La glicoproteina E troncata del virus varicella-zoster è un immunogeno ideale per la progettazione di un vaccino basato su Escherichia Coli

Il virus varicella-zoster (VZV) è un agente altamente infettivo responsabile sia della varicella che dell’herpes zoster. Nonostante l’elevata efficacia, permangono problemi di sicurezza e accessibilità con i vaccini autorizzati. Qui, abbiamo cercato di produrre un immunogeno VZV gE utilizzando un sistema di espressione di E. coli. Abbiamo scoperto che l’espressione solubile e la resa della proteina gE potrebbero essere migliorate tramite troncamenti del terminale C della proteina, facilitando così un processo di purificazione robusto e scalabile per la produzione di vaccini. Il gE troncato di piombo (aa 31–358), di seguito denominato tgE, era un monomero omogeneo in soluzione e mostrava un'eccellente antigenicità. Infine, abbiamo valutato e confrontato l'immunogenicità della tgE con la vodka LAV commerciale e il vaccino Shingrix. Abbiamo scoperto che la tgE adiuvata con alluminio era immunogenica rispetto alla vodka LAV. Quando adiuvato con AS01B, un'immunizzazione a due dosi di tgE ha mostrato una potenza paragonabile o migliore nelle risposte anticorpali e nell'immunità cellulo-mediata a quelle del vaccino Shingrix allo stesso dosaggio, soprattutto in termini di proporzione di IFN- - che esprime Cellule T CD4+. In conclusione, questo metodo di espressione tgE mediata da E. coli offre una strategia economica e scalabile per generare un immunogeno VZV gE ideale per lo sviluppo di vaccini sia contro la varicella che contro lo zoster.

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INTRODUZIONE

Il virus varicella-zoster (VZV) è un herpesvirus umano alfa patogeno che induce due principali categorie di malattie: l'infezione primaria da varicella, una malattia altamente contagiosa caratterizzata da un'eruzione cutanea simile a una vescica e lievi sintomi sistemici come febbre e malessere prevalentemente nei bambini; e herpes zoster (HZ), la riattivazione latente del virus in risposta a un sistema immunitario cellulare indebolito causato dall'invecchiamento che provoca un'eruzione vescicolare (HZ) dolorosa e localizzata con o senza diverse altre complicazioni (Cohen, 2013; Heininger e Seward, 2006; Zerboni et al., 2014). Sia la varicella che l’HZ possono essere prevenuti con vaccini a virus vivo attenuato (LAV). Il primo LAV per la prevenzione della varicella è stato sviluppato da Takahashi et al. (1974) basato sul ceppo del virus vOka e successivamente concesso in licenza come Varivax per uso di routine negli Stati Uniti. Ciò è stato seguito dallo sviluppo e dalla licenza di Zostavax per la prevenzione dell’HZ (Tseng et al., 2011). Sfortunatamente, nei 10 anni trascorsi dall’inizio delle vaccinazioni con Varivax, è stato confermato che quasi 1/3 dei casi di HZ sono associati al ceppo vOka (Galea et al., 2008), suggerendo che vOka può infettare e stabilire una latenza, come un virus selvatico -tipo virus e quindi riattivarsi per causare HZ. Inoltre, l’efficacia di Zostavax è inversamente proporzionale all’età del paziente al momento della somministrazione, con un aumento dell’età associato ad una minore efficacia (Oxman et al., 2005). Studi precedenti hanno dimostrato che la glicoproteina E (gE) VZV è la glicoproteina virale più abbondante sull'involucro del virione e sulla superficie cellulare infetta. GE è anche uno dei più importanti antigeni protettivi del VZV in grado di indurre l'immunità cellulare e umorale durante l'infezione naturale della varicella e dopo la vaccinazione vOka (Arvin, 1992; Oliver et al., 2016). Recentemente, un vaccino ricombinante a subunità HZ, Shingrix (HZ/su), è stato approvato per la prevenzione dell’HZ e della nevralgia posterpetica (PHN) associata negli adulti di età pari o superiore a 50 anni (Shah et al., 2019; Syed, 2018). Negli studi clinici, Shingrix ha indotto un’immunità cellulo-mediata (CMI) efficiente, specifica per VZV, con un’efficacia complessiva del vaccino del 97,2% tra i partecipanti maggiore o uguale a 50 anni e un tasso di protezione del 91,3% nei partecipanti maggiore o uguale a 70 anni. Questi risultati indicano collettivamente un rischio significativamente ridotto di HZ negli individui vaccinati indipendentemente dall’età e quindi un’opzione vaccinale più potente rispetto a ZOSTAVAX (Lal et al., 2015; Shah et al., 2019).

