Architettura tridimensionale dei nefroni nel rene normale e cistico
Mar 17, 2022
per ulteriori informazioni:ali.ma@wecistanche.com
Tommaso Bianco1,2,7, Nicolas Goudin3,7, Mohamad Zaidan1,4,7, Meriem Garfa Traore3, Frank Bienaime1,5, Lisa Turinsky1, Serge Garbay1, Clement Nguyen1, Martina Burtin1, Gerard Friedlander1,6, Fabiola Terzi1,8e Marco Pontoglio1,8
1Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale U1151, Centre National de la Recherche Scientifique UMR8253, Université de Paris, Institut Necker Enfants Malades, Département « Croissance et Signalisation », Parigi, Francia;2Service de Chirurgie Viscérale etUrologie Pédiatrique, AP-HP, Hôpital Necker Enfants Malades, Parigi, Francia;3Struttura Fédérative de Recherche Necker, Stati Uniti24-UMS3633, Parigi, Francia; 4Service de Néphrologie-Transplantation, AP-HP, Hôpital Bicêtre, Le Kremlin-Bicêtre, Francia;5Service d'ExplorationsFonctionnelles, AP-HP, Hôpital Necker Enfants Malades, Parigi, Francia; e6Service d'Explorations Fonctionnelles, AP-HP, HôpitalEuropéen Georges Pompidou, Parigi, Francia
PAROLE CHIAVE: cisticorenepatologia;rene; nefrone; nefronoftisi; pulizia dei tessuti
Dichiarazione traslazionale
I metodi di compensazione forniscono uno strumento unico per comprendere come i cambiamenti morfologici portano a conseguenze patologiche.Renisono organi critici che mantengono l'omeostasi del corpo attraverso la manipolazione di acqua, metaboliti ed elettroliti, che dipendono in modo cruciale dalla complessa struttura 3-dimensionale dinefroni.Quando questa organizzazione strutturale è alterata, ne consegue la fisiopatologia renale. Nel presente studio, abbiamo sviluppato un potente metodo basato su clearing ottico, microscopia multifotonica e tracciatura digitale per studiare ilrenea livello di singolo nefrone in condizioni fisiologiche e patologiche. In particolare, forniamo la prima 3-ricostruzione dimensionale di un polycystickidney alla scala del singolonefroni. Questa metodica può essere applicata a diversi contesti patologici, permettendoci di comprendere meglio il complesso processo di deterioramento renale e, di conseguenza, di sviluppare strategie terapeutiche più mirate
Il rene mantiene l'omeostasi del corpo attraverso il suo complesso3-dimensionale(3D) struttura del nefrone. Quando questa organizzazione strutturale è alterata, ne consegue la fisiopatologia renale. Cronicorenele malattie sono caratterizzate dallo sviluppo di lesioni renali. È interessante notare che i patologi hanno segnalato un'ampia eterogeneità nella distribuzione delle lesioni durante le malattie renali croniche.1,2 Se ciò riflette il fatto che specifici segmenti di nefrone possono essere danneggiati in modo diverso o, in alternativa, che alcuni nefroni hanno diverse suscettibilità a essere feriti nel loro insieme, non è noto. Per affrontare questo problema, è obbligatorio ricostruire il 3D (Tridimensionale) forma dinefroniin contesti patologici.
Per quello che ci risulta,nefronisono stati completamente ricostruiti solo utilizzando sezioni 2D seriali.3–5 Sebbene il sezionamento istologico standard fornisca un'alta risoluzione, le ricostruzioni 3D sono laboriose e difficili da ottenere. Ciò è dovuto principalmente alle distorsioni meccaniche, che sono un effetto inevitabile della procedura di affettatura. Inoltre, la ricostruzione 3D( da immagini 2D non consente l'imaging diretto di strutture 3D in tessuti interi montati.
La microscopia multifotonica ha migliorato la nostra capacità di rilevare i cambiamenti morfologici nelle sezioni spesse. Tuttavia, una limitazione significativa è la profondità accessibile ridotta a causa della dispersione della luce. Riducendo al minimo le differenze dell'indice di rifrazione, gli agenti di pulizia hanno notevolmente migliorato la capacità di visualizzare le profondità dell'immagine.6,7 Nonostante il fatto che il primo agente di pulizia sia stato introdotto un secolo fa,8 è solo di recente che sono stati sviluppati diversi protocolli di pulizia, principalmente per il cervello.9 –17 Studi recenti hanno dimostrato il loro potenziale per l'imaging di altri organi solidi, come fegato, pancreas orene.18–26
Policisticorenemalattia, una malattia geneticamente eterogenea che coinvolge mutazioni in diversi geni ciliari, è la malattia renale ereditaria più comune.27,28 Policisticorenela malattia è caratterizzata dallo sviluppo di cisti che portano alla completa distruzione del rene.28 Studi di microdissezione hanno suggerito che le cisti possono svilupparsi sia come una "spinta" di un segmento del nefrone, come nella malattia del rene policistico autosomica dominante; come espansione estatica dei dotti collettori (CD), come nel policistico autosomico recessivorenepatologia; o esclusivamente nei tubuli midollari, come nella nefronoftisi (NPHP).27,29 Tuttavia, come si sviluppano le cisti in 3D (Tridimensionale) e organizzarsi tra loro e normali tubulesi vicine ancora sconosciute.
Qui, abbiamo combinato il clearing ottico con la microscopia multifotonica per fornire nuove informazioni su comenefronisono modellati e organizzati in condizioni fisiologiche e come vengono modificati durante la malattia, come la cistogenesi. I nostri risultati dimostrano che esistono 3 tipi dinefronie che i vasi possono influenzare l'organizzazione spaziale dei nefroni. È interessante notare che i nefroni tendono a giacere in piani specifici. Inaspettatamente, quando abbiamo applicato questa tecnica ai topi, abbiamo osservato che le cisti si sviluppavano solo in segmenti specifici di nefrone con cisti fusiformi mescolate con tubuli normali.
Clicca suCistancheeffetti collateraliper malattie renali
RISULTATI
Setup sperimentale
Per studiare la forma dell'interonefroniin relazione al loro ambiente, abbiamo adottato una tecnica basata sul clearing ottico e sulla microscopia multifotonica (Figura supplementare S1A). Confrontando diversi protocolli di compensazione ottica, abbiamo determinato che per ilrene, alcol benzilico/benzil benzoato (BABB) era il più appropriato in termini di efficacia (Figure supplementari S1B e C e Tabella supplementare S1).
3D (Tridimensionale) la ricostruzione e il tracciamento digitale richiedono immagini di alta qualità con alta risoluzione e un elevato rapporto segnale-sfondo. Abbiamo osservato che il segnale ottico fornito dalla fluorescenza nativa non era uniforme sulle sezioni renali. In particolare, le immagini del midollo erano scarsamente contrastate con un basso rapporto segnale-sfondo (Figura supplementare S2). Per migliorare il rapporto segnale-sfondo, abbiamo colorato le sezioni con acido periodico-Schiff (Figura supplementare S1D), perché abbiamo notato empiricamente che questa colorazione ha dato luogo a un contrasto elevato nelle sezioni sottili durante la 2-fotonfluorescenza. Tuttavia, il segnale non era uniforme in tutto lo spesso acido periodico macchiato di Schiffrenesezioni (Figura supplementare S1E). Pertanto, abbiamo colorato le sezioni renali con lectine accoppiate a fluorocromi: agglutinina di arachidi e agglutinina di germe di grano, che colorano i glomeruli e i tubuli, e agglutinina folia di semplicità I di Griffonia, che segna i vasi sanguigni.30 Sorprendentemente, con la combinazione di theselectine, il rapporto segnale-fondo è stato notevolmente aumentato in intere sezioni renali, con un miglioramento significativo sia nel piano XY che nell'asse z (Figura supplementare S1E e Film supplementare S1).
