Il ruolo melanogenico siero/PDGF-dipendente del livello minuto della chinasi oncogenica PAK1 nelle cellule di melanoma dimostrato dal test della chinasi altamente sensibile

Contatto:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Riepilogo:Abbiamo precedentemente dimostrato che la chinasi oncogenica PAK4, che sia i melanomi che i melanociti normali esprimono ad un livello molto alto, è essenziale per la loromelanogenesi. Nel presente studio, utilizzando il test della chinasi "Macaroni-Western" (IP-ATP-Glo) altamente sensibile, abbiamo studiato il potenziale melanogenico di un'altra chinasi oncogenica PAK1, che le cellule di melanoma (B16F10) esprimono solo a un livello molto minuto. Dopo aver trasfettato le cellule di melanoma con PAK1-shRNA per silenziare il gene PAK1, il contenuto di melanina,tirosinasil'attività e l'attività della chinasi di PAK1 sono state confrontate tra il tipo selvaggio e i trasfettanti. Abbiamo scoperto che (i) PAK1 è significativamente attivato da ormoni melanogenici come IBMX (3-isobutil-1-metil xantina) e -MSH (ormone stimolante i melanociti), (ii) silenziando il gene PAK1 endogeno in cellule di melanoma attraverso shRNA PAK1-specifico riduce sia il contenuto di melanina chetirosinasiattività in presenza di ormoni sierici e melanogenici a livello basale, (iii) il PAK1 wild-type aggiunto esogeno nelle cellule di melanoma aumenta il livello di melanina inducibile dall'MSH di diverse volte senza influenzare la base e (iv) - La melanogenesi indotta da MSH/IBMX si verifica difficilmente in assenza di siero o PAK1, indicando chiaramente che PAK1 è essenziale principalmente per il siero e -MSH/IBMX-dipendentemelanogenesi, ma non il basale, nelle cellule del melanoma. Il risultato di questo studio potrebbe fornire la prima base scientifica per spiegare perché un'ampia varietà di PAK{0}}bloccanti a base di erbe come il CAPE (estere fenetile dell'acido caffeico), la curcumina e la shikonin nei cosmetici sono utili persbiancamento della pelle.

Parole chiave:PAK1,melanogenesi, melanomi,tirosinasi, MITF,sbiancamento della pelle, siero

prodotti sbiancanti per la cura della pelle

introduzione

Il colore dei peli, delle iridi degli occhi e della pelle è controllato da una famiglia di pigmenti chiamati melanine. La fonte intracellulare di melanina è la tirosina e viene convertita in melanina attraverso una serie di ossidazioni enzimatiche (idrossilazione) che coinvolgonotirosinasi, TRP (proteina correlata alla tirosinasi) 1 e TRP2. L'espressione dei geni che codificano per questi enzimi melanogenici richiede almeno due fattori di trascrizione oncogeni/melanogenici (MTF): beta-catenina e MITF (fattore di trascrizione associato alla microftalmia). La maggior parte dei composti a base di erbesbiancamento della pellei cosmetici o inibiscono direttamente questi enzimi melanogenici o sottoregolano gli MTF. Gli analoghi della tirosina come l'acido cogico appartengono alla prima categoria (tirosinasiinibitori), mentre la maggior parte dei residui come CAPE (estere fenetilico dell'acido caffeico), curcumina e shikonin appartengono alla seconda categoria (regolatori MTF) (1,2). È interessante notare che molti di questi regolatori MTF tra cui CAPE, curcumina, shikonin e cucurbitacina sono noti per bloccare la chinasi oncogenica/invecchiamento PAK1 (RAC/CDC42-chinasi 1 attivata) (3-5). Pertanto, è molto probabile che PAK1 sia coinvolto nell'attivazione di questi fattori di trascrizione melanogenici/oncogenici nelle cellule ciliate, nelle iridi oculari o nei melanociti della pelle. Infatti, almeno la beta-catenina è tra i substrati diretti di PAK1 (6). PAK1 fosforila la beta-catenina a Ser 675 per l'attivazione, portando alla trasformazione maligna. Inoltre, la beta-catenina è essenziale per l'attivazione di MITF, portando amelanogenesio/e oncogenesi dei melanociti (7).

È interessante notare, tuttavia, che è stato recentemente rivelato che il gene PAK1 knock-out di per sé nei topi pigmentati non riesce a produrre alcun topo albino (Hong He et al., osservazione non pubblicata), indicando chiaramente che almeno la melanogenesi basale sia nelle cellule ciliate che nell'occhio irises è indipendente da PAK1, sebbene il contributo di PAK1 alla pellemelanogenesiresta da chiarire.

In precedenza abbiamo dimostrato che la chinasi oncogenica PAK4 (CDC42-dipendente chinasi 4) è altamente espressa sia nel melanoma che nelle normali linee cellulari di melanociti ed è responsabile della loro melanogenesi, attivando CREB/beta-catenina-MIFT-tirosinasipathway, mentre PAK2 (RAC/CDC42-activated kinase 2), un altro membro altamente espresso della famiglia PAK, non gioca alcun ruolo nella loro melanogenesi (8).

