L'embrione di pesce zebra come modello per testare gli effetti protettivi dei composti antiossidanti alimentari

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Astratto: Ilantiossidantel'attività dei composti alimentari è una delle proprietà che genera maggiore interesse, per i suoi benefici per la salute e la correlazione con la prevenzione delle malattie croniche. Questa attività viene solitamente misurata utilizzando saggi in vitro, che non possono prevedere effetti o meccanismi d'azione in vivo. L'obiettivo di questo studio era di valutare gli effetti protettivi in ​​vivo di sei composti fenolici (naringenina, apigenina, rutina, oleuropeina, acido clorogenico e curcumina) e tre carotenoidi (licopene B, -carotene e astaxantina) naturalmente presenti negli alimenti utilizzando un modello di embrione di pesce zebra. L'embrione di pesce zebra è stato pretrattato con ciascuno dei nove composti antiossidanti e quindi esposto a tertbutil idroperossido (tBOOH), un noto induttore dilo stress ossidativonel pesce zebra. Differenze significative sono state determinate confrontando la concentrazione-risposta della letalità e della dismorfogenesi indotte da tBOOH rispetto agli embrioni pretrattati con ilantiossidantecomposti. È stato riscontrato un effetto protettivo di ciascun composto, ad eccezione del -carotene, contro la letalità indotta dallo stress ossidativo. Inoltre, anche l'apigenina, la rutina e la curcumina hanno mostrato effetti protettivi contro la dismorfogenesi. D'altra parte, -carotene ha mostrato una maggiore letalità e dismorfogenesi rispetto al solo trattamento con tBOOH.

Parole chiave: lo stress ossidativo; embrione di pesce zebra; effetto antiossidante; polifenoli; carotenoidi

1. Introduzione

Le specie reattive dell'ossigeno (ROS) e le specie reattive dell'azoto (RNS) sono originate durante il metabolismo cellulare. Sono essenziali per un normale stato fisiologico, ma partecipano a processi patologici quando in eccesso [1]. Gli organismi aerobici hanno difese per prevenire il danno ossidativo indotto da ROS, coinvolgendoantiossidanteenzimi e/o meccanismi non enzimatici, inclusi composti antiossidanti prodotti per via endogena o l'ingestione di antiossidanti nella dieta [2].
Lo squilibrio, quando la concentrazione di specie reattive è superiore alantiossidantedifese dell'organismo, si chiamalo stress ossidativo(OS) [3]. Le conseguenze dell'OS includono il reclutamento dei macrofagi; l'inibizione del normale funzionamento di lipidi e proteine; e danno mitocondriale, di membrana e del DNA [4–7]. Queste alterazioni sono state correlate con diverse patologie, come cancro, invecchiamento, diabete, artrite reumatoide e malattie cardiovascolari e neurodegenerative, tra le altre [8-11].

Diversi studi hanno scoperto che un organismo richiede l'assunzione di antiossidanti attraverso la dieta per ridurre il danno ossidativo [12] in situazioni fisiopatologiche (dovute all'esposizione ai raggi UV, al fumo, all'aria inquinata, ecc.), che producono ROS in eccesso. Vari antiossidanti vengono ingeriti attraverso la dieta, come composti fenolici, vitamine, carotenoidi eflavonoidi. Il termine "composti fenolici" si riferisce a qualsiasi sostanza con un gruppo fenolico attaccato a strutture aromatiche o alifatiche. I composti fenolici provengono dalle piante e sono tra i più importanti metaboliti secondari; la loro presenza nel regno animale è dovuta al loro consumo attraverso la dieta. Tra questi composti,flavonoidisono i più studiati e abbondanti; le loro strutture chimiche contengono aflavonoidenucleo costituito da 15 atomi di carbonio disposti in tre anelli (C6–C3–C6) [13]. I loro meccanismi antiossidanti includono l'inibizione degli enzimi o la chelazione degli oligoelementi coinvolti nella produzione di radicali liberi, l'assorbimento dei ROS e la protezione delle difese antiossidanti endogene [14]. La mediaflavonoidel'assunzione è stimata in 23 mg/die [15,16] e le fonti primarie sono tè nero, vino rosso, cipolle, mele e birra [17,18].