Visualizzazione 3D del segmento del nefrone
Per visualizzare la forma dell'interonefroni, abbiamo tracciato i loro percorsi, iniziando dal polo urinario del glomerulo e finendo alla giunzione CD (film supplementare S2). Nonostante il fatto che le lectine utilizzate legano globalmente tutti i nefrosegmenti, abbiamo notato che, se attentamente ispezionate, le selectine erano caratterizzate da un pattern specifico nel modo in cui coloravano le membrane basali o luminali nei diversi nefrosegmenti. In altre parole, abbiamo sfruttato il modello stereotipato della colorazione della lectina per identificare i diversi segmenti di nefrone. In questo modo, potremmo facilmente identificare 6 entità: tubulo prossimale (PT), arto sottile (TL) dell'Henleloop (HL), arto ascendente spesso (TAL) di HL, tubulo contorto distale (DCT), tubulo connettivo (CNT), e CD. La transizione tra PT e TL è stata caratterizzata dall'improvvisa perdita del tipico segnale del bordo della spazzola PT e dalla diminuzione della larghezza del lume, che era quasi praticamente assente in TL (Figura 1a). Al contrario, la transizione tra TL e TAL è stata caratterizzata da un aumento significativo del diametro tubolare esterno e da una larghezza del lume relativamente costante (Figura 1b). In tutti i nefroni, la transizione da TAL a DCT è stata sistematicamente trovata al polo vascolare del glomerulo. Questa transizione è stata caratterizzata da un improvviso allargamento del diametro tubolare esterno dovuto principalmente a un aumento significativo del diametro del lume (Figura 1c). La transizione tra DCT e CNT era caratterizzata da areduzione sia del diametro tubolare che del lume (Figura 1d). Infine, la connessione tra CNT e CD corticale era caratterizzata da un improvviso aumento sia del diametro tubolare che del lume (Figura 1e). La quantificazione di queste transizioni morfologiche era statisticamente significativa (Figura 1f) e la sua pertinenza è stata verificata con la colorazione con marcatori tubolari specifici (Figure supplementari S3–S5 e Film supplementare S3–S5).
La forma e le dimensioni dei PT differiscono in base alla loro profondità
La colorazione di spessorenele sezioni ci hanno permesso di tracciare le coordinate dell'evoluzione spaziale di interi segmenti PT. È interessante notare che la loro forma era estremamente variabile e determinata dalla posizione dei loro glomeruli nella corteccia. A livello globale, abbiamo identificato 3 modelli. Il primo corrispondeva al più superficialenefroni(SNs) (Figura 2a; Film supplementare S6), che occupava la parte più esterna della corteccia (il 30% più esterno vicino alla capsula renale). Le loro parti contorte formavano strutture compatte con solo da 6 a 7 convoluzioni attorno al proprio glomerulo, occupando spazi molto piccoli e fitti. La convoluzione di questi SN terminava in pars recta lunga e diritta che discendeva nel midollo. All'estremità opposta di questo spettro, abbiamo osservato un secondo modello di nefroni situati nella parte più profonda della corteccia (40 percento in più di profondità interna), accanto al midollo (nefroni juxtamidollari [JNs]) (Figura 2a; Figura S6 supplementare e Film supplementare S6). I loro PT erano caratterizzati da uno shortloop iniziale che scendeva sistematicamente verso la papilla e poi si girava a U per risalire verso la capsula renale. In contrasto con le SN, i tubuli contorti prossimali JN erano caratterizzati da grandi bobine che si sono evolute attorno al proprio glomerulo e occupavano domini ampi e poco confezionati nella corteccia iuxtamedullare. La parte contorta del PT di JN aveva da 10 a 15 convoluzioni, formando domini di grandi dimensioni. Infine, il terzo modello includeva nefroni situati nella porzione centrale della corteccia (nefroni medi [MNs]) (Figura 2a; Film supplementare S6). È interessante notare che questi tubuli avevano una forma e un orientamento spaziale che rappresentava una transizione tra SN e JN. In effetti, contenevano da 8 a 9 convoluzioni con bobine più grandi di SN, ma più piccole di JN. Inoltre, i MN avevano pars recta più lunghi rispetto ai JN. È interessante notare che un confronto globale delle forme dei PT ha mostrato che SN e MN avevano uno schema omogeneo mentre i JN erano estremamente eterogenei (Figura supplementare S6). Inoltre, la ricostruzione spaziale di diversinefroni ha rivelato che i PT non si mescolano mai (SupplementaryMovie S6), indicando che ogni nefrone occupa il proprio spazio individuale nella corteccia.
Le analisi morfometriche hanno confermato le grandi differenze nelle dimensioni e nella forma di SN e JN, con un aspetto intermedio per i MN. Il PT dei JN era più di 2-più lungo del PT dei SN (Figura 2b); tuttavia, la rettilineità era maggiore negli SN rispetto ai JN (Figura 2c), coerentemente con l'osservazione che i tubuli JN erano molto più tortuosi (Figura 2a; Figura S6 supplementare).
Figura 1|Criteri morfologici utilizzati per identificare i segmenti di nefrone. (a-e) Morfologia dei diversi segmenti dei topi incontrollo del nefrone.Nefronisono stati tracciati dal polo urinario del glomerulo al dotto collettore (tubulo prossimale [PT]: turchese; lembo sottile [TL] dell'ansa di Henle: grigio chiaro; arto ascendente spesso [TAL] dell'ansa di Henle: grigio scuro; distale tubulo contorto [DCT]: rosa; tubulo di collegamento [CNT]: giallo; dotto collettore corticale [CCD]: arancione). Le frecce indicano il diametro dei diversi segmenti di nefrone. (continua)
Figura 1|(Continua) (f) Quantificazione del diametro tubolare esterno dei diversi segmenti di nefrone. I dati sono espressi come media±SEM.Analisi della varianza seguita dal test di Tukey-Kramer: **P < 0.01, ***P < 0,001.