In questo studio, forniamo le prime prove biochimiche per un ruolo specifico di un'altra chinasi oncogenica chiamata PAK1 nella pellemelanogenesi, nonostante il suo livello di espressione sia minimo: il silenziamento indotto da shRNA del gene PAK1 nei melanociti (B16F10) derivati ​​dal melanoma del topo ha ridotto significativamente l'inducibile -MSH/IBMXmelanogenesial livello basale, mentre la sovraespressione del gene PAK1 ha potenziato la melanogenesi inducibile da -MSH senza influenzare il basale. Inoltre, abbiamo scoperto che la melanogenesi inducibile -MSH/IBMX richiede un fattore sierico che è molto probabilmente PDGF (fattore di crescita derivato dalle piastrine). Nel terreno privo di siero, solo basalemelanogenesiha luogo.

cistanceridurre l'attività della tirosinasi

2. Materiali e metodi

2.1. Materiali

Le cellule di melanoma B16F10 sono state acquistate da American Type Culture Collection (Rockville, MD, USA). PAK1-I plasmidi SureSilencing, la trasfezione attraente e il maxi kit di plasmidi endofree® sono stati acquistati da Qiagen (Valencia, CA 91355, USA). Gli anticorpi primari PAK1-, gli anticorpi secondari biotinilati, il reagente ECL signalfireTM sono stati ottenuti da Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA). Il reagente Kinase Glo e l'ATP (kit per la chinasi ATP_Glo) sono stati acquistati da Promega (Madison, Wisconsin, USA). Le cellule competenti di lipofectamine e JM109 sono state acquistate da Invitrogen e Life Technology. AG1295 e AG1478 sono stati acquistati da Calbiochem (San Diego, CA, USA). Tutte le altre sostanze chimiche, compreso il PDGF-bb umano, sono state acquistate da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA).

2.2. Silenziamento del gene PAK1 nei melanociti di topo (B16F10) mediante trasfezione stabile con shRNA specifico per PAK1- di topo

2.2.1. Coltura cellulare

Le cellule di melanoma B16F10 sono state coltivate in DMEM integrato con il 10% di FBS attivato dal calore e l'1% di penicillina/streptomicina (10,000 U/mL e 100 µg/mL) a 37 gradi in un'atmosfera umidificata contenente il 5% di CO2.

2.2.2. Trasfezione stabile con shRNA specifico per PAK1- di topo

La trasfezione di ShRNA della linea cellulare B16F10 è stata eseguita fondamentalmente attraverso la stessa procedura precedentemente descritta (9), ma con shRNA specifici per PAK1- di topo (# KM04553, Qiagen). Per la trasfezione sono stati utilizzati i seguenti quattro distinti cloni di shRNA: clone 1 (CCAGAGAAGTTGTCAGCTATT), clone 2 (CATCAAGAGGTGACAATATTCT), clone 3 (GTACACACGGTTCGAGAAGAT) e clone 4 (GTACCACCAGTGTCAGAAGAT) nonché shRNA non mirato come controllo negativo (WT) . Tuttavia, in questo studio, i cloni 1 e 2 si sono rivelati più efficaci dei cloni 3 e 4 per silenziare il gene PAK1 di topo in questa linea di melanociti (dati non mostrati). Sono stati selezionati trasfettanti stabili in presenza di G418 (1 mg/mL) che uccide oltre il 99% delle cellule non trasfettate.

2.2.3. Analisi Western-blot del livello di proteina PAK1 e test in vitro per l'attività chinasica di PAK1 nei trasfettanti

2.2.3.1. Analisi Western blot

Al fine di quantificare il livello estremamente basso di PAK1 sia nella linea cellulare di controllo (WT) che nei trasfettanti silenziati PAK1- (resistenti al G418-), riducendo al minimo i livelli di "rumore non specifico", abbiamo condotto il test occidentale analisi blot utilizzando un anticorpo policlonale di coniglio contro PAK1 (#2062, Cell Signaling Technology) come anticorpo primario. In breve, ogni clone è stato seminato alla concentrazione di 2 × 105 cellule/pozzetto in una piastra da 6 pozzetti, precoltivata per 48 ore e i lisati cellulari sono stati bolliti in 25 µL di tampone SDS-PAGE per 5 minuti. Otto µ l (contenenti 15 µ g di proteine ​​totali) di ciascun supernatante per slot sono stati utilizzati per SDS-PAGE. La nitrocellulosa è stata tamponata con l'IgG anti-PAK1 (1:1,{18}} come anticorpo primario) e come anticorpi secondari, l'IgG anti-coniglio legato all'HRP e l'IgG anti-biotina (#7074, # 7075, Cell Signaling) sono stati utilizzati per rilevare sia le bande PAK1 che -actina che sono state infine visualizzate con il sistema ECL di Amersham. I saggi western blot erano rappresentativi di tre esperimenti indipendenti.