Un altro gruppo di composti che sono stati studiati per la loro attività antiossidante sono i carotenoidi. Sono pigmenti le cui strutture comprendono una serie di legami C {0}} C coniugati (poliene), che consentono loro di interagire con i radicali liberi; pertanto, possono agire come efficaci antiossidanti [19]. I carotenoidi sono ampiamente distribuiti nei sistemi naturali ed è stato studiato il loro ruolo nella prevenzione di diverse malattie, principalmente per i composti presenti nella dieta come -carotene, luteina e licopene [18,20,21].

Identificazione dei ruoli diantiossidantinelle malattie e nei disturbi correlati ai processi ossidativi è essenziale per analizzare gli effetti protettivi in ​​vivo. Per questo motivo, il nostro laboratorio ha sviluppato un modello di embrione di pesce zebra (ZF) per valutare gli effetti protettivi di questiantiossidantecomposti [22].Lo stress ossidativoviene indotto utilizzando tertbutil idroperossido (tBOOH). tBOOH genera radicali butossilici attraverso la reazione di Fenton [23]. I radicali formati favoriscono l'esaurimento intracellulare dei gruppi tiolici e delle riserve di glutatione, producendo un aumento significativo della letalità e della dismorfogenesi negli embrioni di pesce zebra esposti. Questo modello permette un confronto tra le curve concentrazione-effetto di letalità e dismorfogenesi per embrioni di pesce zebra esposti a tBOOH e le curve di embrioni pretrattati con antiossidanti; l'analisi statistica può essere eseguita per esplorare l'effetto protettivo del composto antiossidante analizzato.

L'obiettivo del presente lavoro era di valutare gli effetti protettivi in ​​vivo dei composti alimentari con attività antiossidante contro la tossicità dello sviluppo indotta da ossidanti negli embrioni di pesce zebra.

2. Risultati

2.1. Curve dell'effetto di concentrazione per tBOOH negli embrioni di pesce zebra

Il nostro gruppo di ricerca ha precedentemente sviluppato e convalidato un embrione ZFlo stress ossidativomodello con cui valutare l'attività protettiva diantiossidantesostanze (22).

Gli embrioni di pesce zebra sono esposti all'idroperossido di tertbutil (tBOOH) per ottenere le curve di letalità e dismorfogenesi. Gli embrioni di pesce zebra sono esposti a tBOOH da 24 a 48 h dopo la fecondazione (hpf) a diverse concentrazioni, che vanno da 1 a 3,5 mM (Figura 1). La concentrazione letale 50 (LC50) è risultata essere 2,1 mM, mentre la concentrazione effettiva 50 per la dismorfogenesi (EC50) era 1,7 mM. Le curve sopra menzionate sono state utilizzate per confrontare gli embrioni di pesce zebra precedentemente esposti o meno a composti antiossidanti, dopodiché sono stati esposti a tBOOH.

2.2. Identificazione degli effetti protettivi dei composti antiossidanti negli embrioni di pesce zebra

Il modello di pesce zebra precedentemente descritto è stato utilizzato per valutare gli effetti protettivi di sei polifenoli e tre carotenoidi presenti negli alimenti.

Dei sei polifenoli, tre lo eranoflavonoidi: naringenina (20 μM), apigenina (10 μM) e rutina (10 μM). I treflavonoidiha prodotto una deriva significativa nelle curve concentrazione-risposta per la letalità. Inoltre, l'apigenina e la rutina hanno mostrato effetti protettivi contro la dismorfogenesi, mentre la naringenina non ha mostrato alcun effetto protettivo contro la dismorfogenesi (Figura 2).

Sono stati analizzati anche l'oleuropeina (15 μM), l'acido clorogenico (20 μM) e la curcumina (15 μM). Questi polifenoli hanno provocato una deriva significativa nelle curve concentrazione-risposta per la letalità. Solo la curcumina ha mostrato un effetto protettivo contro la dismorfogenesi (Figura 3).

Inoltre, sono stati valutati i carotenoidi licopene （20 μM）, astaxantina （20 μM） e -carotene （25 μM）. Il licopene e l'astaxantina hanno determinato una deriva significativa nelle curve concentrazione-risposta per la letalità. Al contrario, nessuno dei carotenoidi ha mostrato un effetto protettivo contro la dismorfogenesi (Figura 4). Inoltre, il -carotene ha provocato una deriva verso sinistra nelle curve di letalità e dismorfogenesi, che potrebbe indicare un possibile effetto proossidante.