Figura 2 |Tridimensionale(3D) la ricostruzione del tubulo prossimale rivela 3 diverse forme e organizzazioni. (a) Immagini rappresentative di ricostruzione 3D dei tubuli prossimali attraverso l'intera corteccia renale, divisi in 3 livelli (linee bianche) in base alla forma dei tubuli prossimali (PT): corteccia superficiale (blu), media (verde) e juxtamidollare (rossa), corrispondenti rispettivamente al 30 percento esterno, al 30 percento medio e al 40 percento interno della corteccia. Nota le diverse forme dei 3 tipi dinefronied in particolare la lunghezza e la tortuosità dei tubuli iuxtamidollari. Barra{{0}} mm. (b,c) Quantificazione della (b) lunghezza e (c) rettilineità dei 3 tipi di tubuli prossimali. (d) Quantificazione del volume dei glomeruli da ciascuna regione della corteccia. I dati sono espressi come SEM medio. Analisi della varianza seguita dal test di Tukey-Kramer: PT juxtamidollare vs PT superficiale: ###P < 0.001;="" pt="" juxtamidollare="" rispetto="" a="" pt="" medio:="" ***p="">< 0,001;="" pt="" superficiale="" vs="" pt="" medio:="" $$$p=""><>
Figura 3 |Tridimensionale(3D) la ricostruzione del nefrone rivela 3 diversi tipi di nefroni. (a) Immagini 3D rappresentative di un intero nefrone (pannelli di sinistra) dai glomeruli al dotto di raccolta nella corteccia superficiale (blu), nella corteccia media (verde) e nella regione juxtamidollare (rossa) nei topi di controllo. Segmentazione dei nefroni (pannelli di destra) per i 3 diversi tipi di nefroni. Barra=150 mm. (b) Quantificazione della distanza interna tra i 2 arti dell'ansa di Henle per i 3 tipi di nefroni. (c) Quantificazione della lunghezza del nefrone per il (continua)
Figura 3|(continua) 3 tipi dinefroni. (d) Quantificazione della lunghezza dei diversi segmenti del nefrone secondo il tipo di nefrone. I dati sono espressi come media±SEM. Analisi della varianza seguita dal test di Tukey-Kramer: nefrone juxtamedullary (JN) versus nefrone superficiale (SN): ###P < 0.001;="" jn="" contro="" nefrone="" medio="" (mn):="" *p="">< 0.05,="" **p="">< 0.01,="" ***p="">< 0.001.="" cnt,="" tubo="" di="" collegamento;="" dct,="" tubulo="" distale="" contorto;="" pt,="" tubulo="" prossimale;="" tal,="" spesso="" arto="" ascendente="" dell'ansa="" di="" henle;="" tl,="" lembo="" sottile="" dell'ansa="" di="">
La dimensione glomerulare varia con la profondità
Abbiamo quindi analizzato la profondità e il diametro dei glomeruli selezionati casualmente da ciascuna delle 3 zone. L'analisi morfometrica ha rivelato che i glomeruli si trovavano in media a 783 e 355 mm dalla capsula renale rispettivamente nelle JN e nelle SN. Come precedentemente riportato, abbiamo osservato che le dimensioni dei glomeruli variavano in base alla loro profondità. In particolare, il volume glomerulare di JN era 3 volte maggiore di quello di SN e MN (Figura 2d).
Ricostruzione 3D del nefrone
Abbiamo quindi tracciato l'evoluzione spaziale dell'interonefronida PT a CNT. La visione globale del loro 3D (Tridimensionale) la ricostruzione ha confermato che la forma del nefrone differiva tra SN, MN e JN (Figura 3a; Film supplementare S7). Questa differenza era principalmente dovuta alla struttura di PT. Inoltre, abbiamo osservato che HL aveva una diversa organizzazione spaziale 3D. In particolare, TL e TAL erano più distanti in JNs rispetto a SN e MN (Figura 3b). Le analisi morfometriche hanno rivelato che le JN erano globalmente 2- volte più lunghe delle SN (Figura 3c). La maggiore lunghezza è stata distribuita proporzionalmente in tutti i segmenti, ad eccezione di TAL e DCT, che tendevano ad avere una lunghezza assoluta simile in tutti i tipi di nefrone (Figura 3d). Ciò ha suggerito che l'allungamento del nefrone è un processo sorprendentemente omogeneo.
I vasi arcuati influenzano la convoluzione PT juxtamidollare
Per ottenere una prospettiva più completa delrenestruttura, abbiamo sfruttato la colorazione di Griffonia simplicifoliaagglutinin, che ci ha permesso di tracciare i vasi arcuati e i loro rami nei vasi corticali radiati (Figura 4a; Film supplementare S8). È interessante notare che il 3D concomitante (Tridimensionale) la ricostruzione di nefroni e vasi ha mostrato che i vasi arcuati tendono ad essere in un'organizzazione spaziale sorprendentemente parallela con i tubuli vicini. In particolare, abbiamo osservato che il percorso seguito da JN specifici (JN vincolati) tende a seguire il percorso della nave vicina (Figura 4b; Film supplementare S9). Sorprendentemente, questo bias (osservato solo in un sottoinsieme di JNnefroni) spiegava la grande eterogeneità nelle forme di PT (Figura complementare S6). Le analisi morfometriche hanno rivelato che i PT "vincolati" erano significativamente più lunghi e più tortuosi (rettilineità ridotta) rispetto a quelli "non vincolati" (Figure 4c e d). Vale la pena notare che le parti contorte di SN e MN erano posizionate sopra i vasi arcuati e non erano vincolate.
Malattia renale cronica-Cistanche
I tubuli tendono a giacere negli aerei
È interessante notare che un'ispezione del 3D (Tridimensionale) forme dinefroniha indicato che tendono a giacere su piani (Figura 5a; Supplementary MovieS10). Per quantificare questo parametro e per valutare il possibile bias statistico di questa conformazione, abbiamo misurato la tendenza generale dei tubuli a piegarsi fuori dal piano definito dalle loro anse. Le nostre misurazioni hanno mostrato che rispetto a un modello simulato di camminata casuale generato con lo stesso insieme di angoli misurati consecutivi e lunghezza tra punti consecutivi (Figura 5b), i tubuli tendevano ad evolversi con una deviazione minore da un piano (Figura 5c). Ciò indicava che i tubuli tendevano a limitare il loro percorso lungo un piano. Le differenze osservate erano statisticamente altamente significative (P <>
La ricostruzione 3D del nefrone rivela un modello specifico per lo sviluppo della cisti
Per determinare se il nostro protocollo consente di tracciare i nefroni in tessuti patologici disorganizzati, abbiamo caratterizzato le forme e la distribuzione spaziale delle cisti nei topi jack, un modello ampiamente utilizzato di NPHP e malattia cistica.31–{1}}Le immagini D hanno mostrato che, nonostante il comparsa di cisti prominenti, thegeneral 3D (Tridimensionale) il decorso dei nefroni non differiva significativamente da quello dei topi di controllo (Supplementary Movie S11). Allo stesso modo, le analisi morfometriche hanno confermato che la lunghezza globale dinefroni, il volume glomerulare e la lunghezza di ciascun segmento di nefrone erano paragonabili a quelli dei topi di controllo (Figura supplementare S7). Da notare, a causa dello sviluppo della cisti, non siamo stati in grado di differenziare TL da TAL in HL. Tutti i nefroni hanno sviluppato cisti fusiformi (SupplementaryMovies S11 e S12). Una delle caratteristiche più sorprendenti è stata l'osservazione che le dilatazioni cistiche fusiformi si sono verificate in più posizioni lungo lo stesso segmento di nefrone (Film supplementari S12 e S13). Curiosamente, abbiamo osservato che le cisti non si sono mai sviluppate nei PT e negli arti discendenti dell'HL (Figura 6a; Film supplementare S12). Al contrario, sono stati rilevati principalmente negli arti ascendenti HL, DCT, CNT e nella parte superiore dei CD, in continuità con CNT (Figura 6a; Film supplementare S12). In particolare, abbiamo osservato che la DCT, così come i segmenti CNT, avevano una probabilità particolarmente aumentata di sviluppare cisti nelle rispettive parti più distali (Figura 6b). Le analisi quantitativemorfometriche delle immagini di ricostruzione 3D hanno rivelato che il volume totale della cisti per nefrone era particolarmente alto nella CNT (Figura 7a). Inoltre, abbiamo osservato che gli ingrandimenti delle cisti in HL e DCT erano maggiori nei JN rispetto a SN e MN (Figura 7a; Film supplementare S12). Inoltre, l'incidenza di cisti era significativamente più alta nei JN rispetto agli altri tipi dinefroni(Figura 7b). Abbiamo anche osservato che la distanza media glomerulare (calcolata sui 5 glomeruli più vicini) tendeva ad essere particolarmente aumentata nei topi incistici, specialmente nella corteccia più superficiale (Figura supplementare S8).