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Shingrix è progettato a partire da un antigene gE ricombinante espresso in cellule ovariche di criceto cinese (CHO) e un sistema adiuvante basato su liposomi (AS01B) contenente 3-Odesacil-4′-monofosforil lipide A (MPL) e Quillaja saponaria Molina, frazione 21 (QS21) (Dendouga et al., 2012). Tuttavia, le cellule CHO ricombinanti richiedono un lungo ciclo di produzione e sono associate a un complesso processo di purificazione che comporta costi di produzione elevati e una fornitura limitata. Pertanto, Shingrix non è una soluzione vaccinale ideale per un uso diffuso, in particolare nei paesi in via di sviluppo (Kim et al., 2012). I sistemi di espressione microbica offrono numerosi vantaggi rispetto ai sistemi di espressione dei mammiferi, tra cui crescita rapida, facilità di coltura e costi di produzione inferiori (Overton, 2014), e sono quindi ampiamente utilizzati nell'espressione e nella produzione di numerosi prodotti biofarmaceutici (Adkins e Wagstaff, 1998; Monie et al., 2008; Wu et al., 2012). Tuttavia, per la corretta espressione delle proteine ​​eucariotiche ricombinanti nei sistemi procariotici, è necessario superare diverse difficoltà durante la produzione, come il ripiegamento errato e la mancanza di modificazioni post-traduzionali (Singh e Panda, 2005). Nonostante queste difficoltà, i sistemi di espressione microbica potrebbero offrire un sistema ideale per la produzione di vaccini diffusa ed economicamente vantaggiosa e, pertanto, giustifica lo studio degli antigeni da un sistema di espressione di E. coli per la progettazione del vaccino VZV. In lavori precedenti, abbiamo mostrato l'espressione riuscita di una proteina gE (rgE) ricombinante nelle cellule di insetti e ottenuto proteine ​​purificate per l'immunizzazione dei topi e la produzione di mAb (Liu et al., 2015). Basandosi su questo lavoro, qui investighiamo se la proteina gE può essere espressa in E. coli. Abbiamo esplorato l'espressione solubile senza fusione degli antigeni candidati gE con un troncamento C-terminale (di seguito denominato gE troncato (tgE) o tgE) in E. coli e caratterizzato le proteine ​​tgE purificate. Mostriamo che la tgE purificata è antigenica simile alla gE nativa e capace di indurre titoli anticorpali elevati con attività neutralizzante vOka nei topi. Confrontando l'immunogenicità dell'antigene tgE generato nel nostro studio con LAV e Shingrix, scopriamo che il nostro antigene non solo mostra un'efficiente risposta umorale ma induce anche un CMI antigene-specifico. Nel complesso, la nostra strategia per l’E. coli per la produzione della proteina tgE può aprire la strada a un immunogeno alternativo prodotto industrialmente sia per la vaccinazione contro la varicella che per quella contro l’HZ.

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RISULTATI

Espressione e purificazione della tgE ricombinante in E. coli

Le sequenze di DNA che codificano per il dominio extracellulare VZV gE sono state preparate come costrutti con vari troncamenti N o C-terminali e clonate nel vettore pTO-T7 per l'espressione proteica in E. coli. Il dominio extracellulare a lunghezza intera di gE tendeva a formare corpi di inclusione in E. coli durante l'espressione e questo potrebbe essere migliorato con un troncamento del terminale C. Delle varie proteine ​​troncate, la migliore solubilità è stata ottenuta con il costrutto gE (aa 31–358) (Figura 1A), di seguito denominato gE o tgE troncato. La tgE candidata è stata espressa con successo come proteina ricombinante solubile e purificata dal surnatante dei lisati batterici utilizzando la cromatografia in tre fasi su scala di laboratorio per un'ulteriore valutazione e sviluppo come potenziale vaccino. Per la cattura è stata utilizzata una forte cromatografia a scambio anionico seguita da passaggi di cromatografia idrofobica e idrossiapatite ceramica (Figura 1B). Le fasi successive del processo di purificazione hanno visto un aumento della purezza di tgE su SDS-PAGE (Figura 1C). tgE è migrato come una banda di circa 40 kD e ha mostrato una buona reattività con l'anticorpo specifico 1B11 (Figura 1D). La resa complessiva è stata di circa 500 ug di tgE purificata per grammo di batteri.