3. Discussione

L'ossigeno è essenziale per la vita umana; tuttavia, allo stesso tempo, produce sostanze tossiche, come i radicali liberi e le specie reattive dell'ossigeno (ROS); queste sostanze sono ossidanti, instabili e reattive. Inoltre, possono reagire con qualsiasi macromolecola e causare danni cellulari [24]. Per contrastare queste sostanze ossidanti, l'organismo impiega enzimi antiossidanti, come la superossido dismutasi e la glutatione perossidasi, e composti antiossidanti derivati ​​dalla dieta. Pertanto, lo studio della capacità antiossidante dei composti ha suscitato interesse negli ultimi anni. Esistono diverse tecniche in vitro per determinare l'attività antiossidante, anche se presentano limitazioni dal punto di vista nutrizionale poiché nessuna riproduce una situazione fisiologica [25]. Per questo motivo, un metodo che includa tecniche in vivo porterebbe a risultati più impattanti, perché lo stress ossidativo implica meccanismi che dipendono da molte condizioni del sistema, in particolare le parti cinetiche delle reazioni. Il nostro team ha utilizzato un modello di embrione ZF [22], che potrebbe essere un prezioso metodo in vivo, per testare gli effetti protettivi di nove composti antiossidanti che sono stati ampiamente studiati in vitro. Abbiamo valutato sei composti fenolici e tre carotenoidi. I composti fenolici rappresentano un importante contributo al potenziale antiossidante della dieta umana; di questi composti, i flavonoidi sono i più studiati e abbondanti. È stata studiata l'attività antiossidante dei flavonoidi apigenina, rutina e naringenina. Questi flavonoidi sono composti bioattivi che si trovano principalmente in vari frutti, piante e verdure, noci e cipolle. Studi in vitro hanno dimostrato che questi flavonoidi neutralizzano efficacemente i radicali idrossilici, il superossido, il perossido di idrogeno, i radicali dell'ossido nitrico, il DPPH e la perossidazione lipidica [26-29]. Chen et al., nel 2012 [30], hanno eseguito un'analisi QSAR utilizzando un modello di larva di pesce zebra per valutare le capacità di scavenging dei ROS di quindici flavonoidi, inclusa la rutina, contro la fototossicità indotta dai raggi UV. In accordo con studi precedenti, hanno concluso l'importanza dei due gruppi ossidrile e delle loro posizioni, con almeno due gruppi ossidrilici necessari per una forte attività biologica [30,31]. Inoltre, è stato determinato che i gruppi idrossilici nelle posizioni C3, C5 e C7 conferiscono una migliore stabilità e attività dei flavoni [31]. I nostri risultati hanno mostrato un effetto protettivo contro la letalità indotta da tBOOH per i tre flavonoidi. Anche l'apigenina e la rutina hanno mostrato effetti protettivi contro la dismorfogenesi; tuttavia, la naringenina non ha mostrato alcun effetto contro la dismorfogenesi.

Oltre a quelli dei flavonoidi, sono stati valutati anche gli effetti antiossidanti dell'oleuropeina, dell'acido clorogenico e della curcumina. Studi in vitro e in vivo hanno dimostrato che questi

tre composti fenolici hanno importanti effetti antiossidanti [32–34]. L'oleuropeina è un biofenolo presente nelle foglie di olivo, nell'olio extra vergine di oliva e in alcune specie della famiglia delle Oleaceae [32]. Gli acidi clorogenici (CGA) sono esteri formati tra acido caffeico e acido chinico e rappresentano un gruppo di polifenoli presenti nella dieta umana [35]. Diversi studi hanno dimostrato che bere bevande contenenti CGA come caffè, tè, vino e vari succhi di frutta riduce il rischio di sviluppare diverse malattie croniche [36-38]. Uno dei motivi di questa riduzione è la capacità antiossidante dei CGA, che donano atomi di idrogeno per ridurre i radicali liberi e inibire le reazioni di ossidazione [35]. La curcumina è un polifenolo utilizzato per la colorazione e il condimento dei prodotti alimentari. La sua attività antiossidante è stata studiata negli ultimi anni e uno studio suggerisce che può proteggere le biomembrane dal danno perossidativo [39]. Utilizzando il modello embrionale ZF, è stato osservato che il pretrattamento con oleuropeina, acido clorogenico o curcumina riduceva l'effetto di induzione della mortalità dello stress ossidativo indotto da tBOOH; tuttavia, un significativo effetto protettivo contro la dismorfogenesi è stato osservato solo per la curcumina.

