Effetto terapeutico e meccanismo dei glicosidi di feniletanolo Cistanche sulla spermatogenesi indotta da ciclofosfamide nei topi

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ZHAODong-hai1, ZHANGLei2, ZHANGYan3, QILing1, ZOU Xiang-ming4

[Riepilogo]

Scopo:Per esplorare l'effetto terapeutico diCistanche glicosidi feniletanoidisu topi con spermatogenesi indotta da ciclofosfamide e per chiarirne preliminarmente il meccanismo d'azione.Metodo:Metodo di estrazione dell'etanolo da estrarreCistanche glicosidi feniletanoidi. Quaranta topi BALB/C sono stati divisi casualmente in un gruppo di controllo, un gruppo modello, un basso dosaggioCistanche feniletanoide glicosidegruppo (50 mg·kg-1) e un gruppo ad alto dosaggio (100 mg·kg-1), con 10 topi in ciascun gruppo. Fatta eccezione per il gruppo di controllo, i topi degli altri gruppi sono stati iniettati con ciclofosfamide (80 mg·kg-1) ogni giorno per 5 giorni consecutivi per preparare modelli murini di disturbi della spermatogenesi. Dopo l'ultima somministrazione, i topi nei gruppi a basso dosaggio e ad alto dosaggio diCistanche glicosidi feniletanoidisono state somministrate le dosi corrispondenti mediante sonda gastrica e ai topi del gruppo di controllo e del gruppo modello è stato somministrato lo stesso volume di soluzione fisiologica normale mediante sonda gastrica, una volta al giorno per 30 giorni. Ventiquattro ore dopo l'ultima sonda gastrica, è stato prelevato il tessuto del testicolo del topo. Un test di immunoassorbimento enzimatico è stato utilizzato per determinare il livello di testosterone nell'omogenato di tessuto testicolare di topo. Sono state confrontate la densità degli spermatozoi, la motilità degli spermatozoi e il tasso di anomalie degli spermatozoi di ciascun gruppo. I cambiamenti morfologici del tessuto testicolare sono stati osservati mediante colorazione HE. Risultati: rispetto al gruppo di controllo, la densità spermatica e il tasso di motilità degli spermatozoi del gruppo modello sono diminuiti (P<0.01), the="" rate="" of="" sperm="" deformity="" increased=""><0.01), and="" the="" level="" of="" testosterone="" in="" the="" testicular="" tissue="" homogenate="" decreased=""><0.01). 0.01);="" compared="" with="" the="" model="" group,="" the="" sperm="" density="" and="" sperm="" motility="" of="" mice="" in="" each="" dose="" group="" of="">Cistanche glicosidi feniletanoidisono stati significativamente aumentati (P<0.01), the="" rate="" of="" sperm="" deformity="" decreased=""><0.01), and="" the="" testicular="" tissue="" the="" level="" of="" testosterone="" in="" the="" homogenate="" increased=""><0.05 or=""><0.01). histological="" observations="" showed="" that="" the="" seminiferous="" tubules="" in="" the="" testis="" of="" the="" model="" group="" were="" atrophied="" and="" degenerated,="" the="" seminiferous="" epithelium="" was="" significantly="" thinner,="" the="" arrangement="" of="" spermatogenic="" cells="" was="" disordered,="" and="" the="" number="" of="" sperm="" in="" the="" cavity="" decreased;="" the="" number="" of="" the="" seminiferous="" epithelium="" in="" the="" testes="" of="" the="">Cistanche feniletanoide glicosidegruppo aumentato in modo significativo, gli strati sono distinti, le cellule spermatogeniche sono disposte ordinatamente, strettamente e regolarmente e lo sperma può essere visto nel lume.Conclusione: Cistanche glicosidi feniletanoidihanno un effetto terapeutico significativo sul disturbo della spermatogenesi causato dalla ciclofosfamide nei topi e il suo meccanismo può essere correlato al miglioramento dei livelli di testosterone nei tessuti testicolari.