Figura 4|I vasi determinano la forma del nefrone. (un)Tridimensionalericostruzione dell'architettura dei vasi dai vasi arcuati ai vasi corticali radiati. Barra ¼ 200 mm. (b) Immagini rappresentative di tubuli prossimali juxtamidollari "non vincolati" (pannello superiore) e "vincolati" (pannello inferiore). Barra ¼ 100 mm. (c,d) Quantificazione della (c) lunghezza e (d) rettilineità dei tubuli prossimali juxtamidollari "non vincolati" e "vincolati". I dati sono espressi come media±SEM. Test di Mann-Whitney: "vincolato" contro "non vincolato":*P < 0.05,="" ***p=""><>
3D (Tridimensionale) la ricostruzione di numerose cisti ha rivelato che erano estremamente variabili per forma e volume (Figura 6c; Film supplementari S11 e S13). Nell'arto ascendente HL, le cisti avevano una forma fusiforme con un piccolo diametro. Nella DCT, le cisti avevano una forma piuttosto sferica e più grande ed erano sparse tra i tubuli non dilatati. È interessante notare che la transizione tra DCT e CNT è stata sistematicamente caratterizzata da una normale struttura non dilatata. Al contrario, nella CNT, abbiamo osservato sistematicamente una struttura cistica dilatata contigua direttamente a contatto con il MC. È interessante notare che, in CD, questa struttura si è progressivamente ridotta a una dimensione normale del tubulo. Più distalmente, non è stato possibile rilevare ulteriori cisti nella porzione contigua del MC. Un'altra caratteristica consistente era la peculiare organizzazione spaziale delle cisti nell'arto ascendente HL. Infatti, sebbene le cisti fossero più profonde e più vicine al ciclo nelle SN, erano più superficiali e più vicine alla DCT nelle JN (Figura 6c). Anche in questo caso, le cisti occupavano una posizione intermedia negli MN (Figura 6c).
Figura 5|I tubuli del nefrone tendono ad evolversi come una struttura piatta. (a) Un percorso tipico di un tubulo prossimale del nefrone. Questo percorso illustra la sua tendenza a giacere su un piano. La planarità dell'evoluzione del percorso si vede meglio se correttamente ruotato e allineato con il punto di vista dell'osservatore (vedi rappresentazione a destra dello stesso segmento tubolare, che, sul lato sinistro, è rappresentato su una diversa angolazione) . (b) Rappresentazione schematica di un percorso tubolare composto da 4 segmenti (tra 5 punti che definiscono un dato percorso tubolare mostrato come un esempio). Il grado in cui i percorsi tendono ad andare "fuori dal loro piano" può essere rappresentato dall'angolo qui indicato come "beta". (continua)
Figura 5|(Continua) Questo angolo è misurato tra il segmento p3-p4 rispetto al piano (definito dai punti immediatamente precedenti p3, p2 e p1) e rappresentato da un rettangolo grigio scuro nello schema. Il calcolo degli angoli beta è stato quindi calcolato in modo ricorsivo insieme all'insieme dei punti in un percorso tubolare. Per valutare l'entità del bias di questi angoli beta, abbiamo simulato una camminata casuale (Monte Carlossimulation [MCs]) utilizzando lo stesso insieme di angoli alfa consecutivi di ciascun percorso tubolare (misurato tra tutti i segmenti consecutivi). Questa camminata casuale ha generato un percorso con un insieme identico di angoli alfa e angoli beta randomizzati. (c) Grafici di violino della distribuzione globale degli angoli beta e del risultato di MC nel tubulo prossimale (PT), arto sottile (TL) dell'ansa di Henle, arto ascendente spesso (TAL) dell'ansa di Henle, tubulo contorto distale (DCT ) e tubulo connettivo (CNT). MC, P <>
DISCUSSIONE
I metodi istologici tradizionali sono limitati nella loro capacità di rilevare i cambiamenti patologici che influenzano la forma globale dinefroni. Qui, presentiamo un potente approccio basato sulla pulizia dei tessuti che ha il potenziale per affrontare questioni cruciali surenearchitettura con dettagli spaziali senza precedenti in condizioni normali e patologiche. I nostri risultati hanno confermato l'esistenza di 3 tipi di nefroni, che differiscono per posizione, forma e dimensione, coerenti con le loro specificità funzionali. Inoltre, abbiamo dimostrato che i nefroni tendono a giacere negli aerei e ad adattarsi all'organizzazione spaziale della nave. È interessante notare che quando abbiamo applicato questa tecnica a un modello di malattia renale cistica, abbiamo osservato che le cisti si sviluppano in tutti i nefroni, ma solo in segmenti specifici. È interessante notare che abbiamo mostrato che la forma della cisti varia a seconda del segmento del nefrone e che lungo lo stesso nefrone le cisti si intercalano con i tubuli normali non dilatati. Complessivamente, questi risultati forniscono il primo 3D (Tridimensionale) caratterizzazione della disposizione spaziale dinefronie vasi e, soprattutto, forniscono la base per la comprensione di un processo patologico, come l'ascistogenesi.
La compensazione ottica del rene è impegnativa a causa degli alti livelli di autofluorescenza e densità cellulare. Confrontando diversi protocolli di clearing, abbiamo individuato in BABB una potente tecnica per implementare la visualizzazione e la ricostruzione di strutture situate nella parte più profonda delrene, cioè il midollo. Inoltre, BABB è rapido e scalabile e, una volta cancellati, i campioni possono essere conservati per mesi prima dell'acquisizione dell'immagine. Un altro vantaggio principale di questa tecnica è il suo basso costo. I chiarificanti possono provocare il restringimento o l'allargamento delle strutture.9-17 Tuttavia, poiché queste modificazioni delle dimensioni dei reni sono isotrope, non ci si aspetta che le misurazioni relative ne risentano o ne pregiudichino l'interpretazione. Uno dei limiti più importanti è l'annotazione di strutture che richiede molto tempo. Tuttavia, esiste un numero crescente di tecniche basate sul deep learning che dovrebbero superare rapidamente questa limitazione.