2.2.3.2. Saggio della chinasi "Macaroni-Western" (IP-ATP_Glo) per PAK1 nelle cellule di melanoma

L'attività chinasica di PAK1 nei melanociti WT e nei transfettanti shRNA (SHs) è stata misurata da una modifica sostanziale (5) di un metodo decennale (che abbiamo coniato "Macaroni-Western") sviluppato da un gruppo italiano (1{{39 }}). In breve, le linee cellulari di melanoma B16F10 (WT o SH, 2 × 105 cellule/mL) sono state pre-coltivate su 6-piastra a pozzetti per 24 ore. Quindi le cellule sono state trattate con 100 nM -MSH o 100 µM IBMX per 48 ore. Le cellule sono state interrotte dal tampone di lisi contenente Tris HCl 50 mM pH 7,5 e NaCl 150 mM e Triton-X all'1%. Per l'immunoprecipitazione (IP) di PAK1, i lisati cellulari eliminati sono stati incubati con IgG anti-PAK1 (diluizione 1:50) e granuli di proteina A-agarosio per 1-2 h nella cella frigorifera con agitazione continua da parte di un miscelatore rotante (Nissin, Suginami-ku, Tokyo, Giappone). L'IP risultante (PAK1) da ciascun lisato è stato incubato con il kit di analisi della chinasi ATP Glo (Promega) in presenza di ATP e MBP (proteina di base della mielina) per 1 ora a 37 gradi e il livello di ATP rimanente è stato misurato dall'ATP- reazione Luciferina-Luciferasi dipendente che alla fine genera una luminescenza (10). La sospensione finale è stata centrifugata e il surnatante è stato trasferito in una 96-piastra a pozzetti per la lettura. La luminescenza è stata registrata dal lettore di micropiastre MTP-880Lab (Corona, Hitachinaka-ku, Ibaraki, Giappone) con un tempo di integrazione di 0,5 s per pozzetto.

2.3. Misurare il contenuto di melanina e l'attività della tirosinasi nei trasfettanti

2.3.1. Misurazione del contenuto di melanina

Il contenuto di melanina è stato determinato come descritto in precedenza (11). In breve, le cellule B16F10 (transfettanti shRNA di tipo selvaggio o PAK1-specifici) sono state piastrate a una densità di 2 × 104 cellule/pozzetto in una piastra a pozzetti 24-. Dopo 24 ore di coltura, sono stati aggiunti 100 µM di isobutile-1-metilxantina (IBMX) o 100 nM di MSH e incubati per altre 72 ore a 37 gradi. Le cellule sono state lavate due volte con tampone fosfato, quindi lisate con 500 µl di una soluzione contenente 1 M NaOH e 10 percento di DMSO e incubate a 80 gradi per 1 ora, per solubilizzare la melanina, e il contenuto di melanina è stato misurato a 490 nm. Per confrontare il contenuto di melanina nelle cellule wild-type e trasfettate, la quantità totale di melanina prodotta dai melanociti wild-type è stata considerata come controllo (100 percento) e quella dei transfettanti è stata calcolata di conseguenza.

2.3.2. Saggio per l'attività della tirosinasi intracellulare

tirosinasil'attività è stata determinata come precedentemente descritto (12), con una leggera modifica. Le cellule B16F10 (wild-type o trasfettanti) sono state piastrate a una densità di 2 × 104 cellule/pozzetto e, dopo 24 ore di coltura, sono stati aggiunti 100 µM di IBMX o 100 nM -MSH e incubati per ulteriori 72 ore a 37 gradi . Le cellule sono state quindi lavate con tampone fosfato ghiacciato e lisate con tampone fosfato (pH 6,8) contenente l'1% di Triton-X (500 µL/pozzetto). Le piastre sono state congelate a -80 gradi per 30 minuti. Dopo lo scongelamento, a ciascun pozzetto sono stati aggiunti 100 µl di L-DOPA all'1%. Dopo l'incubazione a 37 gradi per 2 ore, l'assorbanza è stata misurata a 490 nm.

2.4. Misurazione del contenuto di melanina nei melanociti wild-type e {3}}con sovraespressione di PAK dopo il trattamento con MSH

Usando il vettore Myc (2 μg), i melanociti (B16F10) sono stati trasfettati transitoriamente con PAK1 di tipo selvaggio (WT) o con la cosiddetta mutazione PAK1 "costitutivamente attivata" (CA) portante la mutazione T423E. Dopo 3 giorni di coltura, ogni clone trasfettato è stato raccolto per ulteriori esperimenti. L'effetto della sovraespressione di PAK1- sul contenuto di melanina è stato misurato attraverso le stesse procedure descritte in precedenza (8). In breve, i melanociti, sia con la sovraespressione di tipo selvaggio che con la PAK1-che esprimono il PAK1 di tipo selvaggio o il suo mutante CA, sono stati incubati con 100 nM -MSH per 3 giorni. Le cellule sono state lisate con una soluzione contenente 1 M NaOH e il 20% di DMSO per dissolvere la melanina e il suo contenuto è stato determinato a 405 nm.

2.5. Melanogenesi in terreno privo di siero

Le cellule B16F10 (transfettanti shRNA wild-type o PAK1-specifici) sono state piastrate a una densità di 2 × 104 cellule/pozzetto in una piastra a 24-pozzetti in presenza del 10% di FBS. Dopo 24 h di incubazione, il mezzo di coltura viene sostituito con un mezzo privo di siero e coltivato per ulteriori 72 h con o senza 100 µM IBMX o 100 nM -MSH per misurare il contenuto di melanina.