[Parole chiave]Cistanche glicosidi feniletanoidi; ciclofosfamide; disturbo della spermatogenesi; topi, BALB/C

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A causa dell'accelerazione del ritmo sociale, delle cattive abitudini di vita, dell'inquinamento ambientale e di altri fattori, la qualità anormale dello sperma come l'oligospermia e l'astenospermia sono diventate la causa principale dell'infertilità maschile [1]. Al momento, ci sono meno farmaci per il trattamento dell'oligospermia e dell'astenospermia e l'effetto terapeutico non è evidente. Le prescrizioni o i principi attivi della medicina tradizionale cinese hanno buoni effetti nel migliorare la funzione riproduttiva maschile [2-6]. Tuttavia, a causa dell'ampia varietà di farmaci da prescrizione, la relazione tra gli effetti farmacologici e gli ingredienti efficaci del farmaco non è chiara, il che limita la promozione e l'applicazione dei farmaci spermatogeni. La ricerca e lo sviluppo degli ingredienti efficaci della medicina cinese e lo studio dei suoi effetti terapeutici nel danno riproduttivo hanno un buon valore applicativo.Cistanche glicosidi feniletanoidisono uno dei principi attivi più importantiCistanche desertiche. Di solito sono glicosidi naturali contenenti legami estere e legami oxo-glicosidici con -glucosio come nucleo. Si trovano ampiamente nelle piante dicotiledoni [7]. Gli studi [8] lo hanno dimostratoCistanchefeniletanoideglicosidipuò proteggere lo sperma di ratto dal danno ossidativo in vitro, ma non ci sono segnalazioni sulla sua spermatogenesi. Questo esperimento studia l'effetto terapeutico dei glicosidi feniletanoidi Cistanche sulla funzione spermatogenica di topi con spermatogenesi indotta da ciclofosfamide e fornisce una base sperimentale e teorica per l'applicazione diCistanche glicosidi feniletanoidinel trattamento dei disturbi della spermatogenesi.

1. Materiali e metodi

1.1. Animali da laboratorio, reagenti principali e strumenti

40 topi BALB/C adulti di classe SPF, di 6-8 settimane, con una massa corporea di 20-22 g, sono stati acquistati dall'Animal Experimental Center della Jilin University School of Basic Medicine e il numero di certificato dell'animale : SCXK (Kirghizistan) 2008-005. I topi sono stati allevati in modo adattivo per 5 giorni prima dell'esperimento. Condizioni di alimentazione: 22 gradi ~ 25 gradi, ritmo circadiano (12h/12h), acqua potabile e cibo gratuiti. Cistanche è un prodotto della Xinjiang Dakang Trading Company. La ciclofosfamide per iniezione è stata acquistata da Jiangsu Hengrui Pharmaceutical Co., Ltd. (numero di lotto 11061921). Il kit di test immunoenzimatico per il testosterone omogenato del tessuto testicolare è stato acquistato da Tianjin Jiuding Medical Bioengineering Co., Ltd. (numero di lotto) 20120812), gli altri reagenti sono tutti di grado analitico di produzione nazionale. Lettore di micropiastre PLUS384 (MDC negli Stati Uniti), microscopio invertito TE2000U (Nikon, Giappone) e centrifuga J-26XP (Nanodrop, Stati Uniti).

1.2 Preparazione di Cistanche Feniletanolo Glucoside

10 g di polvere di cistanche sono stati estratti mediante riflusso con 70% di etanolo, due volte, 2 ore ogni volta, per ottenere il concentrato di glicoside di alcol fenetilico. La soluzione concentrata è stata cromatografata sulla colonna di resina macroporosa D101 ed eluita con 70% di etanolo per ottenere l'alcool fenecoside Cistanche. Lo spettrofotometro UV ha identificato l'estratto a una lunghezza d'onda di 333 nm.

1.3 Preparazione del modello animale e metodo di somministrazione del farmaco

Dopo che 40 topi BALB/C maschi sono stati nutriti in modo adattativo per 5 giorni, i topi sono stati divisi casualmente in 4 gruppi (10 topi in ciascun gruppo): gruppo di controllo, gruppo modello, CistancheCistanche glicosidi feniletanoidigruppo a basso dosaggio, eCistanche glicosidi feniletanoidigruppo ad alto dosaggio. Fatta eccezione per il gruppo di controllo, agli altri tre gruppi di topi è stata somministrata un'iniezione intraperitoneale di ciclofosfamide 80 mg·kg-1 per ciascun topo per 5 giorni consecutivi per preparare modelli animali di disturbi della spermatogenesi. Dopo che il modello è stato preparato, i topi nei gruppi a basso e ad alto dosaggio diCistanchefeniletanoide sono stati somministrati rispettivamente 50 e 100 mg·kg-1·d-1. Ai topi del gruppo di controllo e del gruppo modello sono stati somministrati volumi uguali di soluzione fisiologica normale. Una volta al giorno per 30 giorni. Tutti i topi sono stati sacrificati 24 ore dopo l'ultima somministrazione del farmaco e sono stati effettuati test bilaterali. Il testicolo destro è stato fissato con formaldeide. L'epididimo e il testicolo sono stati prelevati dal lato sinistro. Il testicolo è stato omogeneizzato e centrifugato a 3,{7}} min per 10 min. Il supernatante è stato prelevato e conservato in una ghiacciaia a -20 gradi per il test. L'epididimo sinistro è stato testato per la densità degli spermatozoi, la motilità degli spermatozoi e il tasso di deformità.