Coerentemente con i risultati ottenuti con le tecniche classiche, il nostro studio ha mostrato che i nefroni differiscono per forma e lunghezza a seconda della loro posizione. In particolare, abbiamo osservato che le JN hanno PT contorti più sviluppati e glomeruli più grandi e sono 2 volte più lunghe delle SN. L'aumento della lunghezza è il risultato di un processo armonioso perché l'allungamento interessa proporzionalmente tutti i segmenti del nefrone. Abbiamo anche osservato che i JN hanno HL più grandi. Complessivamente, questi dati mostrano chiaramente che la microanatomia di SN e JN è significativamente diversa e che i MN mostrano caratteristiche intermedie. È interessante notare che gli studi fisiologici lo hanno dimostratonefronisono anche funzionalmente differenti.2 Gli eventi morfogenetici che stanno alla base di queste differenze non sono ancora noti. Si è quindi tentati di ipotizzare che la struttura particolare dei JNs possa spiegare la specificità delle loro funzioni.
Interessante, fornendo per la prima volta il 3D (Tridimensionale) ricostruzione dinefronie le loro navi circostanti, abbiamo scoperto un vincolo spaziale tra le navi arcuate e un sottogruppo di nefroni. Pertanto, è concepibile pensare che i vasi possano determinare il modo in cui i nefroni si allungano durante lo sviluppo.34,35 L'ispezione delle forme 3D dei nefroni combinata con simulazioni computazionali ha anche rivelato che i nefroni non si mescolano mai e che ogni nefrone tende a giacere su un piano. Resta da chiarire il significato funzionale di questa osservazione.
Sviluppo della cisti durante il policisticorenela malattia è ancora un processo intrigante. La NPHP, una condizione patologica caratterizzata dallo sviluppo di cisti, è la più comune malattia renale allo stadio terminale che causa malattie genetiche nei bambini e negli adolescenti. Finora sono stati identificati venti geni NPHP.36 Tra questi, NEK8 codifica per un membro della famiglia delle chinasi A non correlate all'inmitosi, che svolge un ruolo nella funzione ciliare e nella progressione del ciclo cellulare.37 Nek8 era originariamente caratterizzato come il gene mutato nei topi jck.32 In particolare, è stato dimostrato che l' mutazione nello stesso dominio proteico porta a NPHP9 negli esseri umani.38 2Studi D hanno suggerito che lo sviluppo delle cisti differisce notevolmente tra le diverse forme di malattia del rene policistico.27,29 In particolare, nella NPHP, la ciste sembra derivare esclusivamente da CD e DCT.31 Sebbene informativi, questi studi immunoistochimici non possono argomentare contro la possibilità che la perdita di specifici marcatori tubulari39 spieghi artificialmente questa osservazione. Quindi, il nostro 3D (Tridimensionale) lo studio fornisce la prima chiara evidenza che lo sviluppo della cisti è un processo che può coinvolgere solo specifici nefrosegmenti. È interessante notare che, sebbene la chinasi 8 correlata a NIMA (Never In mitosisgene A) (NEK8) sia espressa nel citoplasma di tutti i segmenti di nefrone, la sua espressione nelle ciglia è limitata a DCT e CD. Poiché solo questi segmenti sono inclini a sviluppare cisti,31 possiamo postulare che l'interruzione della funzione ciliare di NEK8 sia l'evento cruciale per la formazione di cisti. Curiosamente, abbiamo anche osservato che le cisti fusiformi sono in continuità con i tubuli normali non dilatati. Il fatto che una mutazione germinale recessiva porti a un fenotipo patologico solo in un sottoinsieme di cellule suggerisce che un secondo evento potrebbe innescare lo sviluppo di cisti in queste cellule, come suggerito per il policistico autosomico dominanterenemalattia.40,41
Figura 6 |Tridimensionale(3D) la ricostruzione del nefrone rivela che le cisti si sviluppano solo in segmenti specifici del nefrone. (a) Immagini 3D rappresentative con rendering del volume della cisti di un intero nefrone (pannelli di sinistra) dai glomeruli al dotto di raccolta nella corteccia superficiale (blu), nella corteccia media (verde) e nella regione juxtamidollare (rossa) nei topi jack. Segmentazione del nefrone (pannelli di destra) per i 3 diversi tipi dinefroni. Barra=150 mm. (b) Probabilità di sviluppare cisti nei diversi segmenti di nefrone nei topi jack. (continua)
Figura 6|(Continua) L'asse orizzontale è una lunghezza normalizzata di nefroni corrispondente a 50 bin (tubulo prossimale [PT], turchese; Henleloop [HL], bianco; tubulo contorto distale [DCT], rosa; tubulo di collegamento [CNT], giallo). (c) Immagini rappresentative della ricostruzione di cisti 3D con il rendering del volume della cisti dell'arto ascendente di HL (pannelli di sinistra), DCT (pannelli centrali) e CNT e dotti collettori corticali (CCD) (pannelli di destra) in superficie (pannelli superiori), medio (medio pannelli) e nefroni juxtamidollari (pannelli inferiori) nei topi jack. Barra= 50 mm.
Figura 7|Caratterizzazione della distribuzione e del volume delle cisti in tutto il nefrone. (a) Quantificazione del volume totale della cisti (somma delle cisti per nefrone) per ciascun segmento del nefrone (ansa di Henle [HL], bianco; tubulo contorto distale [DCT], rosa; tubulo di collegamento [CNT], giallo) e (b) lunghezza del tubulo occupato dalle cisti per ogni tipo di nefrone (superficiale: blu; medio: verde; iuxtamidollare: rosso) nei topi. I dati sono espressi come media±SEM. Analisi della varianza seguita dal test di Tukey-Kramer: nefrone juxtamidollare [JN] versus nefrone superficiale [SN]: #P < 0.05;="" jn="" contro="" nefrone="" medio="" [mn]:="" *p="">< 0.05,="" **p=""><>
Abbiamo anche osservato che l'allargamento della cisti è più predominante nelle JN che nelle SN, almeno considerando le cisti che si trovano tra PT e CNT. Coerentemente, è stato riportato che nel contesto della glomerulosclerosi, le lesioni glomerulari si trovano più frequentemente nei JN che nelle SN. deteriorarsi è un'ipotesi interessante che merita ulteriori approfondimenti.
In sintesi, descriviamo una nuova tecnica per l'immaginereniin 3D (Tridimensionale) con specificità molecolare e risoluzione sufficienti per registrare direttamente la distribuzione spaziale e quantitativa di strutture interne specificatamente etichettate(nefroni, vasi e cisti). Data la comodità, la velocità e la capacità di quantificazione diretta, prevediamo che questa tecnica diventerà un potente strumento per comprendere la fisiopatologia renale.
METODI
Animali
Tutte le procedure sugli animali sono state approvate dai "Services Vétérinairesde la Préfecture de Police de Paris" e dal comitato etico dell'Université Paris Descartes. Sono stati utilizzati topi FVB/N di due mesi (n=20) per impostare la condizione sperimentale perreneclearing.Lo studio è stato quindi condotto su 2-topi jack maschi di una settimana (n=4) e compagni di cucciolata di controllo (n=3).
Preparazione dei tessuti renali
Prima dell'uccisione, i topi sono stati perfusi, tramite cateterizzazione intracardiaca, con 25 ml di soluzione salina eparinizzata (1000 UI/l) seguiti da 75 ml di paraformaldeide al 4% in soluzione fisiologica tamponata con fosfato (PBS). Gli esperimenti sono stati condotti in anestesia con xilazina (Rompun 2 percento, Bayer, Leverkusen, Germania, 6 mg/g di peso corporeo) e ketamina (Clorketam 1000, Vetoquinol SA, Lure, Francia, 120 mg/g di peso corporeo).