Caratterizzazione del gE troncato

La cromatografia ad esclusione dimensionale ad alte prestazioni (HPSEC) e l'ultracentrifugazione analitica (AUC) sono state utilizzate per analizzare l'omogeneità e i coefficienti di sedimentazione delle proteine ​​purificate. Come controllo è stata utilizzata la proteina rgE purificata dal sistema cellulare dell'insetto (Liu et al., 2015). In HPSEC, la tgE è apparsa con un picco netto al tempo di ritenzione predominante di 16,1 minuti (Figura 2A), riflettendo un'elevata omogeneità per le proteine ​​tgE purificate. Negli esperimenti AUC, è stato osservato un picco di sedimentazione predominante a ~ 2,3 S (Figura 2B), che equivale a ~ 39,4 kD, indicando che tgE si presenta come monomero in soluzione. La calorimetria differenziale a scansione (DSC) è stata utilizzata per testare la stabilità termica della proteina tgE monitorando la capacità termica durante il processo di spiegamento termico. I profili DSC hanno mostrato solo una transizione termica durante lo spiegamento delle proteine ​​ad un valore della temperatura di transizione (Tm) di 63,80 gradi per tgE, paragonabile a quello di rgE (63,64 gradi) (Figura 2C). Per studiare l'integrità conformazionale delle proteine ​​tgE purificate, abbiamo analizzato l'antigenicità della tgE utilizzando un test ELISA, con le proteine ​​rgE purificate espresse nelle cellule di insetto che fungevano da controlli. Nel test ELISA sono stati utilizzati nove mAb in grado di riconoscere epitopi conformazionali (mAb 1B11, 4G4, 14G1) o epitopi lineari (4A2, 11B11, 11B12, 6H6, 10H6, 11E3) (Figura 3). Abbiamo trovato valori di concentrazione efficace mediana simili (EC50, ng mL−1) per le proteine ​​tgE e rgE per la maggior parte degli anticorpi ad eccezione di 1B11, che aveva una reattività quasi 10- volte inferiore, suggerendo la loro antigenicità simile. Questi risultati suggeriscono che gli epitopi chiave della rgE sono ben conservati nella proteina tgE.

Figura 1 (Colore online) Espressione e purificazione delle proteine. Una rappresentazione schematica della progettazione del costrutto tgE. Le cellule di E. coli sono state trasformate con plasmidi ricombinanti contenenti il ​​gene troncato gE (aa 31–358). B, Rappresentazione schematica del processo di purificazione della tgE. Il tgE è stato purificato dal surnatante lisato utilizzando la cromatografia in tre fasi. C, profilo SDS-PAGE di tgE durante il processo di purificazione. Il peso molecolare della tgE è di circa 40 kD. M: marcatore del peso molecolare. Corsia 1: surnatante separato dal lisato cellulare; corsia 2: frazione contenente tgE dal cromatografo Q-FF; corsia 3: frazione contenente tgE dal cromatografo CHT; corsia 4: frazione dal cromatografo butilico, contenente la proteina tgE ad elevata purezza. D, Immunoblot della tgE purificata.