Un altro gruppo con proprietà antiossidanti sono i carotenoidi, un gruppo onnipresente di pigmenti isoprenoidi. Sono quencher di ossigeno singoletto e scavenger di ROS [40]. I meccanismi molecolari alla base dell'attività antiossidante e proossidante dei carotenoidi non sono ancora del tutto chiari. Tra i carotenoidi più studiati ci sono il licopene e il -carotene. Questi possono essere trovati in abbondanza nei pomodori, nella salsa di pomodoro, nella frutta varia, nelle alghe e nelle verdure [18,41]. Nel valutare gli effetti protettivi di questi caroteni, si è riscontrato che il licopene mostrava attività antiossidante, con effetto protettivo contro la letalità embrionale; tuttavia, non è stato riscontrato alcun effetto contro la dismorfogenesi. D'altra parte, il -carotene ha aumentato l'incidenza di letalità e dismorfogenesi negli embrioni ZF rispetto all'effetto del solo ossidante; ciò è in accordo con studi che hanno dimostrato che alte dosi di -carotene hanno effetti antiossidanti seguiti da un'azione proossidante ad alta tensione di ossigeno, che può essere correlata ai suoi effetti avversi [42]. Inoltre, uno studio ha dimostrato che l'integrazione di -carotene non ha avuto alcun effetto protettivo sulla mortalità totale dei fumatori maschi diabetici rispetto a un placebo [43]. Un altro carotenoide valutato era l'astaxantina; è un carotenoide xantofillico che si trova in alghe, lievito, salmone, trota, krill, gamberi e gamberi. È un pigmento antiossidante rosso liposolubile che non ha attività pro-vitamina A [44]. Nel nostro studio, l'astaxantina ha mostrato un effetto protettivo contro la letalità, ma non è stato riscontrato alcun effetto contro la dismorfogenesi.

In conclusione, otto delle nove molecole valutate hanno mostrato attività antiossidante con effetti protettivi contro la letalità embrionale ZF. Solo l'apigenina (10 µM), la rutina (10 µM) e la curcumina (15 µM) hanno inoltre mostrato effetti protettivi contro la dismorfogenesi derivante dallo stress ossidativo indotto da tBOOH. Al contrario, si è riscontrato che il -carotene produceva l'effetto opposto, aumentando il tasso di mortalità e dismorfogenesi perché riduceva i valori di LC50 ed EC50. L'equilibrio e la tempistica delle forze ossidative e antiossidanti sono fondamentali per la corretta regolazione e tempistica dello sviluppo embrionale [45]. Le differenze nella cinetica o nel meccanismo d'azione di questi antiossidanti potrebbero essere la ragione principale delle diverse capacità protettive contro la dismorfogenesi. Sono necessari ulteriori studi per esplorare il motivo per cui solo alcuni composti hanno mostrato effetti protettivi sulla morfogenesi durante lo sviluppo embrionale. Questo studio ha cercato di discriminare tra effetto embriotossico (letalità) ed effetto dismorfogenesi (teratogenicità). In alcuni casi, è probabile che le malformazioni precedano e provochino la morte. In altri casi, letalità e malformazione possono essere dovute a cause diverse. L'indipendenza di queste due manifestazioni sarebbe sospettata se un composto aumentasse la separazione tra le curve concentrazione-risposta letale e dismorfogenesi. Tutti i composti antiossidanti testati nel nostro studio non hanno aumentato l'effetto teratogeno rispetto alla dose letale più di due volte; pertanto, non è stato osservato un aumento del potenziale teratogeno per alcun composto antiossidante [46].

Complessivamente, questi risultati indicano che questo modello di embrione ZF è uno strumento prezioso con cui analizzare gli effetti protettivi delle molecole antiossidanti che costituiscono il cibo. Per determinare le ragioni chimico-strutturali per le quali apigenina, rutina e curcumina hanno mostrato i maggiori effetti protettivi nel nostro studio, sono necessarie ulteriori analisi; ad esempio, per determinare le relazioni quantitative struttura-attività (QSAR).