Per studi di compensazione,renisono stati fissati in paraformaldeide al 4% per 4 ore e incorporati in agarosio al 4% e sezioni spesse 1.5-mm che circondano l'ilo renale sono state tagliate e conservate in PBS a 4livello. Le sezioni renali sono state prima colorate e poi ripulite.
Per gli studi immunoistochimici su sezioni sottili, i reni sono stati fissati in paraformaldeide al 4% durante la notte e le sezioni incluse in paraffina e 4- mm sono state tagliate.
Colorazione
Colorazione periodica con acido-Schiff. Il 1.5-mmrenele sezioni sono state incubate in acido periodico di Schiff puro o diluito 1:100 PBS per 5 minuti a temperatura ambiente prima della pulizia.
Immunoistochimica su sezioni sottili incluse in paraffina. Sezioni di quattro micrometri di reni inclusi in paraffina sono state riscaldate per il recupero dell'antigene e incubate per una notte a 44 gradicon lectine accoppiate a flfluorocromo per tracciare i tubuli (agglutinina di arachidi di rodamina [RL-1072-5] e agglutinina di germe di grano di rodamina [RL-1022-5], Vector Laboratories, Burlingame, CA, diluito a 1:200) e segmento- anticorpo primario specifico per rappresentare segmenti tubolari distinti (lectina biotinilata Lotus tetragonolobus [B-1325], Vector Laboratories, diluita a 1:100; topo anti-Calbindina D28K[D{11}}], Santa Cruz, Heidelberg, Germania, diluito a 1:200; capra anti-AQP2 [C-17], Santa Cruz, diluito a 1:200). Il giorno successivo, le sezioni sono state incubate con l'anticorpo secondario per 1 ora a temperatura ambiente (Alexa Fluor 488 coniugato [S32354], Invitrogen; anti-capra Alexa Fluor 488 [A-11055], Invitrogen; anti-mouse AlexaFluor 488 [A-21202], Invitrogen, Carlsbad, CA; tutto diluito a 1:500) prima di essere colorato con 40,{31}}diamidino-2-fenilindolo. Tutte le immagini sono state acquisite con un microscopio Nikon Eclipse E800 (Champignysur Marne, Francia) e preparate utilizzando il software Fiji (versione 1.50). Colorazione della lectina su sezioni spesse. Il 1.{37}}mm di spessorerenele sezioni sono state incubate a 44 gradiper 1 mese in Texas Red o lectine accoppiate con isotiocianato di flfluoresceina: agglutinina di arachidi (RL-1072-5) e agglutinina di germe di grano (RL-1022-5), diluite 1:100 in 0,1 percento di PBS azide e 0,1 percento di Triton-X. Le sezioni sono state quindi lavate ogni giorno per 2 settimane con PBS prima della pulizia.
Funzione Cistanche-rene
Cancellazione ottica
Per la compensazione della scala, 1.5-mmrenele sezioni sono state incubate in ScaleA2 (4 M urea, 0,1% Triton X-100, 10% glicerolo) o ScaleB4 (8 Murea, 0,1% Triton X-100 ) per 2 settimane, fino a 1 anno, a 4livello.
Per la pulizia BABB, le sezioni renali da 1,5- mm sono state disidratate in risciacqui sequenziali di etanolo a temperatura ambiente. I campioni sono stati quindi incubati in BABB (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO) in un rapporto 1:2 per almeno 2 giorni a 4 gradi .
Acquisizione di immagini al microscopio a due fotoni
I tessuti sono stati ripresi con gel acquoso su un microscopio multifotonico invertito (LaVision BioTec) dotato di un laser Mai Tai HP Titanium-Sapphire (Spectra-Physics, Santa Clara, CA) (Figura supplementare S1A). La lunghezza d'onda di eccitazione era di 815 nm all'8 percento della potenza. Abbiamo usato un 20Xobiettivo a immersione in acqua (XLUMPLFL20XW,Olympus [Tokyo, Giappone]; apertura numerica, 0,95; distanza di lavoro,2,0 mm). Per l'acquisizione della fluorescenza, abbiamo utilizzato un rivelatore non scansionato all'80 percento con un filtro passa-banda di 593/40 nm.
Il primo passaggio consisteva nell'acquisizione di immagini a mosaico 2D nella pila z centrale utilizzando parametri di acquisizione non ottimali (400 mm X 400 mm e 1011X1011 pixel, con una sovrapposizione del 10 percento e una media lineare a 2) per guidare la selezione dei campi centrali più rilevanti (Figura supplementare S9A ). Una volta definiti la griglia XY e z campi di interesse, i parametri sono stati regolati per acquisire immagini di alta qualità. Tale approccio ha ridotto la regione di interesse a5X12 campi per z stack. Quindi, abbiamo acquisito 850 z stack/fette ottiche (1- mm di dimensione del passo) che circondano l'ilo renale nella parte centrale delrenesezione.
Cucitura, elaborazione e tracciatura delle immaginiOgni pila è stata affiancata secondo il metodo sviluppato da Preibischet al.,43 che consente la cucitura di un'ampia raccolta di immagini utilizzando il plug-in "Grid/Collection stitching" del software Fiji (HTTP://Fiji. sc/Figi). Poiché abbiamo osservato un importante spostamento tra 2immagini adiacenti dopo lo stitching, abbiamo scritto un programma di abbinamento personalizzato in Python. Questo programma compensa lo spostamento dell'immagine, consentendoci di allineare correttamente le immagini (Figura supplementare S9B). Le immagini corrette con punti sono state analizzate utilizzando Imaris versione 8.4.2 (Bitplane, Zurigo, Svizzera). Tubuli e vasi sono stati tracciati utilizzando la modalità manuale del pacchetto tracciante di filamenti di Imaris e uniti da un Imaris Xtension che abbiamo sviluppato con MATLAB(https://www.dropbox.com/s/sm9u5em3orjrpmc/Standalone_Join_ Filamento_Tool.zip?dl=0) (Figura supplementare S9C). Le cisti di glomeruli e le cisti sono state ricostruite in 3D utilizzando la modalità manuale del pacchetto di superficie di Imaris. Il 3D (Tridimensionale) l'organizzazione spaziale dei glomeruli è stata mostrata utilizzando la modalità manuale del pacchetto spot di Imaris.
Morfometria
La lunghezza del segmento tubolare, la lunghezza del nefrone e la rettilineità sono state determinate utilizzando il pacchetto tracciante del filamento di Imaris. Secondo il software Imaris, la rettilineità è stata quantificata come il rapporto tra la distanza tra 2 punti e la lunghezza del percorso del segmento del nefrone. Trentuno PT e 12 interinefronisono stati ricostruiti e misurati in 3 topi wild-type, mentre 37 PT e 17 interi nefroni sono stati ricostruiti e misurati in 4 topi jack. I volumi di cisti e glomerulare sono stati determinati utilizzando il "pacchetto di superficie" di Imaris. Trentuno e 34 glomeruli sono stati misurati rispettivamente nei topi wild-type e jack. Settantaquattro cisti sono state misurate in totale.
Gli angoli "fuori dal piano" delle curve tubolari (indicati come "beta") sono stati misurati tra il piano (definito da 3 punti consecutivi) e la direzione con il successivo quarto punto consecutivo nello spazio (Figura 5b). Per valutare la significatività statistica del bias osservato, abbiamo simulato la distribuzione degli angoli beta con rotazione casuale degli angoli beta (simulazione Monte Carlo) in strutture composte dagli stessi segmenti con lo stesso insieme di angoli alfa.