Analisi delle risposte immunitarie indotte dalla tgE nei topi

Per confrontare l'immunogenicità di tgE con rgE, abbiamo formulato le proteine ​​con due adiuvanti comunemente usati per lavori di ricerca: adiuvante a base di alluminio Al-001 e adiuvante di Freund. I topi sono stati immunizzati tre volte alle settimane 0, 2 e 4 con un dosaggio di 1 ug sia per tgE che per rgE adiuvati. I titoli anticorpali specifici per gE e le risposte delle cellule T alla settimana 5 dopo la prima immunizzazione sono stati utilizzati per determinare l'immunogenicità di diverse formulazioni adiuvanti. I topi immunizzati con il vaccino tgE formulato con Al-001 hanno mostrato profili anticorpali simili ai topi del gruppo rgE e l'adiuvante di Freund ha mostrato un effetto di stimolazione migliore quando formulato con tgE rispetto a rgE (Figura 4A). I titoli di neutralizzazione non hanno mostrato differenze nei topi immunizzati con il vaccino tgE o rgE, con titoli neutralizzanti di ~103 per tgE formulati con i diversi adiuvanti (Figura 4B). Tuttavia, nell'analisi delle cellule T CD4+ degli splenociti mediante colorazione con citochine intracellulari (ICS), sia i vaccini tgE che quelli rgE hanno suscitato livelli simili di IFN- gE-specifico rispetto al gruppo salino (Figura 4C, ~{ {22}}.1% per i gruppi vaccini o per il gruppo soluzione salina) e solo una simulazione moderata di IL gE-specifica{{20}} (Figura 4D, ~0,2% per i gruppi vaccini vs. ~0,1 % per il gruppo salino). Presi insieme, questi risultati mostrano che tgE/Al-001 e l'adiuvante di tgE/Freund suscitano risposte immunitarie specifiche per gE paragonabili a quelle suscitate da rgE, con una risposta umorale particolarmente forte.

Valutazione del candidato vaccino contro la varicella tgE rispetto al LAV

Successivamente abbiamo valutato la produzione di anticorpi e la persistenza delle proteine ​​tgE adiuvate con alluminio nei topi BALB/c. Due gruppi di topi (n=5 per gruppo) sono stati immunizzati tre volte alle settimane 0, 2 e 4 con dosaggi diversi di 0,5 ug e 5 ug di tgE/Al{{ 8}} (Figura 5A e B). I profili di risposta anticorpale hanno mostrato che l'inoculazione primaria della proteina tgE ha suscitato titoli anticorpali elevati, con un aumento sostenuto dopo le due immunizzazioni di richiamo alle settimane 2 e 4, e raggiungendo un livello massimo alla settimana 6 prima di scendere lentamente a più di 1{{ 20}}4 nel periodo di monitoraggio. Diversi gruppi di dosaggio hanno condiviso profili di titoli anticorpali simili durante il periodo di monitoraggio, con titoli neutralizzanti elevati simili alla settimana 6. L'immunogenicità della tgE è stata valutata e confrontata con la vodka. La dose efficace a metà (ED50) nei topi è stata utilizzata come misura della sieroconversione, con un ED50 inferiore indicativo di una migliore immunogenicità. Topi Balb/c sono stati separati in gruppi e immunizzati per via intraperitoneale con tgE adiuvato con alluminio (1, 0.5, 0.25, {{50}}.125, {{ 54}}.0625, o 0.03125 ug; n{{30}}) o vaccino vOka (1,000, 500, 250, 125 o 62,5 pfu; n=6) in diluizioni seriali. I sieri sono stati raccolti dopo 4 settimane e testati utilizzando ELISA. La sieroconversione è stata analizzata secondo il metodo Reed e Muench (Figura 5C). Nei gruppi di età, i topi avevano tassi di sieroconversione dell’83%, 100%, 100%, 100%, 50% e 17% rispettivamente per i dosaggi di 1, 0,5, 0,25, 0,125, 0,0625 e 0,03125 ug. Nei gruppi contenenti vodka, i topi avevano tassi di sieroconversione più bassi, rispettivamente del 67%, 50%, 33%, 17% e 0% per i dosaggi di 1,000, 500, 250, 125 o 62,5 pfu. I valori ED50 erano 0,063 ug per tgE e 449,425 pfu per vOka, indicando che l'immunogenicità di tgE a un dosaggio inferiore di 0,3 ug era equivalente a quella ottenuta con una singola dose di vaccino contro la varicella contenente vOka (solitamente superiore a 2,{{78} } pfu per dosaggio).

Figura 2 Caratterizzazione delle proteine ​​tgE e rgE. A, profili HPSEC del tgE purificato. È indicato il tempo di ritenzione di gE. B, Analisi della velocità di sedimentazione della proteina tgE purificata. Il coefficiente di sedimentazione e il peso molecolare della tgE sono stati determinati in modo indipendente con i metodi c(s) e c(M). In (A) e (B), tgE è mostrato in nero e rosso in blu. C, Profili calorimetrici a scansione differenziale delle proteine ​​tgE e rgE purificate.