4. Materiali e metodi

4.1. Dichiarazione etica

Le procedure che coinvolgono larve ed embrioni di pesce zebra sono state autorizzate dal Comitato etico animale dell'Università di Barcellona, ​​numero di autorizzazione o protocollo 7971 del Dipartimento per l'allevamento e la pesca del governo della Catalogna (ProceduraDAAM 7971).

4.2. Sostanze chimiche e soluzioni

PreparazioneTert-butil idroperossido (tBOOH, numero CAS: 75-91-2) e i composti antiossidanti sono stati acquisiti da TCI Europe. tBOOH è stato disciolto in 0.3X buffer di Danieleau (17,4 mM NaCl; 0.23 mM KCl; 0.12 mM MgSO4·7 H2O; 0.18 mM Ca (NO3)2; 1,5 mM HEPES(N-({20}}idrossietil) piperazina-N0 -(2-acido etansolfonico); pH 7,4).

Naringenina (20 µM) (numero CAS: 67604-48-2), oleuropeina (15 µM) (numero CAS:32619-42-4), rutina (10 µM) (numero CAS : 207671-50-9), acido clorogenico (20 µM) (numero CAS: 327-97-9), apigenina (10 µM) (numero CAS: 520-36-5), curcumina (15 µM) (numero CAS: 458-37-7), licopene (20 µM) (numero CAS: 502-65-8), astaxantina (20 µM) (numero CAS: 472-61-7) e -carotene (25 µM) (numero CAS: 7235-40-7) sono stati acquisiti da Sigmar-Aldrich®. Gli antiossidanti sono stati disciolti in dimetilsolfossido al 100% (DMSO, Sigma Aldrich, Madrid, Spagna) e successivamente diluiti in 0,3 × tampone Danieleau a una concentrazione fifinalDMSO dello 0,05% (v/v). Gli antiossidanti sono stati utilizzati a diverse concentrazioni, a seconda della concentrazione più alta alla quale non è stato osservato alcun effetto sulla letalità o sullo sviluppo embrionale (concentrazione massima tollerabile, MTC)

4.3. Manutenzione di Zebrafifish e produzione di uova

Il pesce zebra adulto di tipo selvatico è stato ospitato in condizioni standardizzate. Gli embrioni sono stati raccolti, puliti e selezionati in base alla loro vitalità. Gli embrioni fecondati sono stati trattati con acqua standardizzata secondo gli standard dell'Organizzazione internazionale per la standardizzazione (ISO) 7346-1 e 7346-2 (ISO, 1998; 2 mM CaCl2·2H2O, 0.5 mM MgSO4 ·7H2O, 0.75 mM NaHCO3 e 0.07 mM KCl). Le uova fecondate sono state messe in scena secondo studi precedenti di Kimmel et al., 1995 [47], e selezionate per la successiva esposizione sotto uno stereomicroscopio da dissezione (Motic SMZ168, Motic China Group, LTD., Luwan, Shanghai, Cina). Gli embrioni di pesce sono stati conservati in fiale di vetro a una temperatura controllata di 27 ± 1 ◦C.

4.4. Esposizione degli embrioni di pesce zebra allo stress ossidativo (terz-butil idroperossido)

Per la preparazione della curva tBOOH è stata seguita la metodologia di Boix, 2020. Questa metodologia si basa sull'ottenimento di una curva di risposta concentrazione-letalità (LC50) e dismorfogenesi (EC50) esponendo gli embrioni ZF a un induttore di stress ossidativo, tertbutil idroperossido (tBOOH). Una volta ottenuti gli embrioni di pesce zebra, vengono mantenuti nel mezzo di Danieleau 0,3X da 0 a 24 hpf. Da 24 a 48 hpf, gli embrioni sono esposti a soluzioni di tBOOH a diverse concentrazioni, di 1, 1,5, 2, 2,5, 3 e 3,5 mM. Sono stati utilizzati embrioni da 3 diverse frizioni di pesce zebra in triplice copia (Figura 5A).