1.4 Determinazione della densità degli spermatozoi, della motilità degli spermatozoi e del tasso di deformità

Mettere una provetta contenente 10 ml di soluzione nutritiva per lo sperma [9] in un bagno d'acqua a temperatura costante per preriscaldarla a 37 gradi, prendere un epididimo unilaterale per rimuovere il tessuto connettivo e il grasso, tagliare il tessuto e metterlo in una provetta a 37 gradi per 10 minuti Dopo che lo sperma è completamente libero, prendere 1 goccia sulla piastra per il conteggio dei globuli e calcolare la densità dello sperma secondo il metodo di conteggio delle cellule. Il risultato è espresso come numero di spermatozoi per millilitro; inoltre, prelevare 5μL di sospensione spermatica e la stessa quantità di eosina-Y dalla provetta. Mescolare bene, metterlo a temperatura ambiente per 10 minuti, aggiungere un vetrino coprioggetto e osservare con un microscopio ottico. Gli spermatozoi morti sono colorati di rosa, gli spermatozoi vivi non sono colorati e il citoplasma è trasparente. Ogni campione conta 200 spermatozoi, calcola la vitalità degli spermatozoi, il risultato è espresso in percentuale, vitalità degli spermatozoi=un numero di spermatozoi vivi / il numero totale di spermatozoi × 100 percento . Altri 5 μL di sospensione di spermatozoi sono stati fissati in metanolo per 5 minuti, asciugati e colorati con una soluzione acquosa di eosina al 2% per 1 ora, risciacquati e asciugati con il phon. Cerca le parti con una minore sovrapposizione di spermatozoi sotto una lente a bassa potenza e usa una lente ad alta potenza per controllare la morfologia dello sperma in ordine. Ogni topo ha ispezionato 1,{20}} sperma completo. Le teste degli spermatozoi senza uncini, a forma di banana, amorfe, teste grasse e doppie teste sono state giudicate come deformità. È stato calcolato il tasso di deformità degli spermatozoi e i risultati sono stati espressi in percentuale. Tasso di deformità dello sperma=un numero di spermatozoi deformati / numero totale di spermatozoi × 100 percento.

1.5 Determinazione degli ormoni riproduttivi

Il testicolo è stato staccato dalla membrana e posto in un piatto di fiala e il mezzo di omogeneizzazione preraffreddato (0.01mol·L-1 saccarosio, 0.01mol ·L-1 Tris-HCl, 0,1mmol·L-1 EDTA-Na2 soluzione, pH 7,4), tagliare il tessuto testicolare con forbici oftalmologiche, versarlo in una provetta di omogeneizzazione di vetro e centrifugare a 4, 000×g per 10 minuti a bassa temperatura e prelevare il surnatante, utilizzare il kit di test di immunoassorbimento enzimatico per misurare il livello di testosterone nell'omogeneizzato del tessuto testicolare e testare 3 campioni paralleli per ciascun campione. Le fasi e i metodi sperimentali sono stati completati secondo le istruzioni del kit.

1.6 Osservazione morfologica del testicolo

Prendere sezioni di paraffina del testicolo del topo, colorate con HE, e osservare la distribuzione degli spermatogoni e delle cellule spermatogeniche nel tessuto del testicolo al microscopio ottico.

1.7 Analisi statistica

L'analisi statistica è stata eseguita utilizzando il software statistico SPSS17.0. La densità dello sperma, il tasso di motilità dello sperma, il tasso di deformità dello sperma e il livello di testosterone testicolare dei topi in ciascun gruppo sono stati espressi come x±s e il confronto tra i gruppi è stato eseguito mediante analisi della varianza a fattore singolo.

