Miglioramento della proteomica top-down del tessuto cerebrale con FAIMS Parte 3

Un'osservazione immediata ed evidente è che quanto più alto è il percentile di abbondanza, tanto maggiore è la probabilità di identificazione con TDP. In altre parole, TDP identifica principalmente proteine ​​altamente abbondanti.

Invecchiando, molte persone scoprono che la loro memoria è diminuita. Questo è un fenomeno comune, soprattutto dopo aver sperimentato stress mentale a lungo termine, mancanza di sonno e diete squilibrate.

Ma sapevi che un modo per aiutarci a migliorare la nostra memoria è aumentare l'assunzione di proteine ​​in abbondanza? Le proteine ​​ad alta abbondanza sono ricche di aminoacidi, che possono sintetizzare una molecola chiamata neurotrasmettitore nel cervello e anche promuovere la crescita e l'attività dei neuroni. I neuroni sono le unità più basilari del cervello e sono la chiave delle nostre capacità di apprendimento e memoria. Pertanto, l’elevata abbondanza di proteine ​​può migliorare la nostra memoria migliorando la funzione dei neuroni.

La ricerca ha anche dimostrato la relazione tra proteine ​​e memoria. Ad esempio, uno studio ha scoperto che rispetto a una dieta ricca di proteine, una dieta a basso contenuto proteico porta a un declino delle funzioni cerebrali, comprese l’attenzione e la memoria.

Quindi, se vuoi migliorare la tua memoria, potresti anche aggiungere alla tua dieta alcuni alimenti ricchi di proteine, come pollo, pesce, manzo, uova, tofu, ecc. Naturalmente, dovresti anche prestare attenzione all'equilibrio e la diversità della tua dieta, e non puoi mangiare solo un tipo di cibo.

In breve, le proteine ​​in abbondanza possono aiutare a migliorare la nostra memoria. Se vuoi avere una memoria migliore, potresti anche iniziare con la tua dieta e provare a mangiare quanti più cibi ricchi di proteine ​​possibile! Ciò dimostra che dobbiamo migliorare la nostra memoria, e Cistanche può migliorare significativamente la memoria perché può anche regolare l'equilibrio dei neurotrasmettitori, come ad esempio aumentando i livelli di acetilcolina e fattori di crescita, che sono molto importanti per la memoria e l'apprendimento. Inoltre, Cistanche può anche migliorare il flusso sanguigno e promuovere l'apporto di ossigeno, il che può garantire che il cervello ottenga nutrimento ed energia sufficienti, migliorando così la vitalità e la resistenza del cervello.

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Circa la metà dei geni identificati dai set di dati top-down (con o senza FAIMS) erano contenuti nel 20% più alto dei contenitori di abbondanza per l'analisi bottom-up (Figura 6A). Al contrario, 71 geni possono essere trovati solo nei set di dati top-down (contenitore "NA") (Figura 6A).

Questi geni sembravano rappresentare proteine ​​relativamente corte (<150 AA) and contained numerous basic Lys/Arg residues which, presumably, precluded their ability to be detected by bottom-up analysis. 

Ad esempio, all'interno del contenitore top-down erano incluse proteine ​​istoniche come H3C1, H4C1, H1–4 e H2BC12. Come anticipato, abbiamo scoperto che FAIMS potrebbe migliorare le identificazioni in percentili più bassi rispetto a "No FAIMS", aumentando la profondità del proteoma osservabile.

Determinando il rapporto tra FAIMS e "No FAIMS" in tutti i percentili, un aumento apprezzabile delle identificazioni al di sotto del 40° percentile è evidente all'interno dei CV nell'intervallo da -40 a -50 (Figura 6B).

Tuttavia, se si considera il numero assoluto di geni, il principale contributo del vantaggio FAIMS è l'ampliamento dello spettro di identificazioni in tutti i percentili di abbondanza.

Relazione tra CV FAIMS e Trasmissione delle Proteoforme

Con FAIMS, abbiamo anche notato una tendenza tra FAIMS CV e peso molecolare del proteoforma (Figura 7). A -50 CV, la massa mediana del proteoforma è ~5 kDa e aumenta fino a ~15 kDa a -20CV.

