I glicosidi totali della cistanche deserticola promuovono il recupero della funzione neurologica inducendo la rigenerazione neurovascolare tramite il percorso Nrf- 2/Keap-1 nei ratti MCAO/R-Ⅱ

I TG promuovono il rimodellamento neurale nei ratti feriti da I/R

Secondo numerosi studi, la neurogenesi dopo un ictus può migliorare significativamente il recupero funzionale. La sinaptofisina (SYN), le proteine ​​della densità postsinaptica 95 (PSD-95) e la proteina associata ai microtubuli 2 (MAP-2) sono state utilizzate come marcatori per esaminare la plasticità neuronale nella penombra ischemica della corteccia. Per valutare gli effetti del trattamento con TG, PS e OS sulla neurogenesi nei ratti feriti da I/R, sono stati eseguiti l'immunofluorescenza e il western blot per le espressioni SYN, PSD95 e MAP-2. Come mostrato nelle Figure 9 e 10, i livelli di espressione SYN, PSD95 e MAP-2 nei ratti I/R dopo 14 giorni di riperfusione sono diminuiti rispetto ai ratti NOR, mentre la cura con TG e PS potrebbe aumentare significativamente. regolare i loro livelli di espressione. Il gruppo OS non ha avuto cambiamenti significativi rispetto al gruppo MOD. I dati hanno indicato che la guarigione con TG e PS è riuscita in modo drammaticopromuovere il rimodellamento neurale dopo la lesione I/R. 

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I TG alterano le espressioni Nrf-2 e Keap-1 nei ratti feriti da I/R

Lo stress ossidativo è il principale meccanismo patogeno nel danno da I/R. Gli studi hanno verificato che Nrf-2 è un regolatore principale delle risposte antiossidanti. Per studiare le risposte ossidative mediate da Nrf-2 e Keap-1 dopo lesione I/R, abbiamo valutato la risposta citoplasmatica

espressione e traslocazione nucleare di Keap-1. Nel frattempo, è stata analizzata anche l'espressione di Nrf-2 nei tessuti cerebrali dei ratti feriti da I/R (Figure 10 e 11). Secondo l'analisi di immunofluorescenza, Nrf-2 è risultato localizzato principalmente nel citoplasma del gruppo NOR. Nel gruppo TG, l'espressione di Nrf-2 nella localizzazione citoplasmatica era sottoregolata, ma sovraregolata nel nucleo, ed è stata osservata anche una diminuzione dell'espressione di Keap-1. I dati hanno mostrato che la protezione cerebrale dei TG potrebbe essere associata alla modulazione di Nrf-2 e Keap-1.

I TG attenuano lo stress ossidativo del tessuto cerebrale nei ratti feriti da I/R

Per confermare gli effetti antiossidanti dei TG, sono state valutate le attività di SOD, CAT, GSH-Px e MDA in ratti feriti da I/R. Nella Figura 12, il contenuto di MDA era marcatamente aumentato nel gruppo MOD e, allo stesso tempo, le attività di SOD, CAT e GSH-Px erano diminuite, rispetto ai ratti normali. Al contrario, il trattamento con TG ha portato ad una significativa diminuzione del contenuto di MDA e ad un aumento delle attività di SOD, CAT e GSH-Px. Questi risultati hanno ulteriormente confermato l’attività antiossidante dei TG.

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DISCUSSIONE

Molti studi suggeriscono che la C. deserticola della MTC abbia estese attività biologiche, ad esempio migliorando la capacità di apprendimento, la memoria e l'immunità. Tuttavia, i componenti attivi di C. deserticola per la neuroprotezione rimangono poco chiari. Il lavoro attuale mira a schermare i componenti attivi daC. deserticola contro l'ictus ischemicosul modello MCAO/R. Tre estratti di C. deserticola (TG, PS e OS) sono stati utilizzati per valutare i loro effetti sui ratti MCAO/R, nonché i possibili meccanismi.