2. risultati

2.1. Densità spermatica, motilità spermatica e tasso di deformità spermatica di ciascun gruppo di topi

Rispetto al gruppo di controllo, la densità e la vitalità degli spermatozoi del gruppo modello sono diminuite (P<0.01), and="" the="" sperm="" deformity="" rate="" increased=""><0.01). compared="" with="" the="" model="" group,="" the="" sperm="" density="" and="" sperm="" motility="" rate="" of="" mice="" in="" each="" dose="" of="">Cistanche fenossietanolo glicosideaumentato (pag<0.05 or=""><0.01), and="" the="" rate="" of="" sperm="" deformity="" decreased=""><0.05 and=""><0). .01).="" compared="" with="" the="" low-dose="" cistanche="" phenethyl="" alcohol="" glycoside="" group,="" the="" high-dose="" cistanche="" phenethyl="" alcohol="" glycoside="" group="" had="" higher="" sperm="" density="" and="" sperm="" motility=""><0.05), and="" the="" rate="" of="" sperm="" deformity="" decreased=""><0.05). see="" table="">

2.2 Livelli di testosterone nei tessuti del testicolo dei topi in ciascun gruppo

I livelli di testosterone negli omogenati del tessuto testicolare del gruppo di controllo e del gruppo modello erano (10.26±{6}}.57) e (5.33±0.84) nmol·L-1, rispettivamente. Il livello di testosterone del gruppo modello era significativamente inferiore a quello del gruppo di controllo (P<0.01). the="" testosterone="" levels="" in="" the="" testicular="" tissue="" homogenate="" of="" the="" low-dose="" cistanche="" phenethyl="" alcohol="" glycoside="" group="" were="" (7.55±1.21)="" and="" (10.35±0.94)="" nmol·l-1.="" the="" level="" of="" testosterone="" in="" the="" low="" and="" high-dose="" groups="" of="" cistanche="" cistanche="" ethanol="" glycosides="" was="" significantly="" higher="" than="" that="" of="" the="" model="" group=""><0.05 or=""><0.01). the="" testosterone="" level="" in="" the="" testicular="" tissue="" homogenate="" of="" the="">Cistanchecistanche phenethyl glycoside gruppo ad alto dosaggio era significativamente superiore a quello del gruppo a basso dosaggio (P<>

2.3 Morfologia del testicolo di topo in ciascun gruppo

Osservati al microscopio ottico, i tubuli seminiferi nei testicoli del gruppo normale erano densamente disposti, il livello e il numero di cellule germinali erano grandi, l'epitelio seminifero era disposto in modo ordinato e i tubuli seminiferi erano tutti visti con formazione di spermatozoi. Nel gruppo modello, i tubuli seminiferi nei testicoli dei topi erano atrofizzati e degenerati, l'epitelio seminifero era significativamente assottigliato, il numero di strati epiteliali era ridotto, la disposizione era disordinata e il numero di spermatozoi nella cavità era ridotto. Rispetto al gruppo modello, la dose bassa diCistanche glicoside dell'alcool fenetilico.

Nel gruppo aumentava il numero degli strati epiteliali seminiferi dei tubuli seminiferi, la disposizione dell'epitelio era più regolare ed era ovviamente migliorato il danno dei tubuli seminiferi; la struttura dei tubuli seminiferi nell'alto dosaggioCistanche feniletanoide glicosidegruppo è migliorato in modo più significativo e il numero e il numero di strati epiteliali seminiferi sono aumentati in modo significativo. Disposti in modo ordinato, ci sono spermatozoi maturi nei tubuli seminiferi e la struttura è sostanzialmente tornata alla normalità. Vedere la figura 1 (riquadro 6).

3 Discussione

La ciclofosfamide è un farmaco antitumorale e immunosoppressore comunemente usato, che interferisce principalmente con una varietà di funzioni biologiche intracellulari attraverso l'alchilazione del DNA. La tossicità riproduttiva è uno dei principali effetti collaterali della ciclofosfamide [3], che può facilmente portare a danni al DNA degli spermatozoi e allo sviluppo anormale degli spermatozoi. Studi clinici [10-11] indicano che la tossicità riproduttiva della ciclofosfamide può causare azoospermia o oligospermia. , Portando all'infertilità o al verificarsi di difetti genetici o malformazioni nella prole.