Sulla base di queste distribuzioni di massa (Figura 7), i CV inferiori a −50 V sembrano adatti per esperimenti di proteomica top-down o middle-down, mentre i CV superiori a −50 V forse avvantaggiano gli esperimenti peptidomici o bottom-up.

La tendenza osservata del peso molecolare si estende presumibilmente oltre -20 CV; tuttavia, abbiamo limitato la nostra ricerca a -20 CV in base al calo delle identificazioni di proteoforme e geni che ha portato a rendimenti decrescenti nella copertura della sequenza del proteoma per esecuzione.

Dovremmo notare che un lavoro precedente utilizzando FAIMS ha scoperto che +40 CV è la tensione ideale per trasmettere una catena pesante mAb NIST (∼51 kDa) e −20 CV era la migliore per la corrispondente catena leggera (∼23 kDa), supportando l'idea che la tendenza che osserviamo si estende a CV FAIMS positivi.45

È interessante notare che, sebbene molti spettri che identificano una singola proteoforma fossero limitati a essere trovati entro un intervallo di 10 V (3599 su 5165), sono state osservate sette proteoforme nell'intero intervallo di CV da -50 a -20. Presumibilmente, ciò può essere attribuito alla loro elevata abbondanza nel campione, in particolare nel caso dell'ubiquitina (UBB), della proteina basica della mielina e della proteina legante l'acilCoA.

Tuttavia, è anche probabile che i diversi stati di carica di queste proteoforme adottino diverse conformazioni in fase gassosa a seconda della loro isomerizzazione dei protoni, influenzandone la mobilità.42

Queste sette proteoforme ci hanno permesso di studiare come l'inviluppo dello stato di carica viene trasmesso in modo differenziale attraverso la modulazione di CV. Come proxy per la distribuzione dello stato di carica su ciascun CV, abbiamo utilizzato lo stato di carica mediano basato sulle corrispondenze dello spettro proteoforme (PrSM) identificati su ciascun CV e abbiamo monitorato come questo valore è cambiato in funzione del CV a partire da −50 CV.

Le scansioni MS1 nella Figura S3 dimostrano come lo stato di carica mediano PrSM traccia la distribuzione dello stato di carica di UBB. Di queste sette proteoforme, quattro seguivano una relazione inversa, con lo stato di carica mediano osservato che aumentava al diminuire del CV (Figura 8).

Vale la pena notare che questa tendenza è stata generalmente osservata con peptidi e piccole proteine.56,62–64 Sorprendentemente, tre proteoforme hanno mostrato la relazione opposta in cui la diminuzione del CV ha ridotto gli stati di carica mediani osservati (Figura 8).

Un esame superficiale della massa media dei precursori tra i due gruppi suggerisce che i precursori più grandi hanno maggiori probabilità di favorire stati di carica più elevati quando il CV diminuisce.

Per convalidare ulteriormente queste relazioni, abbiamo ampliato questa analisi per includere proteoforme che sono state identificate all'interno di un intervallo più modesto, ma comunque ampio, di 20-30 CV (n=256 proteoforme). Qui, proteoforme la cui carica mediana si è spostata più di una carica attraverso l'intera gamma di CV è stata suddivisa in due gruppi diversi a seconda della direzione di tale spostamento.

Coloro che hanno spostato meno di una carica sono stati considerati "neutrali" rispetto al cambio di CV. Analogamente ai risultati precedenti, i precursori più grandi avevano una probabilità significativamente maggiore di essere associati a una relazione inversa tra gli stati di carica osservati e CV (Tabella S2).

Con la diminuzione del CV, la maggior parte delle proteoforme sembrava trasmettere in stati di carica inferiore (n=177) rispetto a quelli che preferivano stati di carica più elevata (n=39). Il resto (n=40) è stato considerato "neutro" rispetto ai cambiamenti nel CV.

Le proteoforme raggruppate all'interno del gruppo neutro hanno dimostrato una massa media di precursori tra i gruppi inverso e diretto, suggerendo ancora una volta che la massa della proteoforma è intrinsecamente legata a questo comportamento.

Tuttavia, altri parametri basati sulla sequenza primaria come la composizione di aminoacidi basici/acidi e l'indice alifatico non erano significativamente correlati (Tabella S2).