2.6. Effetto degli inibitori del recettore PDGF/EGF sulla melanogenesi siero-dipendente

2 × 104 cellule B16F10 sono state seminate in ciascun pozzetto per 24 ore in un mezzo contenente FBS al 10% e quindi coltivate per altre 72 ore nel mezzo fresco contenente 100 nM -MSH e seguenti: (1) nessun siero, (2) 10 percento FBS da solo, (3) 10 percento FBS più 2 µM AG1295 (inibitore del recettore PDGF) e (4) 10 percento FBS più 400 nM AG1478 (inibitore del recettore EGF), per misurare il contenuto di melanina.

2.7. analisi statistica

I dati sono espressi come valori medi con i loro errori standard. I confronti statistici sono stati eseguiti mediante ANOVA unidirezionale seguito dal test a più intervalli di Duncan. L'analisi statistica è stata condotta utilizzando SAS (versione 9.2; SAS Institute, Cary, NC, USA) e p inferiore o uguale a 0.05 è stato considerato significativo.

maca ginseng cistanche

3. Risultati

3.1. Attivazione di PAK1 in una linea cellulare di melanoma (B16F10) da parte di ormoni melanogeni

Due ormoni melanogenici, -MSH (ormone stimolante i melanociti) e IBMX (3-isobutil-1-metil xantina) sono spesso usati per stimolaremelanogenesinei melanociti come la linea cellulare di melanoma B16F10. Pertanto, abbiamo prima esaminato se questi ormoni possono attivare PAK1 in questa linea cellulare, sebbene il livello proteico di PAK1 sia estremamente basso, rispetto a quelli di PAK2 e PAK4 (8). Per monitorare i cambiamenti nell'attività della chinasi di PAK1 nelle cellule, abbiamo recentemente sviluppato un test della chinasi altamente sensibile/specifico chiamato protocollo di test della chinasi "Macaroni-Western" (IP ATP-Glo) combinando l'immuno-precipitazione (IP) di PAK1 dalla cellula lisati e kit ATP_Glo chinasi di Promega (5). Utilizzando questo test della chinasi, abbiamo scoperto che sia -MSH (100 nM) che IBMX (100 µM) attivano PAK1 nelle cellule di melanoma, con -MSH più potente di IBMX (vedi Figura 1). Tuttavia, dovremmo ricordare ai lettori che l'attivazione della piega di PAK1 mostrata qui è solo apparente, perché durante questo lungo test IP in provetta e test delle chinasi (oltre 3 ore in totale) che si svolgono senza questi ormoni melanogenici, PAK1 verrebbe gradualmente normalizzato su volta. In altre parole, non possiamo congelare lo stato esatto della chinasi di PAK1 alla fine della coltura cellulare trattata con questi stimolatori e l'attivazione della piega è solo un riflesso sottovalutato dell'attivazione di PAK1 avvenuta durante la coltura cellulare da questi simulatori.

3.2. Silenziamento del gene PAK1 da parte di shRNA nella linea cellulare di melanoma di topo

Al fine di indagare ulteriormente biochimicamente se PAK1 contribuisce almelanogenesinelle cellule della pelle (melanociti), abbiamo trasfettato stabilmente la linea cellulare di melanoma B16F10 con shRNA specifico per PAK1- di topo per silenziare selettivamente il gene PAK1.

3.2.1. Silenziamento del gene PAK1 nei melanociti

La nostra analisi preliminare del western blot ha suggerito che in due distinti cloni silenziati PAK1- (SH1 e 2) i livelli di proteina PAK1 sono significativamente (di circa il 75%) ridotti, ma il tasso di crescita di questa linea cellulare di melanoma di per sé non era significativamente influenzato dal silenziamento PAK1 (dati non mostrati). Tuttavia, la quantificazione accurata dei livelli di proteina PAK1 mediante la scansione di questo western blot è stata piuttosto difficile, principalmente a causa dell'elevato rumore di fondo attorno alla banda PAK1 nel tentativo di visualizzare i suoi livelli di espressione estremamente bassi. Invece, utilizzando il test della chinasi "Macaroni-Western" (5,10), abbiamo verificato che l'attività chinasica di PAK1 in entrambi i cloni SH1 e 2 è solo circa il 25-30 percento di quella nelle cellule di controllo (WT) ( vedere la figura 2A).

3.2.2. Riduzione della melanogenesi mediante silenziamento del gene PAK1

La nostra successiva domanda critica era se una tale riduzione dell'attività chinasica di PAK1 influissemelanogenesi. Pertanto, il contenuto di melanina in questi cloni (SH1 e 2) è stato confrontato con le cellule di melanoma di tipo selvaggio (WT), dopo aver trattato tutte queste cellule con -MSH, un induttore melanogeno, per 72 ore. Come mostrato nella Figura 2B, il contenuto di melanina in questi melanociti carenti di PAK1- (SH1 e 2) viene ridotto di circa il 50 percento (51-55 percento), raggiungendo il livello basale nel WT senza l'ormone melanogenico. Per vedere se questa riduzione del contenuto di melanina è associata alla soppressione dell'attività della tirosinasi, abbiamo misurato iltirosinasiattività nelle cellule carenti di PAK1- (cloni SH1 e 2), rispetto al WT. Come mostrato nella Figura 2C, l'attività della tirosinasi nelle cellule carenti di PAK1- è solo circa il 45 percento (33-58 percento) di quella nel WT, raggiungendo nuovamente il livello basale (non stimolato), indicando chiaramente che PAK1 è essenziale per la produzione di melanina indotta da -MSHtirosinasinei melanociti. Inoltre, in modo molto simile anche la melanogenesi indotta da IBMX è stata ridotta silenziando il gene PAK1 in questa linea cellulare di melanoma (dati non mostrati). Tuttavia, tenendo conto dei seguenti due fattori, è molto probabile che solo la metà dimelanogenesinei melanociti è PAK1-dipendente e il restante (in gran parte "di base") è PAK4-dipendente: (i) PAK4 è anche essenziale per la melanogenesi indotta da -MSH nei melanociti (8) e (ii) circa il 25% del gene PAK1 sembra essere ancora espresso in questi trasfettanti (SH1 e 2). Tuttavia, resta da chiarire vigorosamente se PAK1 sia responsabile dell'ormone inducibile o del basalemelanogenesi.