Cistanche tubuloseè una pianta parassitaria superiore perenne della famiglia Leiden. È una nota medicina cinese che nutre i reni e lo yang, nutre il sangue e nutre l'intestino. È un farmaco da prescrizione comunemente usato per il trattamento tradizionale della disfunzione riproduttiva maschile [12].Glicosidi feniletanoidisono uno dei componenti attivi più importanti diCistanche[13] e hanno un'ampia gamma di effetti farmacologici, come anti-ossidazione, anti-invecchiamento e antitumorale [14].

In questo studio, la ciclofosfamide è stata utilizzata per preparare un modello murino di disturbo della spermatogenesi ed è stato studiato l'effetto terapeutico dei glicosidi feniletanoidi di Cistanche sul disturbo della spermatogenesi causato dalla ciclofosfamide. I risultati hanno mostrato che rispetto al gruppo normale, la densità spermatica del gruppo modello è diminuita, il tasso di sopravvivenza è diminuito e il tasso di deformità è aumentato. Rispetto al gruppo modello, tutti i gruppi di dosaggio dei glicosidi fenossietanolo Cistanche possono aumentare efficacemente la densità degli spermatozoi, migliorare la motilità degli spermatozoi e ridurre il tasso di deformità degli spermatozoi. I risultati di cui sopra indicano che i glicosidi fenossietanolo cistanchi possono promuovere la spermatogenesi e proteggere il testicolo danneggiato. I risultati della morfologia del testicolo hanno mostrato che dopo il trattamento conCistanche feniletanoide glicoside, il numero dell'epitelio seminifero nel testicolo dei topi modello era significativamente aumentato, gli strati erano distinti, le cellule spermatogeniche erano disposte ordinatamente, strettamente e regolarmente e lo sperma può essere visto nel lume, suggerendo cheCistanche feniletanoidepuò cambiare Shanhe ripristina la struttura e la morfologia dell'epitelio seminifero dopo un danno riproduttivo.

Il testosterone regola la differenziazione delle cellule germinali maschili ed è una condizione necessaria per il normale sviluppo del testicolo e la normale presenza di spermatozoi. Alcuni studi [15] hanno riportato che il knockout selettivo dei recettori degli androgeni nelle cellule del Sertoli del testicolo ha causato disturbi dello sviluppo dello sperma e sterilità maschile. In questo studio, la ciclofosfamide è stata utilizzata per produrre spermatogeni.

Dopo il modello di lesione ad ostacolo, il livello di testosterone nel tessuto testicolare dei topi era significativamente inferiore a quello del gruppo normale. Dopo l'azione dei glicosidi feniletanoidi di Cistanche, i livelli di testosterone in ciascun gruppo di dosaggio sono aumentati e il livello di testosterone nel gruppo ad alto dosaggio era significativamente più alto di quello nel gruppo a basso dosaggio. Si suggerisce che i glicosidi fenossietanolo cistance possano promuovere la spermatogenesi aumentando il livello di testosterone nel tessuto testicolare per trattare la disfunzione spermatogena, ma il meccanismo del suo effetto sul testosterone necessita di ulteriori ricerche e discussioni.

Il testosterone regola la differenziazione delle cellule germinali maschili ed è una condizione necessaria per il normale sviluppo del testicolo e la normale presenza di spermatozoi. Alcuni studi [15] hanno riportato che il knockout selettivo dei recettori degli androgeni nelle cellule del Sertoli del testicolo ha causato disturbi dello sviluppo dello sperma e sterilità maschile. In questo studio, la ciclofosfamide è stata utilizzata per produrre spermatogeni.

Dopo il modello di lesione ad ostacolo, il livello di testosterone nel tessuto testicolare dei topi era significativamente inferiore a quello del gruppo normale. Dopo l'azione diCistanche glicosidi feniletanoidi, i livelli di testosterone in ciascun gruppo di dosaggio sono aumentati e il livello di testosterone nel gruppo ad alto dosaggio era significativamente più alto di quello nel gruppo a basso dosaggio. Si suggerisce che i glicosidi fenossietanolo cistance possano promuovere la spermatogenesi aumentando il livello di testosterone nel tessuto testicolare per trattare la disfunzione spermatogena, ma il meccanismo del suo effetto sul testosterone necessita di ulteriori ricerche e discussioni.

[Riferimenti]

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