovono la risposta infiammatoria di tipo e rimuovono i batteri o le cellule tumorali secernendo fattori infiammatori come IL-1, IL{5}}, IL-12, TNF-, specie reattive dell'ossigeno (ROS), e NO. Tuttavia, se l'infiammazione persiste, si diffonderà ulteriormente e alla fine porterà alla fibrosi tissutale (6). Esprimendo l'arginasi 1 (Argl), la proteina 3 simile alla chitinasi (Yml) e il fattore mitogenico indotto dall'ipossia (HIMF) per resistere alla stimolazione di microrganismi patogeni e allergeni, i macrofagi M2 limitano la risposta infiammatoria e l'adattamento di tipo Iimmunità, eliminare i residui, promuovere l'angiogenesi, svolgere un ruolo antinfiammatorio, ridurre l'apoptosi cellulare, promuovere la proliferazione cellulare e promuovere la riparazione dei tessuti(7,8). Esattamente, quale tipo di macrofago svolge un ruolo importante nella fibrosi renale di IgAN è ancora controverso . Gli studi hanno dimostrato che CD68 e CD80 possono essere utilizzati come marcatori di superficie specifici dei macrofagi MO e M1(9); CD163 è un recettore del mannosio altamente specifico espresso nei macrofagi M2, che non è espresso nei macrofagi M1. Pertanto CD68, CD80 e CD163 possono essere utilizzati come marcatori per rappresentare la presenza di diversi tipi di macrofagi(10-12).

Inoltre, l'AIM è stata originariamente scoperta come proteina secreta dai macrofagi e quindi è stata chiamata Spa(13). Successivamente è stato chiamato AIM dopo che è stato trovato il suo effetto antiapoptotico sui globuli bianchi (14), o CD5L secondo la nomenclatura dell'organizzazione del genoma umano. L'AIM ha una vasta gamma di funzioni e svolge un ruolo importante nella regolazione dell'equilibrio della migrazione dei leucociti, del metabolismo einfiammatoriorisposta. Molti tipi di letteratura hanno menzionato che l'AIM svolge un ruolo nella risposta immuno-infiammatoria(15), nell'omeostasi lipidica,malattia del fegato(16), malattie autoimmuni, aterosclerosi(17) e altre malattie. Negli ultimi anni sono stati condotti numerosi studi sul ruolo dell'AIM nelle malattie renali. Ad esempio, Tadashi Uramat et al. (18) trovato nel modello murino iperteso incline che riducendo l'espressione di AIM e oxLDL (lipoproteina a bassa densità ossidata, che ha l'effetto di sovraregolare l'espressione di AIM) può ridurre efficacemente la fibrosi del tessuto renale. Allo stesso modo, Megumi Oshima et al. (19) hanno scoperto che l'area di AIM e la deposizione di macrofagi nel tessuto renale era positivamente correlata alla gravità della proteinuria e alla diminuzione dell'eGFR nei pazienti con insufficienza renale cronica. Tutti gli studi di cui sopra suggeriscono che l'AIM svolge anche un ruolo importante nel processo di fibrosi renale. Tuttavia, attualmente esistono risultati opposti: è stato riscontrato nel modello di danno renale acuto che l'AIM può promuovere la rimozione dei detriti cellulari apoptotici da parte delle cellule epiteliali tubulari renali (20).

Al momento, molti studi hanno elaborato il ruolo dei macrofagi, AIM e TGF- 1 nella malattia renale, ma ci sono pochi studi sul ruolo dei tre nel progresso di IgAN, nel processo di fibrosi e sulla correlazione tra i tre. Se la patogenesi della progressione della fibrosi da IgAN può essere chiarita, potrebbe aprire una nuova finestra per il trattamento e la prognosi di IgAN. Per studiare il ruolo di macrofagi, AIM e TGF- 1 nella progressione della fibrosi IgAN, abbiamo rilevato l'infiltrazione di macrofagi nei tessuti renali di pazienti con IgAN e il livello di espressione e le caratteristiche di AIM e TGF- 1 e quindi ha analizzato la relazione tra i tre e gli indicatori clinici correlati e l'area di fibrosi renale dei pazienti con IgAN.