Per il calcolo della probabilità di sviluppare una lesione cistica insieme a segmenti di nefrone, abbiamo rappresentato ciascun nefrone da un insieme di punti nello spazio. Ogni punto è stato annotato in relazione alla presenza di cisti rispetto alla struttura normale e al tipo di segmento. La probabilità a ciascuna lunghezza standardizzata (fissata a 50 bin) è stata calcolata come rapporto tra il numero di punti con annotazione cistica e il numero totale di punti nel bin.
Per il calcolo dell'interdistanza glomerulare media, abbiamo considerato per ciascun glomerulo l'interdistanza glomerulare media calcolata sui 5 glomeruli più vicini.
Analisi e statistiche dei dati
I dati sono espressi come media±SEM. Le differenze tra i gruppi sperimentali sono state valutate utilizzando l'analisi della varianza seguita, quando significativa (P < {{0}}.05),="" dal="" test="" di="" tukey-kramer.="" quando="" sono="" stati="" confrontati="" solo="" 2="" gruppi,="" è="" stato="" utilizzato="" il="" test="" di="" mann-whitney.="" le="" analisi="" statistiche="" sono="" state="" eseguite="" utilizzando="" il="" software="" graph="" prism="" (sandiego,="" ca,="" versione="">
CHIARIMENTI
Tutti gli autori non hanno dichiarato interessi concorrenti.
RINGRAZIAMENTI
Si ringrazia il Laboratoire Experimentation Animale et Transgenese(LEAT), Histology and Imaging Platforms of Structure Federative deRecherche Necker per l'assistenza tecnica. Ringraziamo Pierre Isnard, Marie-Claire Gubler e Nicolas Kuperwasser per la lettura critica del manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto da Institut National de laSanté et de la Recherche Médicale, Université Paris Descartes,Assistance Publique – Hôpitaux de Paris, Agence Nationale de laRecherche, Whoami Laboratoire d'Excellence Who am I, RochePharma Research and Early Development (Basilea, Svizzera) , eInstitut Roche de Recherche et de Médecine Translationnelle (Parigi, Francia).
CONTRIBUTI D'AUTORE
TB, NG e MZ hanno progettato ed eseguito gli esperimenti e analizzato i dati. Anche FB, LT, MGT e SG hanno eseguito alcuni esperimenti e analizzato i dati. MB e CN hanno eseguito gli esperimenti con il mouse. Anche TB e MZ hanno contribuito alla scrittura del manoscritto. GF ha rivisto il manoscritto. FT e MP hanno fornito il quadro concettuale e progettato lo studio, supervisionato il progetto e scritto il documento.
Cistanche-Architettura tridimensionale del rene dei nefroni
MATERIALE SUPPLEMENTARE
File supplementare (PDF)
Figura S1. Configurazione sperimentale, procedura di acquisizione ed elaborazione delle immagini.
Figura S2. Limiti del segnale di autofluorescenza nelle risoluzioni XY e z.
Figura S3. Un'immagine bidimensionale della transizione tra PT e TL su 4-mm incluso in paraffinarenesezioni.
Figura S4. Un'immagine bidimensionale della transizione tra TAL e DCT su sezioni renali incluse in paraffina di 4- mm.
Figura S5. Un'immagine bidimensionale della transizione tra DCT e CNT su sezioni renali incluse in paraffina di 4- mm.
Figura S6. La ricostruzione tridimensionale rivela 3 diverse forme di tubuli prossimali.
Figura S7.Tridimensionalela ricostruzione rivela che la lunghezza e la segmentazione dinefroninon sono affetti da cisti.
Figura S8. La densità dei glomeruli in controllo e cisticareni.
Figura S9. Procedura di acquisizione ed elaborazione delle immagini post-trattamento.Tabella S1. Confronto dei metodi di cancellazione.File supplementare (Film)
Film S1. La colorazione della lectina migliora notevolmente la risoluzione e il rapporto segnale/sfondo.
Film S2. Tracciamento del percorso di un tubulo.
Film S3. Ricostruzione tridimensionale di un rene schiarito che mostra la giunzione tra il tubulo prossimale e il lembo sottile dell'ansa di Henle.
Film S4. Ricostruzione tridimensionale di un rene schiarito che mostra la giunzione tra lo spesso arto ascendente dell'Henleloop e il tubulo contorto distale.
Film S5.Tridimensionalericostruzione di un bonificatoreneche mostra la giunzione tra il tubulo contorto distale e il tubulo di collegamento.
Film S6. La forma e le dimensioni dei tubuli prossimali differiscono in base alla loro profondità.
Film S7. Ricostruzione tridimensionale del nefrone nei topi di controllo.
Film S8. Tracciamento del percorso di una nave da una nave arcuata a una nave radiata acorticale.
Film S9. I vasi arcuati modellano la forma dei tubuli iuxtamedullariprossimali.
Film S10.Nefronitendono a giacere su un aereo.
Film S11. La ricostruzione tridimensionale del nefrone mostra un pattern aspecifico per lo sviluppo della cisti.
Film S12.Tridimensionalela segmentazione del nefrone rivela che le cisti si sviluppano in segmenti specifici del nefrone.
Film S13. Disposizione spaziale e interrelazione dinefronie vasi in un policisticorene.
RIFERIMENTI
1. AR ricca. Una vulnerabilità finora non descritta dei glomeruli iuxtamidollari nella nefrosi lipoide. Bull Johns Hopkins Hosp. 1957;100:173–186.
2. Bankir L, Bouby N, Trinh-Trang-Tan MM. Eterogeneità della nefronanatomia. Rene Int Suppl. 1987;20:S25–S39.
3. Christensen EI, Grann B, Kristoffersen IB, et al.Tridimensionalericostruzione del nefrone di ratto. Am J Physiol Physiol. 2014;306:F664–F671.
4. Zhai XY, Birn H, Jensen KB, et al. Ricostruzione tridimensionale digitale e ultrastruttura del tubulo prossimale del topo. J Am Soc Nephrol.2003;14:611–619.
5. Zhai XY, Thomsen JS, Birn H, et al. Ricostruzione tridimensionale del nefrone del topo. J Am Soc Nephrol. 2006;17:77–88.
6. Puelles VG, Moeller MJ, Bertram JF. Possiamo vedere chiaramente ora: opticalclearing erenemorfometria. Curr Opin Nephrol Hypertens.2017;26:179–186.
7. Seo J, Choe M, Kim SY. Tecniche di clearing ed etichettatura per tessuti biologici su larga scala. Cellule moli. 2016;39:439–446.
8. Spalteholz W. Über das Durchsichtigmachen von menschlichen undtierischen Präparaten und seine theoretischen Bedingungen, nebst Anhang:Über Knochenfärbung. Lipsia, Germania: S. Hierzel; 1914.
9. Hama H, Kurokawa H, Kawano H, et al. Scala: un approccio chimico per l'imaging a fluorescenza e la ricostruzione del cervello trasparente del topo.Nat Neurosci. 2011;14:1481–1488.