Figura 3 Reattività di tgE e rgE con mAb. I mAbs sono stati diluiti in serie e hanno reagito con proteine ​​tgE o rgE rivestite in un test ELISA. Le reazioni sono state rilevate utilizzando anticorpi anti-topo marcati con HRP. Sono stati misurati pozzetti duplicati sulla stessa piastra per ciascuna diluizione. I valori EC50 sono stati calcolati mediante l'adattamento del trend sigmoideo utilizzando il software GraphPad Prism.

Figura 4 Immunogenicità di tgE e rgE testate nei topi BALB/c 1 settimana dopo l'immunizzazione con tre dosi. A, Produzione di anticorpi nei topi per tgE e rgE formulati con diversi adiuvanti. B, Titoli anticorpali neutralizzanti nei topi per tgE e rgE formulati con diversi adiuvanti. C e D, Valutazioni delle risposte IFN e IL-2 specifiche per gE indotte dai vaccini tgE o rgE.

Figura 5 Test di immunogenicità del vaccino tgE formulato con alluminio nei topi BALB/c. A e B, Persistenza degli anticorpi e risposta anticorpale neutralizzante di tgE/Al-001. I titoli sono stati monitorati fino a 16 settimane. C, ED50 nei topi per tgE e vodka formulati con alluminio.

Valutazione del candidato vaccino tgE Zoster rispetto a Shingrix

Per confrontare l'immunogenicità del nostro vaccino tgE con Shingrix, la proteina tgE liofilizzata è stata formulata con l'adiuvante Shingrix, AS01B. Topi C57BL/6 sono stati immunizzati con due dosi di tgE/AS01B o Shingrix per via intramuscolare nel muscolo tibiale alle settimane 0 e 4. I livelli di anticorpi dopo la prima immunizzazione suggerivano che l'immunizzazione con Shingrix era sufficiente per indurre alti livelli di anticorpi anti-gE, significativamente superiori a quelli prodotti da tgE/AS01B; dopo la seconda immunizzazione, tuttavia, non è stata riscontrata alcuna differenza significativa nella produzione di anticorpi tra i due gruppi (Figura 6A). Per quanto riguarda i livelli di anticorpi neutralizzanti, un'immunizzazione con dose singola di tgE/AS01B ha portato alla produzione di quantità trascurabili di anticorpi neutralizzanti, significativamente inferiori a quelle prodotte da Shingrix. Tuttavia, ancora una volta, dopo l’immunizzazione di richiamo, non abbiamo potuto osservare alcuna differenza significativa in termini di produzione di anticorpi neutralizzanti tra i due gruppi (Figura 6B). Per verificare in che modo l'immunizzazione influisce sul CMI, i livelli di IFN- e IL-2 specifici per gE sono stati rilevati dopo la prima e la seconda immunizzazione utilizzando il test immunoassorbente legato all'enzima (ELISPOT) e la colorazione delle citochine intracellulari. L'immunizzazione tgE/AS01B ha indotto una scarsa risposta immunitaria umorale rispetto a una singola dose di Shingrix, ma ha mostrato una potenza paragonabile in termini di induzione di splenociti produttori di IFN- - e IL-2- (Figura 6C). Infatti, dopo la seconda immunizzazione, nel gruppo tgE/AS01B è stato rilevato un numero significativo di cellule produttrici di citochine specifiche per gE rispetto al gruppo di controllo con soluzione salina, che erano anche paragonabili o migliori di quelle del gruppo Shingrix (Figura 6D ). Risultati simili sono stati osservati nell'analisi della citometria a flusso, con osservazioni di proporzioni simili di cellule T CD4+ che esprimono IFN- - (Figura 6E), cellule T di IL-2-che esprimono CD4+ (Figura 6F) e cellule T IFN- -CD8+ (Figura 6G) tra i topi immunizzati tgE/AS01B e Shingrix, indipendentemente da un'immunizzazione singola o da una dose boost. Questi risultati dimostrano che la proteina tgE derivata dal sistema di espressione batterica può indurre risposte immunitarie sia umorali che cellulari quando formulata con adiuvanti appropriati, e quindi può essere considerata un antigene candidato per la generazione di un vaccino contro VZV.