METODI

Soggetti

Quaranta pazienti con IgAN confermati tramite biopsia renale sono stati reclutati dal Subei People Hospital. Pazienti con malattie sistemiche croniche (lupus eritematoso sistemico, diabete mellito, porpora di Henoch-Schönlein, cirrosi epatica, ecc.) (trattamento di glucocorticoidi, immunosoppressione, ACEI, ARB, ecc.) o insufficienza renale avanzata (velocità di filtrazione glomerulare stimata ( eGFR) Sono stati esclusi i livelli di eGFR inferiori o uguali a 15 ml/min/1,73 m2. I livelli di eGFR sono stati calcolati utilizzando l'equazione Modification of Diet in Renal Disease (MDRD) Informazioni cliniche (sesso, età, peso, storia della malattia) e dati di laboratorio ( Al momento della biopsia sono stati raccolti l'albumina sierica, la creatinina sierica, i globuli rossi nelle urine, le proteine ​​urinarie e i livelli di eGFR).I tessuti renali istologicamente normali sezionati adiacenti ai tumori renali sono stati utilizzati come controlli(n=11). Il consenso informato scritto è stato ottenuto da tutti i soggetti e lo studio è stato approvato dal Comitato Etico del Subei People Hospital.

Colorazione immunofluorescente e immunoistochimica

Le sezioni di tessuto renale umano sono state analizzate con colorazione immunoistochimica e immunofluorescente. La colorazione Masson è stata eseguita su tutte le sezioni di tessuto renale umano. Le sezioni sono state deparaffinate e trattate con biossido di idrogeno al 3%. Dopo il recupero e il blocco dell'antigene, le sezioni sono state incubate per una notte con un anticorpo umano CD68 (diluito 1:600, Abcam), un anticorpo umano CD80 (diluito 1:600, Abcam), un anticorpo umano CD163 (diluito 1:600, Abcam), umano AIM anticorpo (diluito 1:150, Abcam) o un anticorpo umano TGF- 1 (diluito 1:500, Abcam). Dopo il trattamento con un anticorpo secondario coniugato con biotina marcato con perossidasi di rafano (diluito 1:200, Biosintesi Biotecnologia, Cina) e colorazione DAB (ZSGB-Bio, Cina), le sezioni sono state osservate al microscopio. 10 campi selezionati casualmente (400 ×) sono stati ripresi per sezione. L'espressione dei macrofagi nei glomeruli e nei tubuli è stata quantificata utilizzando il software di analisi delle immagini Image-Pro Plus (Meyer Instruments, Inc., Houston, TX, USA); le espressioni di AIM e TGF- 1 nei glomeruli sono state quantificate allo stesso modo. La densità ottica integrata (IOD) è stata misurata per ciascuna immagine da due esperti patologici indipendentemente. È stata quindi calcolata la IOD media/area macchiata positivamente (AIOD). I livelli di espressione di macrofagi, AIM e TGF- 1 nelle biopsie renali di IgAN e nelle biopsie renali normali sono stati confrontati calcolando l'AIOD. I nuclei sono stati colorati con DAPI a temperatura ambiente per 5 minuti. Le immagini di sezioni etichettate in modo fluorescente sono state ottenute utilizzando un microscopio a fluorescenza (ZEISS, Axioimager.Z2).

Colorazione Masson per la valutazione della fibrosi

L'area della fibrosi era verde e abbiamo calcolato la percentuale dell'area verde nell'area del campo visivo per riflettere il grado di fibrosi. Tre campi ad alto ingrandimento sono stati selezionati casualmente per ciascuna sezione (tutti i campioni sono stati fotografati nelle stesse condizioni), evitando i grandi vasi. Il sistema di analisi delle immagini IPP6.0 è stato utilizzato per analizzare statisticamente il rapporto dell'area dell'area della fibrosi (tutti i campioni sono stati analizzati allo stesso modo).

Analisi statistiche

L'analisi statistica è stata eseguita utilizzando SPSS 22.0. I dati sono stati espressi come media ± DS o come mediane (intervallo). Differenze significative sono state valutate utilizzando l'ANOVA at-test o unidirezionale. È stato eseguito un test U di Mann-Whitney non parametrico per confrontare la densità ottica integrata tra i gruppi sperimentali. Un P<0.05 was="" considered="" statistically="">

RISULTATI

Distribuzione dei macrofagi nel rene L'immunofluorescenza e l'immunoistochimica (Figure 1,2) hanno mostrato che i macrofagi nel gruppo IgAN erano distribuiti principalmente nell'interstiziale tubulare renale e occasionalmente nel plesso capillare glomerulare e nel lume tubulare renale, mentre i macrofagi non erano distribuiti nella norma tessuto renale.