4.5. Determinazione degli effetti protettivi dei composti antiossidanti

Per stabilire se un composto avesse un effetto protettivo contro lo stress ossidativo, gli embrioni di pesce zebra sono stati prima esposti al composto antiossidante da 0 a 24 hpf. Le concentrazioni sono state calcolate in base ai saggi di concentrazione massima tollerabile. Quindi, da 24 a 48 hpf, gli embrioni sono stati esposti all'induttore di stress, tBOOH. Successivamente, ogni gruppo di embrioni è stato valutato a ciascuna delle concentrazioni di tBOOH (Figura 5B). Per determinare se c'era una differenza significativa, sono state confrontate la curva per l'esposizione al solo tBOOH e la curva per la pre-esposizione al composto antiossidante.

Dieci uova fecondate sono state esposte a 2,5 ml per ciascuna sostanza e concentrazione. Sono state eseguite tre repliche indipendenti, utilizzando uova di diversi eventi di deposizione delle uova. Gli embrioni ZF sono stati pre-esposti ai composti antiossidanti per 24 ore, quindi la soluzione antiossidante è stata rimossa, il lavaggio è stato eseguito utilizzando il mezzo di Danieau e gli embrioni ZF sono stati esposti a diverse concentrazioni di tBOOH. La letalità è stata valutata dopo 48 h e la media degli embrioni morti è stata calcolata dopo i saggi appropriati. Per la valutazione della dismorfogenesi, abbiamo seguito il sistema di punteggio descritto da Teixido et al. [48] ​​per calcolare la dismorfogenesi degli embrioni a circa 48 hpf. Abbiamo selezionato nove caratteristiche morfologiche, descritte nella Tabella 2. È stata calcolata la frequenza degli embrioni anormali (definiti come gli embrioni con un punteggio di 1 in qualsiasi caratteristica morfologica) per ciascuna concentrazione e gruppo trattato.

Uno spostamento della curva concentrazione-risposta verso destra a causa della pre-esposizione agli antiossidanti indica un effetto protettivo contro l'induttore di stress ossidativo poiché è necessaria una maggiore concentrazione di induttore per ottenere gli stessi risultati di quelli con esposizione al solo tBOOH. A causa della pre-esposizione agli antiossidanti, uno spostamento a sinistra della curva concentrazione-risposta implica un aumento dello stress ossidativo.

4.6.Analisi statistica

Le curve concentrazione-risposta per mortalità e dismorfogenesi sono state calcolate e valutate utilizzando GraphPad 7.02 Software Inc. Il test F extra-somma dei quadrati è stato utilizzato per confrontare l'adattamento dei parametri di ciascun gruppo di dati della curva. L'intervallo di confidenza è stato regolato al 95%.

5. Conclusioni

Questo studio ha utilizzato embrioni di pesce zebra come organismo modello per testare la capacità protettiva di sei composti fenolici e tre carotenoidi che si trovano comunemente negli alimenti. Tutti i composti, ad eccezione del -carotene, hanno mostrato effetti protettivi contro la letalità indotta da stress ossidativo. Inoltre, apigenina, rutina e curcumina hanno anche mostrato effetti protettivi contro la dismorfogenesi indotta da tBOOH. Proponiamo che un test dell'embrione di pesce zebra, come presentato qui, possa essere applicato per valutare gli effetti protettivi in ​​vivo di nuovi componenti alimentari bioattivi con potenziale capacità antiossidante.

Cristina Arteaga 1,20, Nuria Boix13,Elisabet Teixido 13⑤,Fernanda Marizande 2,Santiago Cadena4 e Alberto Bustillos 5,*

1 Unità di Tossicologia, Dipartimento di Farmacologia, Tossicologia e Chimica Terapeutica, Scuola di Farmacia,

Università di Barcellona, ​​Avda Joan XXIIs/n,08028Barcellona, ​​Spagna;

2 Facoltà di Scienze della Salute, Nutrizione e Dietetica, Università Tecnica di Ambato, Ambato 180207, Ecuador;

3 INSA-UB Nutrition and FoodSafety Research Institute, Food, and Nutrition Torribera Campus,

L'Università di Barcellona, ​​Prat de la Riba 171, 08921 Santa Coloma de Gramenet, Spagna

4 Facoltà di Scienze Applicate, Università Internazionale SEK, Quito 170134, Ecuador;

5Facoltà di Scienze della Salute, Medicina, Università Tecnica di Ambato, Ambato 180207

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