Figura 6 Immunogenicità della tgE nei topi C57BL/6. Sono state somministrate dosi di 5 ug di tgE formulate con 50 μL di adiuvante AS01B. Questa era 1/10 della dose del vaccino Shingrix. L'immunizzazione è stata eseguita alle settimane 0 e 4. A, Confronto della produzione di anticorpi indotta dal vaccino tgE/AS01B rispetto a Shingrix. I titoli del siero sono stati determinati mediante test ELISA utilizzando piastre rivestite con rgE. B, Confronto della risposta anticorpale neutralizzante a vOka dopo la vaccinazione con vaccino tgE/AS01B o Shingrix. I titoli di neutralizzazione dell'antisiero alla settimana 2 (pannello di sinistra) e alla settimana 6 (pannello di destra) sono espressi come il reciproco della diluizione del siero risultante in un'inibizione del 50%. C, Valutazione delle risposte IFN e IL-2 specifiche per gE indotte dal vaccino tgE/AS01B o Shingrix alla settimana 2. I numeri di splenociti produttori di IFN- - e IL-2- sono stati calcolati dalla Saggio ELISPOT dopo restimolazione con un pool di peptidi gE. D, Valutazione delle risposte IFN e IL-2 specifiche per gE indotte dal vaccino tgE/AS01B o Shingrix alla settimana 8. I numeri di splenociti produttori di IFN- - e IL-2- sono stati calcolati dalla Saggio ELISPOT dopo restimolazione con un pool di peptidi gE. E–G, test di citometria a flusso per cellule CD4+ e CD8+ che esprimono citochine specifiche per gE. La percentuale di cellule T CD4+ che producono IFN, di cellule T CD4+ che producono IL-2- e di cellule T CD4+ che producono IFN- - sono state determinate le cellule tra gli splenociti.

DISCUSSIONE

Il VZV gE è uno dei principali bersagli della risposta immunitaria umorale e cellulo-mediata durante l'infezione naturale della varicella e dopo la vaccinazione VZV Oka. Shingrix (GSK) è un vaccino a subunità ricombinante comprendente un gE VZV espresso in cellule CHO e l'adiuvante AS01B a base di liposomi. Altro lavoro ha cercato di studiare vaccini a subunità contro l'HZ utilizzando proteine ​​gE generate da CHO o cellule di insetto formulate con nuovi adiuvanti (Cao et al., 2021; Lee et al., 2020; Luan et al., 2022a, Luan et al., 2022b; Wang et al., 2021; Wui et al., 2019; Wui et al., 2021). Qui, abbiamo studiato e dimostrato che la proteina gE potrebbe essere espressa e purificata in modo solubile da E. coli, e quindi formulata come candidato vaccino a subunità con un adiuvante appropriato per suscitare non solo un robusto titolo neutralizzante ma anche una forte risposta CMI.

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L'E. coli come sistema di espressione offre numerosi vantaggi: rapido tasso di crescita cellulare, condizioni di coltura poco costose e uno strumento efficiente e versatile per la produzione di proteine ​​ricombinanti. La ricerca sugli antigeni associati al virus dell'herpes ha ottenuto diversi successi utilizzando il sistema di espressione basato su E. coli. Un epitopo lineare neutralizzante gE (aa 121–135) è stato fuso con 149 aa della proteina del nucleo del virus dell'epatite B (HBc) per produrre VLP chimerici che potrebbero indurre anticorpi neutralizzanti specifici di VZV nei topi (Zhu et al., 2016). In un altro studio, una proteina gE omologa del virus della varicella Simian (SVV) è stata espressa in E. coli utilizzando un tag di fusione GST per generare antisiero gE (Gray et al., 2001). Finora non sono stati segnalati casi di una proteina gE VZV senza tag di fusione purificata da E. coli come candidata per il vaccino.