L’ictus è una malattia cerebrovascolare acuta comune. Studi epidemiologici mostrano che l’ictus è più comune negli uomini che nelle donne. Pertanto, nel nostro esperimento, per i test sono stati adottati ratti maschi. I nostri risultati hanno dimostrato che l’induzione I/R ha accelerato lo stress ossidativo e il volume dell’infarto, rompendo la BBB e portando a lesioni nervose e cerebrovascolari. Dopo lo screening, è stato scoperto che i trigliceridi riducono il volume dell'infarto e promuovono il rimodellamento neurale e l'angiogenesi. Inoltre, è stato osservato che i TG mantengono l'integrità della BBB dopo la lesione I/R. Al contrario, PS e OS non apportano alcuna riduzione significativa al danno da I/R. Pertanto, i TG sono considerati la principale frazione attiva di C. deserticola per la neuroprotezione, potenzialmente attraverso la promozione del rimodellamento neurale, dell'angiogenesi e dell'integrità della BBB attraverso l'attivazione del percorso Nrf- 2/Keap-1.

Prove crescenti indicano che l’instaurazione di un’efficace circolazione collaterale è significativamente importante per evitare la formazione di infarto e penombra ischemica e rappresenta un trattamento fondamentale nella fase iniziale dell’ictus ischemico. La proliferazione delle cellule endoteliali vascolari e delle cellule muscolari lisce dopo l'infarto ischemico determina l'instaurarsi di circoli collaterali. Tuttavia, i modelli di ischemia hanno un fenomeno comune, ovvero lo stress ossidativo è ampiamente presente nella microcircolazione cerebrale. I dati degli studi hanno dimostrato che un gran numero di antiossidanti possono disturbare la funzione della BEE e le proprietà dell'angiogenesi. CD31 e a-SMA sono rispettivamente i marcatori delle cellule endoteliali vascolari e delle cellule muscolari lisce. Per studiare l'effetto della suddetta proliferazione cellulare degli estratti di C. deserticola, abbiamo esaminato le espressioni di CD31 e a-SMA nell'omogenato di penombra ischemica cerebrale. I nostri dati hanno mostrato che i TG migliorano sorprendentemente le espressioni di CD31 e a-SMA. Tuttavia, non sono state riscontrate differenze significative tra i gruppi PS e OS. Pertanto, abbiamo dedotto che i TG possono ridurre il danno cerebrale promuovendo l'angiogenesi attraverso l'aumento delle espressioni di CD31 e a-SMA, mentre PS e OS non forniscono tale protezione dal danno cerebrale. Questi risultati hanno ulteriormente confermato che solo i TG potrebbero prevenire il danno cerebrale da I/R.

L’ictus ischemico può essere considerato il risultato di un’ischemia cerebrale causata da un deterioramento della plasticità neuronale o dal rimodellamento delle aree cerebrali. La maggior parte dei pazienti colpiti da ictus soffre di deficit neurologici. L’attivazione della neurogenesi è una strategia promettente per i pazienti colpiti da ictus per migliorare le loro funzioni neurologiche. La neurogenesi partecipa direttamente al recupero della funzione neurologica dopo una lesione I/R cerebrale. Precedenti ricerche mostrano che i TG possono migliorare il tasso di sopravvivenza delle cellule piramidali dell’ippocampo e indurre la neurogenesi. Lo stress ossidativo provoca la perdita di neuroni durante molte malattie, come il morbo di Parkinson, l'ictus e così via. Nrf-2 trascrive molti geni correlati alla neuroprotezione nella regione del promotore, tra cui principalmente SOD, MDA, CAT e g-glutamil cisteina ligasi, ecc. SYN, PSD-95 e MAP{{ 4}} proteine, che sono strettamente associate alla formazione sinaptica e alla neurotrasmissione, possono essere considerate marcatori della plasticità neuronale di ricerca nella regione della penombra ischemica. Dopo lo studio, abbiamo scoperto che la cura con i TG potrebbe aumentare significativamente le espressioni di PSD95, SYN e MAP-2, indicando che la protezione cerebrale dei TG era correlata con una maggiore plasticità neuronale durante l'I/R. Tuttavia, è un peccato che non vi sia alcuna differenza evidente tra i gruppi PS e OS. Questi risultati hanno indicato che i TG potrebbero migliorare la neuroplasticità dopo una lesione I/R cerebrale.