10. Ertürk A, Becker K, Jährling N, et al.Tridimensionaleimaging di organi eliminati con solventi utilizzando 3DISCO. Nat Protoc. 2012;7:1983–1995.
11. Kuwajima T, Sitko AA, Bhansali P, et al. ClearT: un metodo di pulizia senza detergenti e solventi per tessuti neuronali e non neuronali.Sviluppo. 2013;140:1364–1368.
12. Ke MT, Imai T. Cancellazione ottica di campioni cerebrali fissi utilizzando SeeDB. CurrProtoc Neurosci. 2014;66:22.2.1–22.2.19.
13. Chung K, Deisseroth K. CLARITY per la mappatura del sistema nervoso. NatMethods. 2013;10:508–513.
14. Tomer R, Ye L, Hsueh B, Deisseroth K. Advanced CLARITY per l'imaging rapido e ad alta risoluzione di tessuti intatti. Nat Protoc. 2014;9:1682–1697.
15. Yang B, Treweek JB, Kulkarni RP, et al. Fenotipizzazione unicellulare all'interno di tessuto intatto trasparente attraverso la compensazione dell'intero corpo. Cellula. 2014;158:945–958.
16. Susaki EA, Tainaka K, Perrin D, et al. Imaging del cervello intero con risoluzione unicellulare utilizzando cocktail chimici e analisi computazionale. Cell.2014;157:726–739.
17. Alanentalo T, Asayesh A, Morrison H, et al. Imaging molecolare tomografico e quantificazione 3D all'interno di organi di topo adulto. Metodi Nat.2007;4:31–33.
18. Parra SG, Chia TH, Zinter JP, et al. Microscopia multifotonica di organi di topo cancellati. J Biomed opz. 2010;15:036017.
19. Renier N, Wu Z, Simon DJ, et al. iDISCO: un metodo semplice e rapido per etichettare campioni di tessuto di grandi dimensioni per l'imaging volumetrico. Cellula. 2014;159:896–910.
20. Lee H, Park JH, Seo I, et al. Migliorata l'applicazione della tecnologia di pulizia del tessuto elettroforetico, CLARITY, agli organi solidi intatti tra cui cervello, pancreas, fegato,rene, polmone e intestino. BMC Dev Biol. 2014;14:1–7.
21. Iversen BM, Amann K, Kvam FI, et al. L'aumento della pressione capillare glomerulare e delle dimensioni mediano la glomerulosclerosi nella corteccia iuxtamidollare dell'SHR. Am J Physiol Physiol. 1998;274:F365–F373.
22. Angelotti ML, Antonelli G, Conte C, Romagnani P. Imaging del rene: dalla microscopia ottica alla super risoluzione. Trapianto di quadrante di nefrolo.2021;36:19–28.
23. Puelles VG, van der Wolde JW, Schulze KE, et al. Validazione di un metodo tridimensionale per il conteggio e il dimensionamento dei podociti negli interiglomeruli. J Am Soc Nephrol. 2016;27:3093–3104.
24. Pannabecker TL, Dantzler WH, Layton HE, Layton AT. Ruolo ditridimensionalearchitettura nel meccanismo di concentrazione delle urine del midollo interno renale del therat. Am J Physiol Physiol. 2008;295:F1271–F1285.
25. Saritas T, Puelles VG, Su XT, et al. La compensazione ottica nel rene rivela il rimodellamento dei tubuli mediato dal potassio. Cell Rep. 2018;25:2668–2675.e3.
26. Schuh CD, Polesel M, Platonova E, et al. L'imaging combinato strutturale e funzionale del rene rivela importanti differenze assiali nell'endocitosi del tubulo prossimale. J Am Soc Nephrol. 2018;29:2696–2712.
27. Braun DA, Hildebrandt F. Ciliopatie. Cold Spring Harb Perspect Biol.2017;9:a028191.
28. Bergmann C, Guay-Woodford LM, Harris PC, et al. Policisticorenepatologia. Nat Rev Dis Prim. 2018;4:50.
29. Wilson PD. Malattia policistica renale. N inglese J Med. 2004;350:151–164.
30. Laitinen L, Virtanen I, Saxén L. Cambiamenti nel pattern di glicosilazione durante lo sviluppo embrionale del rene di topo come rivelato con i lectinconiugati. J Histochem Cytochem. 1987;35:55–65.
31. Smith LA, Bukanov NO, Husson H, et al. Sviluppo della malattia di polycystickidney nei topi renali cistici giovanili: approfondimenti sulla patogenesi, sulle anomalie ciliari e sulle caratteristiche comuni con la malattia umana. J AmSoc Nephrol. 2006;17:2821–2831.
32. Liu S, Lu W, Obara T, et al. Un difetto in una nuova chinasi della famiglia Nek provoca una malattia renale cistica nel topo e nel pesce zebra. Sviluppo.2002;129:5839–5846.
33. Franke M, Baeßler B, Bechtel J, et al. Mappatura T2 a risonanza magnetica e imaging ponderato in diffusione per la diagnosi precoce della cistogenesi e della risposta alla terapia in un modello murino di malattia del rene policistico.Reneint. 2017;92:1544–1554.
34. Barry DM, McMillan EA, Kunar B, et al. Determinanti molecolari della specializzazione vascolare del nefrone nelrene. Nat Comune. 2019;10:5705.
35. Perretta-Tejedor N, Jafree DJ, Long DA. Comunicazione endoteliale-epiteliale in policisticorenemalattia: ruolo della segnalazione del fattore di crescita endoteliale vascolare. Segnale cellulare. 2020;72:109624.
36. Srivastava S, Molinari E, Raman S, Sayer JA. Molte malattie geniche? Genetica della nefronoftisi (NPHP) e malattie associate a NPHP. Front Pediatr. 2017;5:287.
37. Fry AM, O'Regan L, Sabir SR, Bayliss R. Regolazione del ciclo cellulare della famiglia NEK di protein chinasi. J Cell Sci. 2012;125:4423–4433.
38. Otto EA, Trapp ML, Schultheiss UT, et al. Le mutazioni di NEK8 influenzano la localizzazione ciliare e centrosomiale e possono causare nefronoftisi. J Am Soc Nephrol. 2008;19:587–592.
39. Wilson PD. Polarità apico-basale negli epiteli della malattia del rene policistico. Biochim Biophys Acta. 2011;1812:1239–1248.
40. Happé H, Leonhard WN, van der Wal A, et al. La lesione tubulare tossica nei reni di topi con delezione Pkd1- accelera la cistogenesi accompagnata da polarità cellulare planare disregolata e vie di segnalazione Wnt canoniche. Hum Mol Genet. 2009;18:2532–2542.
41. Piontek K, Menezes LF, Garcia-Gonzalez MA, et al. Un interruttore di sviluppo critico definisce la cinetica della formazione di cisti renali dopo la perdita di Pkd1. Nat Med. 2007;13:1490–1495.
42. Ikoma M, Yoshioka T, Ichikawa I, Fogo A. Meccanismo dell'unicità della suscettibilità dei glomeruli corticali profondi della maturazionerenialla sclerosi glomerulare focale grave. Pediatr Ris. 1990;28:270–276.
43. Preibisch S, Saalfeld S, Tomancak P. Cuciture 3D piastrellate ottimali a livello globale (Tridimensionale) acquisizioni di immagini microscopiche. Bioinformatica. 2009;25:1463–1465.