Inoltre, abbiamo confermato che il PAK1 endogeno è significativamente attivato da induttori melanogenici come IBMX e -MSH in questa linea cellulare di melanoma (vedi Figura 1), ma senza alcun cambiamento significativo nella sua autofosforilazione a Thr 423 come giudicato dall'anti-pPAK1 anticorpo (dati non mostrati).

3.3. Aumento della melanogenesi inducibile da -MSH da PAK1 sovraespresso

Mediante la sovraespressione del gene PAK1 wild-type (WT) nei melanociti (linea cellulare B16F10) mediante trasfezione, abbiamo rivelato che il gene PAK1 aggiunto esogeno aumenta il livello di melanina inducibile da -MSH di diverse volte (vedi a sinistra della Figura 3, confronta corsie 2 e 4), mentre di per sé non influisce sul livello di melanina "basale" indipendente (confrontare le corsie 1 e 3 nel pannello di sinistra della Figura 3), suggerendo che PAK1 contribuisce principalmente a -MSH/IBMX-dipendentemelanogenesi, e non la melanogenesi basale senza uno o più stimolatori esogeni.

3.4. Effetto del siero sulla melanogenesi inducibile da -MSH/IBMX

Più interessante, abbiamo scoperto che l'induzione della melanogenesi da parte di -MSH/IBMX richiede il 10 percento di FBS (siero fetale bovino) oltre a PAK1. Come mostrato nella Figura 4A, in un mezzo privo di siero, o -MSH o IMX difficilmente hanno indotto ilmelanogenesinelle cellule WT, sebbene il 10 percento FBS da solo (senza -MSH/IBMX) abbia indotto ilmelanogenesisignificativamente (di circa il 60 per cento). È interessante notare che la melanogenesi nei trasfettanti SH (cellule carenti di PAK1-) in presenza o assenza di siero era lo stesso livello di quella nelle cellule WT in assenza di siero (vedi Figura 4B), suggerendo che la melanogenesi siero-dipendente richiede anche PAK1. A sostegno di questa nozione, il siero da solo attiva in modo significativo l'attività della chinasi di PAK1 nelle cellule WT, ma l'attivazione -MSH-dipendente di PAK1 nelle cellule WT richiede siero (vedi Figura 4C).

Per quanto riguarda la natura chimica del fattore sierico melanogenico che da solo attiva il PAK1, ipotizziamo che sia PDGF (fattore di crescita derivato dalle piastrine) per i seguenti motivi: (i) più di un decennio fa abbiamo dimostrato che il PDGF è l'unico fattore di crescita in siero che attiva PAK1 attraverso la transattivazione del recettore dell'EGF (fattore di crescita epidermico) da parte del recettore del PDGF (13,14), e molto recentemente altri hanno dimostrato che sia il PDGF che l'EGF da soli stimolano effettivamente ilmelanogenesidi melanociti (15,16).

3.5. La melanogenesi siero/PDGF-dipendente richiede il recettore dell'EGF

Nel tentativo di identificare la natura chimica specifica di questo fattore sierico melanogenico, abbiamo testato l'effetto di AG1295 (inibitore specifico per il recettore PDGF) o AG1478 (inibitore specifico per il recettore EGF) sul siero-dipendentemelanogenesinei melanociti. Come mostrato nella Figura 5, 2 µM AG1295 o 400 nM AG1478 hanno fortemente ridotto il siero-dipendentemelanogenesial livello equivalente alla melanogenesi di base (senza siero). Poiché il PDGF è abbondantemente presente nel siero, ma non l'EGF e l'AG1295 non inibisce il recettore dell'EGF, mentre l'AG1478 non inibisce il recettore del PDGF (13), è molto probabile che il PDGF nel siero attivi il suo recettore che a sua volta transattiva il recettore dell'EGF che alla fine attiva PAK1 che è essenziale per la melanogenesi siero-dipendente (per i dettagli, vedere la Figura 6). Sulla base di questo presupposto, discuteremo in seguito il meccanismo più probabile alla base dell'apparente sinergia tra -MSH e siero/PDGF per l'attivazione di PAK1, portando a una robusta melanogenesi.