Inoltre, il numero di macrofagi M{{0}}, Ml e M2 nell'interstizio renale di IgAN era diverso e c'era una maggiore polarizzazione di M0 verso M2(P<0.05, figure="">

Espressione di AIM, TGF- 1 nel tessuto renale Nel gruppo IgAN, AIM è espresso principalmente nelle anse capillari glomerulari e nelle cellule epiteliali tubulari renali, nonché nel lume tubulare renale; Il TGF- 1 è espresso principalmente nelle cellule epiteliali tubulari renali, ma anche nell'interstizio renale. Tuttavia, l'espressione di AIM e TGF- 1 era rara o assente nei tessuti renali normali (Figure 4,5).

Espressione di macrofagi, AlM, TGF- 1 con manifestazione clinica di lgAN

The infiltration of MO and M1 macrophages in the renal tissue of the IgAN group was not significantly correlated with age, sex, urinary red blood cell count,24-hour proteinuria, and eGFR (P>{{0}}.05). Il numero di infiltrazioni di macrofagi M2 era correlato positivamente con la creatinina sierica e la 24-proteinuria ora(r=0.447, P=0.004; r=0.436, P{ {10}}.005) e correlato negativamente con eGFR(r=-0.332, P=0.004)(Figura 6).24-proteine ​​urinarie orarie, creatinina sierica e eGFR erano correlati con AIM e TGF- 1, tra cui 24-proteine ​​urinarie orarie e creatinina sierica erano correlati positivamente con AIM e TGF- 1, mentre eGFR era correlato negativamente con AIM e TGF-B1 (Tabella 1). Poiché non c'era una correlazione significativa tra i macrofagi M0 e M1 e gli indicatori clinici, i dati successivi hanno contato solo i macrofagi M2. Ulteriori analisi statistiche hanno mostrato che le espressioni dei macrofagi M2, AIM e TGF-B1 erano diverse nei diversi tipi patologici e c'era una correlazione tra i macrofagi M2, AIM e TGF- 1(Tabella 2).

Correlazione di macrofagi M2, AlM, TGF- 1 e area fibrotica

L'analisi statistica della correlazione tra area fibrotica e macrofagi di tipo M2-, AIM e TGF- 1 nei tessuti dei pazienti con IgAN ha mostrato che i macrofagi M2 erano correlati positivamente con l'area fibrotica (Figura 7,r{ {4}}.777, P<0.01);aim was="" positively="" correlated="" with="" the="" fibrotic="" area(figure="" 8,r="0.768,"><0.01); tgf-β1="" was="" positively="" correlated="" with="" the="" fibrotic="" area="" (figure="" 9,="" r="0.853,"><>

DISCUSSIONE

L'IgAN è la glomerulonefrite primaria più comune e circa il 40% dei pazienti svilupperà la malattia renale allo stadio terminale (ESRD) entro 20-30 anni (21). La fibrosi renale è un processo necessario affinché tutte le CKD si sviluppino in ESRD. Le manifestazioni patologiche sono la formazione di un gran numero di fibroblasti e miofibroblasti e l'accumulo di un gran numero di matrice extracellulare, che porta alla glomerulosclerosi e alla fibrosi interstiziale tubulare renale. In definitiva, la funzione renale perde a causa della perdita di un gran numero di nefroni normali(4). Attualmente, la fibrosi renale è principalmente suddivisa in quattro stadi:1. L'attivazione delle cellule epiteliali tubulari renali e l'infiltrazione di monociti/macrofagi a causa dell'infiammazione. 2.Il rilascio di citochine, fattori di crescita e altri fattori pro-fibrogenici.3. La formazione della fibrosi si è manifestata principalmente nella deposizione di proteine ​​della matrice. 4. La deposizione di matrice extracellulare (ECM), è uno stadio importante del deterioramento strutturale e funzionale del rene (riduzione significativa dei nefroni efficaci e ulteriore declino della velocità di filtrazione glomerulare).