La ricerca di imaging su pazienti con ictus ha mostrato che la disfunzione della BBB può essere considerata un attributo sorprendente del cervello peri-ischemico (Bang et al., 2007). I TJ, che sono composti da proteine ​​citoplasmatiche, proteine ​​transmembrana e molecole di adesione di giunzione tra cellule endoteliali capillari, sono molto importanti per mantenere l'integrità della BBB (Ye et al., 2019). Tra questi, ZO-1, claudina-5 e occludina sono le proteine ​​più importanti nei TJ. Prove crescenti indicano che l’aumento della permeabilità della BEE indotta dall’ischemia è generalmente correlato alle alterazioni di ZO-1, claudina-5 e occludina (Cao et al., 2016a; Page et al., 2016; Yu et al., 2017; Liu et al., 2018). In questo lavoro, i risultati hanno dimostrato che sebbene i TG potessero aumentare significativamente l'espressione delle proteine ​​ZO-1, claudina-5 e occludina nei tessuti cerebrali indotti da MCAO, né i PS né gli OS lo hanno fatto. La BBB è costituita da cellule endoteliali cerebrali ed è strettamente associata ai periciti (Nyul-Toth et al., 2016). I periciti sono vitali per l'integrità della BBB (Bell et al., 2010). L'ictus ischemico innesca la morte dei periciti e il distacco dalle cellule endoteliali cerebrali nella fase acuta, destabilizzando così la microvascolarizzazione e alterando le proprietà della BBB (Zechariah et al., 2013). I nostri dati hanno mostrato che i trigliceridi potrebbero aumentare la copertura dei periciti sui capillari e aumentare i livelli di espressione di ZO-1, claudin-5 e occludin. Questi fenomeni hanno dimostrato che i TG potrebbero proteggere efficacemente l’integrità della BBB dopo una lesione I/R cerebrale. In sintesi, i trigliceridi possono attenuare il danno cerebrale in molteplici modi, come promuovere l’angiogenesi, migliorare la plasticità neuronale e mantenere l’integrità della BBB.

Abbiamo quindi studiato la via di segnalazione per esplorare il meccanismo alla base della protezione cerebrale dei TG. Il processo di danno da I/R è multifattoriale e quindi numerosi meccanismi sono coinvolti nella patogenesi. Lo stress ossidativo è un fattore di rischio fondamentale che contribuisce al danno cerebrale indotto da I/R, come il danno alla struttura della BEE, la disfunzione endoteliale vascolare e l’aggravamento del danno neuronale ischemico. Pertanto, lo stress ossidativo è diventato un obiettivo terapeutico attraente nel danno cerebrale indotto da I/R. Gli enzimi di fase 2, mediati dal fattore nucleare E2-correlato al fattore-2 (Nrf-2), sono stati considerati un mezzo importante attraverso il quale i neuroni si proteggono dallo stress ossidativo. Prove crescenti indicano che l'attivazione di Nrf-2 durante I/R è un potenziale bersaglio terapeutico per la neuroprotezione. Nrf-2, come importante regolatore della difesa antiossidante endogena, media il livello di eme ossigenasi 1 (HO-1) e altri enzimi antiossidanti, come NAD(P)H chinone ossidoreduttasi 1 (NQO1), SOD, CAT, GSH e MDA. Inoltre, Nrf-2 svolge un importante ruolo regolatore nell'angiogenesi. Il presente studio mostra che Nrf-2 può essere significativamente potenziato e attivato nel processo di sviluppo vascolare.