Infine, vale la pena sottolineare che il contenuto di melanina "basale" senza -MSH non è stato significativamente modificato dal mutante CA (costitutivamente attivo) sovraespresso di PAK1 che porta la mutazione T423E (vedere il pannello di sinistra della Figura 3, corsia 5) poiché se fosse un DN (dominante negativo) o un mutante inattivo. In effetti, -MSH non ha indotto affatto la fosforilazione di WT PAK1 a Thr 423 (dati non mostrati). Pertanto, si potrebbe concludere che l'autofosforilazione di PAK1 a Thr 423 non ha nulla a che fare con l'attivazione di PAK1 indotta da -MSH, il che porta alla robustamelanogenesinelle cellule di melanoma. Poiché il mutante T423E di PAK1 è noto per essere altamente oncogenico (6), forse l'autofosforilazione a Thr 423 potrebbe servire a passare dalla segnalazione "melanogenica" a quella "oncogenica".

4. Discussione

Dalla nostra osservazione sulla melanogenesi sia PAK1-dipendente che PAK4-dipendente nelle cellule di melanociti/melanoma, emergono due questioni potenzialmente interessanti da evidenziare: (i) L'attività melanogenica "specifica" di PAK1 ( solo minuziosamente espresso) deve essere di gran lunga superiore a quello di PAK4 (altamente espresso) nelle cellule di melanoma. (ii) Sembra che PAK1 sia principalmente responsabile della melanogenesi sierica, mentre PAK4 sia principalmente responsabile della intrinseca (basale)melanogenesi. In altre parole, sebbene la carenza di PAK4-sia embrionale letale nei topi, mentre la carenza di PAK1- da sola non riesce a produrre topi "albini", l'apparente differenza nel colore della pelle originale (di basemelanogenesi) tra bianchi e neri, ad esempio, potrebbe essere almeno in parte un riflesso della differenza nel livello di espressione di PAK4, così come la differenza nel livello di melanogenicotirosinasis.

In vivo, utilizzando topi HRM-2 (pigmentati ma glabri), abbiamo recentemente dimostrato che una crema contenente 10 μM di inibitore PF3758309 (PAK1/PAK4-inibitore) riduce la melanogenesi indotta dai raggi UV nella loro pelle al livello basale, anche se resta ancora da chiarire se PAK4 o PAK1 sia responsabile dell'induzione UV della melanogenesi (8). Poiché PAK1 è responsabile della melanogenesi inducibile, ma non basale, varrebbe la pena testare se PAK1 contribuisce in modo significativo alla inducibilità UVmelanogenesi(abbronzatura solare), utilizzando il raro mutante PAK1 KO (knock out) derivato dal ceppo C57B16 di topi portatori di peli e occhi scuri (Hong He et al., osservazione non pubblicata), nel tentativo di capire se una varietà di PAK1 a base di erbe i bloccanti nei cosmetici sono utili o meno per gli agenti di protezione solare. È interessante notare che PAK1 è stato segnalato per essere attivato dall'irradiazione UV e da altri agenti dannosi per il DNA (17).

È stato dimostrato che -MSH attiva la Tyr chinasi JAK2 (18), che a sua volta attiva PAK1 mediante fosforilazione a Tyr 285, (anziché Thr 423), portando all'interazione PIX-PAK1 (19). Questo potrebbe spiegare perché né l'attivazione -MSH-dipendente di PAK1 né la melanogenesi implicano l'autofosforilazione di PAK1 a Thr 423. Pertanto, abbiamo recentemente studiato se la melanogenesi PAK1-dipendente è bloccata da un potente JAK a base di erbe2- inibitore chiamato cucurbitacina I (CBI) dal melone amaro (Goya) che inibisce direttamente JAK2 (20), e ha scoperto che CBI inibisce ilmelanogenesiin presenza di ormoni melanogeni di oltre il 70 per cento, suggerendo la possibilità che CBI blocchi non solo PAK1 ma anche PAK4 (5). In questo contesto, sarebbe di grande interesse notare che i PAK1-bloccanti a base di erbe come CAPE, curcumina, shikonin e FTY 720 potrebbero inibire la melanogenesi indotta da -MSH nel topo o nelle cellule della pelle umana solo di circa 50 percento anche alle loro concentrazioni in cui PAK1 è quasi completamente bloccato (1,2), mentre il pan-PAK-bloccante sintetico PF3758309, inibendo sia PAK1 che PAK4, abolisce ilmelanogenesinelle cellule della pelle di circa il 90 percento a 300 nM (8). In altre parole, il sistema melanogenico indotto da -MSH nei melanociti potrebbe distinguere i bloccanti PAK1-specifici dai bloccanti pan PAK. Finora non sono stati identificati bloccanti specifici per PAK4-a base di erbe (diversi dai siRNA specifici per PAK4-). Tuttavia, è stato recentemente dimostrato che un quassinoide molto potente chiamato glaucarubinone derivato da un albero amaro coltivato nelle giungle amazzoniche blocca sia PAK1 che PAK4, inibendo la crescita delle cellule tumorali del pancreas sia in vitro che in vivo (21). Pertanto, sarebbe di grande interesse verificare se questo PAK-bloccante a base di erbe sopprime quasi completamente la melanogenesi delle cellule della pelle come fa PF3758309.