Le cellule staminali mieloidi si differenziano in monociti ed entrano nella circolazione dal midollo osseo. I monociti nella circolazione migrano e si infiltrano nei tessuti sotto diversi stimoli come infiammazione e trauma, per poi differenziarsi in macrofagi. I macrofagi sono cellule eterogenee nel sistema immunitario naturale, che possono regolare dinamicamente i loro fenotipi per adattarsi al microambiente locale. I monociti in circolazione, spinti da segnali infiammatori, entrano nel rene e si attaccano alle cellule endoteliali vascolari, inducendo contemporaneamente il rilascio di chemochine e fattori infiammatori cronici. Ciò si traduce in un'ampia aggregazione locale di monociti nell'interstiziale renale, che si differenziano in macrofagi attivati ​​classicamente (M1) o macrofagi attivati ​​selettivamente (M2) da percorsi diversi. Inizialmente, i patogeni e le cellule necrotiche attivano i recettori Toll-like e altri recettori immunitari innati, promuovendo la polarizzazione dei macrofagi M0 nei macrofagi M1. I macrofagi M1 si depositano attraverso la membrana basale nella fase iniziale del danno renale, promuovendo una serie di risposte infiammatorie e portando a un ulteriore danno renale. Con lo sviluppo della lesione, le cellule apoptotiche e necrotiche fagocitate dai macrofagi, così come la successiva generazione di fattori antinfiammatori, promuovono la polarizzazione dei macrofagi verso i macrofagi M2. I macrofagi M2 svolgono principalmente il ruolo di antinfiammatorio, promuovendo la riparazione renale e causando fibrosi(6,{11}}). Pertanto, l'equilibrio dinamico dei macrofagi M1 e M2 indica il processo di infiammazione e riparazione dei tessuti, che determina la prognosi dei reni e guida gli sforzi verso terapie mirate ai macrofagi.

In questo studio, abbiamo scelto i tessuti patologici renali di pazienti a cui è stata diagnosticata l'IgAN e abbiamo osservato la polarizzazione di diversi macrofagi. Abbiamo selezionato CD68 per rappresentare M0, CD80 per rappresentare M1 e CD163 per rappresentare M2. I nostri risultati hanno mostrato che il numero di macrofagi M0(CD68*), M1(CD80*) e macrofagi M2(CD163*) erano rispettivamente significativamente aumentati rispetto al rene normale, indicando che c'era un'infiltrazione relativamente evidente di macrofagi nel tessuti renali dei pazienti affetti da lgAN.

It was not only found that the infiltration of macrophages in the renal tissue of IgAN patients increased significantly, but also found that there were differences in the number of M0, Ml, and M2 macrophages in the interstitium of lgAN patients, with more polarization of M0 towards M2. In other words, the infiltration of M2 macrophages is mainly found in the renal tissue of IgAN patients. There was a positive correlation between M2 macrophages and fibrotic area; The distribution of M0 and M1 macrophages in the lgAN group had no significant correlation with age, sex, urinary red blood cell count, 24-hour proteinuria, and eGFR(P>0.05); Tuttavia, il numero di infiltrazioni di macrofagi M2 è correlato positivamente con la creatinina sierica e la proteinuria 24-ora; È dimostrato che i macrofagi M2 svolgono un ruolo più importante nella progressione della fibrosi IgAN.

L'AIM svolge anche un ruolo importante in molte malattie, come l'aterosclerosi, l'epatopatia non alcolica(16), l'insulino-resistenza (27), le malattie autoimmuni, ecc. Allo stesso tempo, l'AIM è strettamente correlata alla fibrosi renale. Megumi Oshima et al. (19) hanno prelevato tessuto renale da 43 pazienti sottoposti a biopsia renale e hanno scoperto che l'area di deposizione di AIM e macrofagi era positivamente correlata alla gravità della proteinuria e alla diminuzione dell'eGFR nei pazienti. Ha suggerito che l'AIM potrebbe avere un danno renale aggravato. Tadashi Uramat et al.(18) hanno stabilito un'ipertensione grave e indotto un danno renale utilizzando un modello di tendenza all'ipertensione spontanea (SHRsp) nei topi. Dopo il trattamento dell'ipertensione con farmaci correlati, è stato riscontrato che il numero di macrofagi che si infiltravano nei glomeruli e nell'interstizio era significativamente ridotto. Rispetto al gruppo di controllo, le espressioni di AIM e oxLDL erano significativamente ridotte. Inoltre, il grado di fibrosi nel tessuto renale era inferiore a quello del gruppo non trattato.

Nel nostro studio, c'erano differenze significative nell'espressione di AIM in ciascun grado patologico e la sua espressione era significativamente correlata positivamente con i macrofagi M2, il TGF- 1 e il grado di fibrosi renale. Questo esperimento e le condizioni di cui sopra suggeriscono tutti che l'AIM è correlato al processo di fibrosi renale dell'CKD, che può essere correlato all'effetto anti-apoptotico dell'AIM sui macrofagi, e quindi i continui segnali infiammatori promuovono l'ulteriore sviluppo della fibrosi. Takako Tomita et al.(28) hanno estratto cellule necrotiche da topi con peritonite indotta da polisaccaridi di lievito in vitro e hanno scoperto che l'AIM potrebbe promuovere la fagocitosi dei macrofagi Ml e M2a in cellule necrotiche. È stato anche riscontrato nel modello IgAN e nel modello di danno renale acuto di ischemia-riperfusione (IRI) che l'AIM potrebbe promuovere la clearance delle cellule IgAl e apoptotiche che causano nefrite da parte dei macrofagi. Dagli studi di cui sopra, si scopre che l'AIM, come i macrofagi, può svolgere ruoli diversi in diversi stadi della malattia, mentre il ruolo dell'AIM nella malattia renale può essere simile ai macrofagi.