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Come descritto in precedenza, i TG contengono molti composti bioattivi, ad esempio echinacoside, tubuloside A, acteoside, isoacteoside e 2'-acetilacteoside, e alcuni di essi hanno mostrato funzioni neuroprotettive dopo lesioni I/R cerebrali. L'echinacoside ha molti effetti farmacologici, come antiossidante, antisenescenza, neuroprotettiva, antinfiammatoria, promotrice della cicatrizzazione, epatoprotettiva, promotrice della formazione ossea e attività antitumorale. Recentemente, l’echinacoside è stato identificato come un potente antiossidante nel sistema nervoso centrale. L'echinacoside può ridurre il contenuto di MDA e migliorare le attività di SOD e GSH-Px nel danno cerebrale da ischemia e l'analisi del docking molecolare ha mostrato che l'echinacoside può legarsi a Keap-1, portando alla traslocazione nucleare Nrf-2. Lo studio di Xia ha dimostrato che l’acteoside potrebbe ridurre il volume dell’infarto e il contenuto di acqua cerebrale per migliorare i deficit neurologici nei ratti MCAO/R mitigando lo stress ossidativo. Altri studi hanno dimostrato che l'isoacteoside potrebbe aumentare le attività degli enzimi antiossidanti cellulari, SOD e CAT nelle cellule V79-4 trattate con H2O. Sulla base dei rapporti sopra riportati sui composti attivi contenuti nei TG, è possibile dedurre che i TG potrebberoproteggere dall’ictus ischemico attraverso le vie antiossidanti.

Li ha riferito sugli effetti neuroprotettivi dei glicosidi feniletanoidi (PhG) sull'apoptosi indotta da H2O2- sulle cellule PC12 attraverso la via Nrf2/ARE (Li et al., 2018). Questi PhG sono stati significativamente soppressi innescando la traslocazione nucleare di Nrf2 e aumentando le espressioni di HO-1, NQO1, subunità catalitica del glutammato cisteina ligasi (GCLC) e subunità modificata della glutammato cisteina ligasi (GCLM) (Li et al., 2018 ; Gong et al., 2019). Pertanto, questi risultati suggeriscono che il percorso Nrf-2/ARE svolge un ruolo cruciale negli effetti protettivi mediati da PhG sulle cellule neuronali. Allo stesso modo, in questo studio, abbiamo scoperto che i trigliceridi potrebbero diminuire il livello di MDA e aumentare i livelli di SOD, CAT e GSH-Px nei ratti I/R. Nel frattempo, i TG potrebbero sovraregolare l'espressione di Nrf2 nel nucleo, sottoregolare l'espressione corrispondente nel citoplasma e diminuire significativamente l'espressione di Keap-1. Pertanto, il percorso Nrf-2/Keap-1 potrebbe essere coinvolto negli effetti neuroprotettivi mediati dai TG. In futuro, un'ulteriore convalida di questo percorso verrà eseguita in colture cellulari in vitro con modelli di danno da privazione/riossigenazione di ossigeno-glucosio. Inoltre, nel nostro studio sono stati somministrati estratti di C. deserticola per 14 giorni continuativi. Poiché la neurogenesi adulta influenzerebbe l'interpretazione degli effetti neuroprotettivi durante 14 giorni di riperfusione, la neurogenesi non può essere esclusa dal nostro attuale disegno sperimentale nell'esplorazione dell'effetto neuroprotettivo dei CT. Questo è il limite della nostra ricerca.

In conclusione sono i TG di C. deserticola che possonopotenziare l’angiogenesi e la neurogenesicosì come mantenere l'integrità della BBB nei ratti con lesioni I/R, ma non nei PS e negli OS. Gli effetti potrebbero essere mediati dall'attivazione del percorso Nrf-2/Keap-1.

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