gE è costituito da tre regioni: un ectodomino idrofilo 544-aa con un peptide segnale (aa 1–30), una regione transmembrana idrofobica 17-aa e una regione della coda citoplasmatica 62-aa. Abbiamo studiato diverse molecole candidate con diversi tronchi nelle regioni N o C-terminali dell'ectodominio gE e abbiamo scoperto che l'espressione esogena di queste proteine ​​in E. coli era migliore utilizzando la porzione troncata (dati non mostrati). Un ectodomino gE intatto senza tag di fusione tende a formare corpi di inclusione quando espresso da E. coli ed è difficile da purificare. Tra i candidati al troncamento testati, la proteina gE (aa 31–358) ha mostrato un'elevata espressione solubile con minime difficoltà nella sua purificazione, nonché elevata purezza ed elevata omogeneità (Figura 1). Pertanto, questo costrutto di troncamento è stato considerato un candidato ideale per il vaccino antigene. Questa strategia di troncamento potrebbe avere un potenziale effetto sulle proprietà della proteina, in particolare sulla sua antigenicità. Avevamo precedentemente espresso gE ricombinante in cellule di insetto e purificato questo costrutto per immunizzare topi BALB/c, ottenendo anticorpi monoclonali da 70 gE per l'analisi degli epitopi (Liu et al., 2015). Attraverso la nostra analisi, abbiamo identificato aa 1–194 come regione immunodominante (dati non mostrati). Risultati simili sono stati ottenuti altrove, con mAb specifici per gE che indicavano che le regioni aa 109–123 e 160–316 erano le regioni responsabili del legame stabile degli anticorpi tra gli isolati varianti (Vafai, 1994). In un altro studio, utilizzando frammenti ibridi ricombinanti di gE-VLP, gli autori hanno identificato i residui 1-134 come la regione più antigenica della proteina gE e hanno dimostrato che il terminale C di gE (residui 303-623) contenente diversi residui di cisteina non riusciva a produrre particelle nel lievito (Fowler et al., 1995), suggerendo che l'espressione eterologa di gE dovrebbe considerare non solo l'antigenicità ma anche la facilità di espressione. Qui, abbiamo ottimizzato la lunghezza della proteina gE per la sua efficiente espressione solubile con riduzioni minime dell'antigenicità. La tgE ha mostrato una reattività simile alla maggior parte degli anticorpi nella Figura 3 così come l'rgE prodotto nelle cellule di insetti, suggerendo che gli epitopi chiave sono ben conservati nella proteina tgE purificata da E. coli. Tuttavia, uno studio ha dimostrato che gli epitopi delle cellule T immunodominanti CD4+ riconosciuti dai donatori del vaccino Shingrix erano dispersi nella proteina gE (Voic et al., 2020). L'immunogenicità della tgE nel nostro studio era identica a quella riscontrata per gE derivata da cellule CHO in Shingrix quando l'antigene combinato con l'adiuvante AS01B, con risposte umorali e CMI altrettanto efficienti, come mostrato nella Figura 5. Questi risultati indicavano che la gE troncata derivato dal sistema procariotico era buono quanto l’ectodominio gE intatto del sistema eucariotico in termini di antigenicità.

Cistanche tubulosa: migliora il sistema immunitario

Esistono notevoli differenze tra le proteine ​​gE derivate da diversi sistemi di espressione. Le differenze più importanti si notano con le modifiche post-traduzionali, in particolare la glicosilazione. I glicani O-linked delle glicoproteine ​​di membrana hanno rilevanza in termini di riconoscimento da parte delle cellule T e degli anticorpi degli epitopi dei glicopeptidi virali, e questo riconoscimento ha il potenziale di alto significato biomedico nei nostri tentativi di mediare la protezione immunitaria contro i virus utilizzando vaccini a subunità. La rimozione dei glicani in gE prodotti nelle cellule CHO-K1 ha comportato una riduzione del 17% della reattività con sieri VZV-positivi. Al contrario, la O-glicosilazione può interferire con l’immunoreattività degli epitopi delle cellule B: alcuni importanti epitopi sono bloccati da ulteriori glicani legati all’O (Nordén et al., 2019). Nel nostro studio, la tgE generata da E. coli sembra comportarsi altrettanto bene della rgE derivata dalle cellule dell'insetto in termini di immunoreattività e immunogenicità, suggerendo che la proteina tgE "nuda" è promettente come candidata al vaccino. È probabile che i vaccini con tgE come antigene inducano non solo titoli IgG elevati, indicativi del suo potenziale come vaccino contro la varicella a subunità senza un potenziale rischio di latenza del virus, ma anche un CMI elevato, indicativo del suo potenziale anche come vaccino contro lo zoster. Nel complesso, l’antigene gE derivato dal sistema di espressione batterica in questo studio offre una strategia molto più economica per lo sviluppo di vaccini VZV.

Riferimenti

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