Sebbene le proteine ​​introdotte nella fase gassosa siano presumibilmente denaturate, fattori tipicamente associati alle proteine ​​native come il momento di dipolo o la sezione d'urto di collisione possono avere un valore predittivo migliore nei confronti di questo fenomeno.64-66 I nostri risultati dimostrano come il CV può essere utilizzato per filtrare proteine ​​di diversa natura masse e come l'involucro dello stato di carica di una proteina può essere trasmesso in modo differenziale anche attraverso FAIMS.

Utilità dei frammenti proteici negli esperimenti TDP

Sorprendentemente, un numero significativo di proteoforme da noi identificate erano frammenti di proteine ​​più grandi. Abbiamo scoperto che solo il 25% delle proteoforme uniche identificate coprivano più della metà della sequenza della proteina da cui derivavano.

Questo 25% aveva una massa media di 11,4 kDa rispetto al restante 75% che aveva una massa media di 5,7 kDa. Diversi fattori possono contribuire a questa osservazione, alcuni dei quali sono indipendenti dal FAIMS.

Ad esempio, questi frammenti stessi possono essere prodotti di scissione proteolitica prodotti in condizioni omeostatiche normali come parte del "degradoma" cellulare,67 o nonostante le varie precauzioni prese, introdotte durante l'intervallo post mortem e la manipolazione del campione.

Il tessuto del sistema nervoso centrale è una ricca fonte di peptidi di segnalazione noti come "neuropeptidi" che comunemente derivano anche da proteine ​​precursori molto più grandi.68

Facendo riferimenti incrociati alle nostre identificazioni di proteoforme con un database di neuropeptidi consolidato (NeuroPedia),69 siamo stati in grado di identificare diversi neuropeptidi di questo tipo tra cui vasostatina-1, secretoneurina, colecistochinina-58 desnonopeptide e neuropeptide y e molte varianti di sequenza non canoniche derivato dai noti geni che producono neuropeptidi.

Oltre ai fattori biologici, alcuni parametri dello strumento possono influenzare anche l'osservazione dei frammenti proteici. Ad esempio, basse tensioni di "frammentazione" all'interno della sorgente (tra 10 e 20 V) possono essere generalmente utilizzate per rimuovere addotti e desolvatare gli ioni proteici, mentre tensioni più elevate possono produrre dissociazione indotta dalla fonte.

Tuttavia, la suscettibilità dei legami ammidici alla dissociazione può variare ampiamente e, all'aumentare delle dimensioni di una proteina, aumenta anche la probabilità che contenga legami ammidici labili come Xaa-Pro.70–73 Poiché gli ioni b e y possono essere prodotti inavvertitamente attraverso questo meccanismo, anche a basse tensioni della sorgente, abbiamo deciso di evitare di applicare la tensione della sorgente per ridurre la possibilità di introdurre ioni frammento nello strumento.

È anche possibile che le proteine ​​siano suscettibili a eventi di frammentazione mentre attraversano i campi elettrici creati nel FAIMS. Tuttavia, non ci si aspetta che questi frammenti abbiano la stessa mobilità dello ione genitore, con l’avvertenza che ciò dipende probabilmente anche dalla dimensione del frammento rispetto allo ione precursore.

Infine, vale la pena sottolineare alcuni fattori che possono influenzare l’osservazione di proteoforme più piccole (<∼15 kDa). First and foremost is the signal spreading that occurs as the size of a proteoform increases.74 

Questa diffusione del segnale può essere in gran parte attribuita all’inviluppo dello stato di carica e alle distribuzioni isotopiche di ciascuno stato di carica. Specifico per la nostra configurazione sperimentale è stato l'uso di un filtro MWCO di dimensioni 3K come fase di filtrazione finale nella nostra preparazione del campione, che in questo caso è stato scelto per garantire che le proteoforme di amiloide-beta più piccole potessero essere catturate in modo efficiente se fossero presenti.

Fattori strumentali generali possono anche creare una distorsione verso le piccole proteoforme, inclusa la regolazione del quadrupolo, la cattura elettrodinamica e le collisioni con le molecole di gas residuo nella cella Orbitrap che portano a un decadimento più rapido del transitorio per molecole più grandi.75 Indipendentemente da queste distorsioni o dall'esatta origine dei frammenti, possono ancora fornire informazioni sul proteoma.