L'obiettivo principale di questo studio era di concentrarsi sul ruolo melanogenico specifico di PAK1 e non di indagare in dettaglio come PAK1 attiva la via di segnalazione melanogenica inclusi enzimi melanogenici e MTF. Tuttavia, è molto probabile che PAK1 attivi direttamente la beta-catenina fosforilando a Ser 675, portando all'attivazione di MITF che è essenziale per l'espressione di geni che codificano per enzimi melanogenici cometirosinasi(Tiro).

Recentemente abbiamo scoperto che è coinvolta anche la PAK4 (CDC42-dipendente chinasi 4).melanogenesidella stessa linea cellulare di melanoma attivando due fattori di trascrizione, CREB e beta-catenina, entrambi essenziali per l'attivazione della MIFT (8). Poiché è noto che CREB è attivato dalla chinasi LIM (22,23) che, come la beta-catenina, è tra i substrati diretti comuni di PAK1 e PAK4 (6,18), è molto probabile che PAK1 e PAK4 condividano lo stesso CREB /beta-catenina-MITF vie di segnalazione per attivare i geni dell'enzima melanogenico.

Tuttavia, le vie del segnale dettagliate che portano all'attivazione -MSH/IBMX-dipendente di PAK1 potrebbero differire in modo significativo da quelle che portano all'attivazione di PAK4, principalmente perché il primo coinvolge il fattore sierico (PDGF). Il siero da solo è in grado di attivare PAK1 (13) e potenzia anche l'attivazione -MSH/IBMX dipendente di PAK1. In altre parole, c'è una chiara sinergia tra il siero e questi ormoni melanogenici sia nell'attivazione di PAK1 chemelanogenesi.

Quella che segue è la nostra ipotesi di lavoro su come questa sinergia potrebbe aver luogo. La principale via di segnalazione che porta all'attivazione di PAK1 è la cascata oncogenica EGFR (recettore del fattore di crescita epidermico)-RAS-PI 3 chinasi-RAC/CDC42-PAK1. Tuttavia, questa cascata da sola non è sufficiente per l'attivazione completa. Ha bisogno di un altro fattore chiamato PIX, una proteina adattatrice SH3 che si lega direttamente al PAK1 attraverso il suo motivo ricco di Pro di 18 aminoacidi chiamato PAK18. L'interazione PIX-PAK1 necessita di una terza proteina chiamata JAK2, una Tyr-chinasi, che fosforila PAK1 a Tyr 285. RAS aumenta la JAK2 attraverso la prolattina. Secondo alcuni risultati precedenti da parte nostra e di altri (13-16), il PDGF (fattore di crescita derivato dalle piastrine) è il principale fattore o i principali fattori sierici melanogenici essenziali per il -MSH/IBMX-indottomelanogenesi, perché attiva il suo recettore (PDGFR) tiro-chinasi che a sua volta trans-attiva l'EGFR (recettore del fattore di crescita epidermico=ErbB1) tiro-chinasi, portando all'attivazione di PAK1 attraverso l'oncogenico RAS-PI3 chinasi-RAC /CDC42 percorso (13). Pertanto, il PDGF nel siero da solo può attivare PAK1 e indurre la melanogenesi fino a metà. Tuttavia, per la piena attivazione della melanogenesi dipendente da PAK1-, è necessario -MSH/IBMX per attivare JAK2 attraverso un percorso cAMP-dipendente (che potrebbe coinvolgere PKA) che alla fine assicura l'interazione PIX-PAK1 (per i dettagli, vedere la figura 6).

In conclusione, qui presentiamo la prima prova biochimica che potrebbe spiegare come una varietà di PAK{0}}bloccanti a base di erbe come CAPE, curcumina e shikonin nelle creme cosmetiche potrebbero contribuire al "sbiancamento della pelle" effetti. Si attende una serie di studi analoghi con melanociti umani per ulteriori prove o conferme.

maca ginseng cistanche

Riferimenti

1. Lee JH, Jang JY, Park C, Kim BW, Choi YH, Choi BT. La curcumina sopprime la melanogenesi stimolata dall'ormone stimolante gli alfa-melanociti nelle cellule B16F10. Int J Mol Med. 2010; 26:101-106.

2. Lee JY, Choi HJ, Chung TW, Kim CH, Jeong HS, Ha KT. L'estere fenetile dell'acido caffeico inibisce la sintesi della melanina indotta dall'ormone stimolante gli alfa-melanociti sopprimendo l'attività di transattivazione del fattore di trascrizione associato alla microftalmia. J Nat Prod. 2013; 76:{7}}.

3. Maruta H. Terapie a base di erbe che bloccano la chinasi oncogenica PAK1: un approccio pratico alle malattie e alla longevità dipendenti da PAK1-. Phytother ris. 2014; 28:656-672.

4. Nguyen BCQ, Taira N, Tawata S. Diversi composti a base di erbe nelle piante di Okinawa inibiscono direttamente la chinasi oncogenica/invecchiamento PAK1. Drug Scov Ther. 2014; 8:238-244.

5. Nguyen BCQ, Be Tu PT, Tawata S, Maruta H. Combination of immunoprecipitation (IP)-ATP_Glo kinase assay e melanogenesi per la valutazione di PAK1-bloccanti potenti e sicuri nella coltura cellulare . Drug Scov Ther. 2015; 9:289-295.