In un modello di insufficienza renale cronica causata da IRI, i macrofagi M2 sono strettamente correlati al processo di fibrosi renale, che è causata principalmente dalla secrezione di TGF- 1 (29). TGF- 1 appartiene alla superfamiglia TGF e svolge un ruolo importante nello sviluppo della CKD(30). Anche la transdifferenziazione del miofibroblasto epiteliale tubolare (TEMT) è un importante meccanismo della fibrosi interstiziale renale e il TGF- 1 è un importante TEMT che regola le citochine (31). Usando anticorpi di neutralizzazione del TGF- 1, inibitori, knockout genico e altri metodi per consumare il TGF- 1, il grado di fibrosi renale può essere efficacemente ridotto (32). Finora, i meccanismi del TGF- 1 che causano la fibrosi renale includono principalmente i seguenti punti: 1. Indurre la sintesi della matrice extracellulare, come il collagene I e la fibronectina(33). 2. Le metalloproteinasi della matrice (MMP) e l'inibitore tissutale delle metalloproteinasi (TIMP) sono sbilanciate, riducendo così la degradazione della matrice extracellulare.3. Promuove la proliferazione delle cellule mesangiali e la secrezione di collagene e causa danni alle cellule epiteliali e dei podociti, promuovendo così l'infiammazione e l'ulteriore fibrosi tissutale (34).4. Promuovere la transdifferenziazione e la proliferazione di miofibroblasti di varia origine (quali periciti, cellule epiteliali, cellule endoteliali, fibroblasti, macrofagi, ecc.), mediando così lo sviluppo della fibrosi(35). Precedenti studi hanno osservato che l'espressione di mRNA e proteine ​​del TGF-B1 in IgAN e il grado di infiltrazione dei macrofagi M2 nel tessuto renale erano significativamente aumentati rispetto al tessuto renale normale(31), il TGF- 1 era co-espresso con i macrofagi M2 nel tessuto della biopsia renale dell'ipertensione indotta da CKD. Tutti questi hanno suggerito che i macrofagi M2 possono svolgere un ruolo nella fibrosi renale attraverso il TGF- 1.

In questo esperimento, abbiamo scoperto che con l'aumento del grado patologico, aumentavano anche l'infiltrazione del macrofago M2 e il grado di espressione di AIM e TGF- 1. C'era una differenza significativa tra i diversi gruppi patologici. Tutti e tre erano strettamente correlati alle 24-ore proteine ​​urinarie, creatinina sierica, eGFR e altri indicatori clinici dei pazienti con IgAN, e c'era una correlazione positiva significativa tra i tre e l'area della fibrosi renale, che indica che M2 macrofagi, AIM e TGF-B1 erano tutti coinvolti nella comparsa e nello sviluppo di lgAN ed erano strettamente correlati al processo di fibrosi di IgAN. I risultati di questo esperimento erano coerenti con lo studio di Braga et al. (36,37), che hanno scoperto che i macrofagi M2 sono coinvolti nella fibrosi renale dell'ostruzione ureterale unilaterale (UUO) in una via di segnalazione MyD88. Al contrario, gli studi hanno scoperto che i macrofagi svolgono un ruolo antieroico nella fase di recupero della nefropatia ostruttiva. Nishida et al. (38) hanno dimostrato che il recettore dell'angiotensina II di tipo 1 (Agtr1) sui macrofagi interstiziali funziona per ridurre la fibrosi renale in una fase successiva dell'UUO. Lopez-Guisa et al.(39) hanno confermato che i macrofagi hanno mostrato un ruolo di attenuazione della fibrosi attraverso l'attivazione di una via di turnover del collagene lisosomiale esprimendo il recettore 2 del mannosio (Mrc2) in UUO.

I macrofagi M2, AIM e TGF- 1 svolgono un ruolo importante nel processo di fibrosi IgAN e i tre si influenzano a vicenda. Tuttavia, a causa della piccola dimensione del campione di questo esperimento e del meccanismo di interazione e della relazione tra i tre, sarà necessaria un'ulteriore verifica degli esperimenti sugli animali rilevanti.