Questi frammenti sono particolarmente utili nel contesto delle malattie neurodegenerative in cui le interruzioni della proteostasi sono comunemente collegate alla patologia.76,77

In effetti, i frammenti di tau si rivelano spesso neurotossici e svolgono un ruolo nella progressione delle tauopatie come l'AD.23-26In genere, i frammenti che osserviamo sono molto più grandi dei peptidi triptici e, in diversi casi in cui sono presenti molti frammenti per una particolare proteina , osserviamo una notevole copertura della sequenza.

Ciò è esemplificato esaminando i frammenti che forniscono copertura per la catena tubulina alfa-1B da circa 50 kDa (TUBA1B) e la sinapsina -1 da circa 70 kDa (SYN1), come mostrato nella Figura 9A, B, entrambe grandi proteine ​​che altrimenti sarebbero difficili da osservare nella loro forma intera nel TDP di un campione complesso.

Identificazione di proteoforme rilevanti per le malattie neurodegenerative

L'utilizzo di FAIMS con la nostra analisi top-down ha consentito l'identificazione di diverse varianti di giunzione Swiss-Prot e voci TrEMBL uniche, con 267 varianti di giunzione uniche e 96 voci TrEMBL (Tabella S3).

In particolare, osserviamo più PrSM che identificano in modo inequivocabile un'isoforma ORF alternativa (A{{0}}A0D9SF30) per la molecola di adesione delle cellule neurali 1 (NCAM1). Abbiamo anche osservato proteoforme derivate da geni che hanno ruoli noti in diverse malattie neurodegenerative, in particolare -sinucleina e PARK7.

In entrambi i casi, le proteoforme predominanti contengono la sequenza a lunghezza intera. È interessante notare che è stato scoperto che la maggior parte dei PrSM -sinucleina, sinucleina e (in misura minore) -sinucleina contengono uno spostamento di massa sconosciuto di circa 177 Da vicino al C-terminale (spettro -sinucleina a lunghezza intera con modifica sconosciuta, come mostrato nella Figura S4A) .

Questo spostamento di massa è stato osservato in precedenza nelle ricerche di database aperti e si trova generalmente in Asp o Gluresidues.78 Una potenziale spiegazione che corrisponde strettamente alla massa media e monoisotopica della modifica consiste in un ossigeno con tre atomi di ferro e nella perdita di sette atomi di idrogeno ( basato sull'adesione all'Unimod n. 1971).

Il confronto dei picchi isotopici dello ione del frammento ay242+ della -sinucleina (Figura S4B) con uno spettro simulato contenente gli elementi sopra menzionati che si ritiene appartengano alla modifica sconosciuta (Figura S4C) dimostra la somiglianza tra le due distribuzioni isotopiche, con molti dei picchi teisotopici allineati entro 2 ppm l'uno dall'altro.

Va inoltre sottolineato che i picchi isotopici più a sinistra sono esclusivi degli isotopi del ferro presenti in natura e l'assenza di questi picchi è facilmente evidente quando lo spettro viene simulato senza contenere i tre atomi di ferro (Figura S4D), suggerendo fortemente che questa modificazione sconosciuta è molto probabilmente composta degli elementi proposti.

Studi precedenti hanno anche descritto l'elevata affinità dell'α-sinucleina per vari ioni metallici e la regione che osserviamo contenere questa modifica si sovrappone a residui noti per essere coinvolti nel legame, in particolare il motivo 119DPDNEA124 (Figura S5).79-81

I nostri dati suggeriscono anche che le regioni C-terminali di -sinucleina e -sinucleina hanno ruoli simili nel legame dei metalli poiché spettri multipli con lo stesso spostamento di massa sconosciuto sono stati abbinati a sequenze simili all'interno di queste proteine.

Per quanto riguarda la proteina mitocondriale PARK7, abbiamo notato uno spostamento di massa di circa 116.0 Da sul suo singolo residuo Cys del sito attivo, C106 (Figura S6). Una potenziale spiegazione con una simile succinilazione delta massis, una modifica che è attribuita allo stress mitocondriale e alle forme dovute all'aggiunta di fumarato da parte di Michael su un gruppo citiolo.82

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