6. He H, Maruta H. Oncogenicità dei PAK e dei loro substrati. In: PAK, chinasi attivate da RAC/CDC42 (p21): verso la cura dei tumori e di altre malattie dipendenti da PAK (Maruta H, ed.). Altro, Oxford, 2013; pag. 23-51.

7. Widlund HR, Horstmann MA, Price ER, Cui J, Lessnick SL, Wu M, He X, Fisher DE. -La crescita del melanoma indotto dalla catenina richiede il fattore di trascrizione associato alla microftalmia target a valle. J Cell Biol. 2002; 158:1079-1087.

8. Yun CY, You ST, Kim JH, Chung JH, Han SB, Shin EY, Kim EG. La p21-chinasi attivata 4 regola in modo critico la melanogenesi attraverso l'attivazione delle vie CREB/MITF e -catenina/MITF. J Invest Dermatol. 2015; 135:1385-1394.

9. Huynh N, Liu KH, Baldwin GS, He H. P21- ha attivato la chinasi 1 stimola la crescita delle cellule del cancro del colon e la migrazione/invasione tramite percorsi dipendenti da ERK e AKT. Biochim Biophys Acta. 2010; 1803:{7}}.

10. Tagliati F, Bottoni A, Bosetti A, Zatelli MC, degli Uberti CE. Utilizzo della tecnologia luminescente per sviluppare un test della chinasi: Cdk4 come sistema modello. J Pharm Biomed Anal. 2005; 39:811-814.11. Yoon NY, Eom TK, Kim MM, Kim SK. Effetto inibitorio dei florotannini isolati da Ecklonia cava sull'attività della tirosinasi dei funghi e sulla formazione di melanina nelle cellule di melanoma B16F10 di topo. J Agric Food Chem. 2009; 57:{10}}.

12. Li X, Guo L, Sun Y, Zhou J, Gu Y, Li Y. La bacaleina inibisce la melanogenesi attraverso l'attivazione della via di segnalazione ERK. Int J Mol Med. 2010; 25:923-927.

13. He H, Levitzki A, Zhu HJ, Walker F, Burgess A, Maruta H. Il fattore di crescita derivato dalle piastrine richiede il recettore del fattore di crescita epidermico per attivare le chinasi della famiglia delle chinasi p21-attivate. J Biol Chem. 2001; 276:26741-26744.

14. Saito Y, Haedeler J, Hojo Y, Yamamoto K, Berk BC. Etero-dimerizzazione del recettore: meccanismo essenziale per la transattivazione del recettore del fattore di crescita epidermico indotto dal fattore di crescita derivato dalle piastrine. Mole Cellule Biol. 2001; 21:6387-6394.

15. Hirobe T, Shibata T, Fujiwara R, Sato K. Il fattore di crescita derivato dalle piastrine regola la proliferazione e la differenziazione dei melanociti umani in modo specifico per lo stadio di differenziazione. J Dermatol Sci. 2016; 83:200-209.

16. Garcez RC, Teixeira BL, Schmitt Sdos S, Alvarez-Silva M, Trentin AG. Il fattore di crescita epidermico (EGF) promuove la differenziazione in vitro delle cellule della cresta neurale in neuroni e melanociti. Cellule Mol Neurobiol. 2009; 29:1087-1091.

17. Roig J, Traugh JA. La p21-proteina chinasi attivata gamma PAK è attivata da radiazioni ionizzanti e altri agenti dannosi per il DNA. Somiglianze e differenze con l'alpha PAK. J Biol Chem. 1999; 274:31119-31122.

18. Buggy JJ. Il legame dell'ormone stimolante gli alfa-melanociti al suo recettore accoppiato alla proteina G sui linfociti B attiva la via Jak/STAT. Biochimica J. 1998; 331:211-216.

19. Hammer A, Oladimeji P, De Las Casas LE, Diakonova M. La fosforilazione della tirosina 285 di PAK1 facilita il turnover dell'adesione e del legame PIX/GIT1. FASEB J. 2015; 29:943-959.

20. Blaskovich MA, Sun J, Cantor A, Turkson J, Jove R, Sebti SM. Scoperta di JSI-124 (cucurbitacina I), un trasduttore selettivo di Janus chinasi/segnale e attivatore dell'inibitore della via di segnalazione della trascrizione 3 con una potente attività antitumorale contro cellule tumorali umane e murine nei topi. Cancro ris. 2003; 63:1270-1279.

21. Yeo D, Huynh N, Beutler JA, Christophi C, Shulkes A, Baldwin GS, Nikfarjam M, He H. Glaucarubinone e gemcitabina riducono sinergicamente la crescita del cancro del pancreas attraverso la down-regulation delle p21-chinasi attivate. Cancro Lett. 2014; 346:{5}}.

22. Dan C, Kelly A, Bernard O, Minden A. I cambiamenti citoscheletrici regolati dalla serina/treonina chinasi PAK4 sono mediati dalla LIM chinasi 1 e dalla cofilina. J Biol Chem. 2001; 276:32115-32121.

23. Yang EJ, Yoon JH, Min DS, Chung KC. La chinasi LIM 1 attiva la proteina legante l'elemento responsiva al cAMP durante la differenziazione neuronale delle cellule progenitrici dell'ippocampo immortalate. J Biol Chem. 2004; 279:8903-8910.