Il tubuloside B della salsa Cistanche salva le cellule neuronali PC12 dall'apoptosi indotta dagli ioni 1-metil-4-fenilpiridinio e dallo stress ossidativo

introduzione

Dal punto di vista patologico, la malattia di Parkinson (MdP) sporadica è tipicamente caratterizzata da una perdita di neuroni catecolaminergici, in particolare di neuroni dopaminergici della substantia nigra pars compacta (SNc), e dalla presenza di caratteristici neuroni intraneurona| inclusioni chiamate corpi di Lewy nelle regioni cerebrali colpite. Nonostante una varietà di fattori siano stati implicati nella patogenesi della malattia di Parkinson, i meccanismi coinvolti nell'esordio e nella progressione della malattia rimangono incerti. Anche se la causa della malattia rimane sconosciuta, diverse linee di evidenza suggeriscono fortemente il coinvolgimento dello stress ossidativo, portando infine alla morte neuronale o all’apoptosi per l’eccessiva generazione di radicali liberi. Il fatto che il sistema dopaminergico del Nigral possa produrre alti livelli di radicali liberi e abbia livelli relativamente bassi di sistema di difesa ossidativa supporta ulteriormente questa ipotesi. Sia gli studi in vivo che quelli in vitro hanno mostrato la neurotossicità mediata dallo stress ossidativo dell'MPP ＋, un metabolita attivo di l-metil-4-fenil-l,2,3,6-tetraidropiridina (MPTP) sui neuroni dopaminergici. Il coinvolgimento dei radicali liberi eccessivamente prodotti dallo stress ossidativo come causa immediata di disturbi neurodegenerativi come la malattia di Parkinson suggerisce un ruolo chiave per gli antiossidanti. Il tubuloside B (Fig. l) era uno dei composti feniletanoidi isolati dagli steli della salsa Cistanche. Studi precedenti avevano scoperto che molti feniletanoidi, incluso il tubuloside B, mostravano una forte attività di eliminazione dei radicali liberi.

Considerando questi risultati, nel presente studio abbiamo studiato l'effetto del tubu]nside B sulla neurotossicità indotta da MPP+- in vitro, utilizzando la linea cellulare PC12 di feocromocitoma del nervo simpatico che è stata utilizzata con successo nel corso degli anni per studiare la funzione neuronale.

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Materiali e metodi

Materiali

Il Tubuloside B di Cistanche Salsa è stato gentilmente fornito dal Dr. Li Lei (Dipartimento di Prodotti Naturali, Scuola di Scienze Farmaceutiche, Università di Pechino, Pechino, Cina). La purezza del composto era superiore al 98% mediante analisi HPLC. Il terreno di Eagle modificato di Dulbecco (DMEM), il siero di cavallo e il siero di vitello fetale sono stati acquistati da GIBCO BRL, 1-ione metil~-fenilpiridionio (MPP+), poli-L-lisina, 3-(4,{ {8}}dimetil tiazolo-2 -il)-2,5- difeniltetrazolio bromuro (MTT), ioduro di propidio (PI), RNasi A, proteinasi K e 2; Il diacetato 7'-diclorofluoresceina (DCFH-DA) è stato acquistato da Sigma.

Coltura cellulare

Le cellule PCI2 sono state mantenute in DMEM integrato con siero di cavallo all'10%, siero di vitello fetale al 5%, penicillina 100U/ml e streptomicina 100ug/ml. Le cellule sono state coltivate in un incubatore umidificato aerato con il 95% di aria e il 5% di CO2 a 37 gradi. Tutti gli esperimenti sono stati condotti 24-48 ore dopo la semina delle cellule. Le cellule sono state regolarmente raccolte mediante trypsinizzazione allo 0,25% quando le cellule si avvicinavano allo stadio subconfluente e piastrate in fiasche di coltura da 25 cm divise a 1: 8.

Analisi della vitalità cellulare

La vitalità cellulare è stata determinata utilizzando un test MTT modificato come descritto in precedenza [10]. In breve, le cellule PC12 sono state seminate in piastre a pozzetti 96- con una densità di I × 104 cellule per pozzetto. Le colture sono state coltivate per 48 ore, quindi il terreno è stato cambiato con quello contenente varie concentrazioni di bruciato B o MPP＋. Dopo l'incubazione fino a 48 ore e 72 ore, la soluzione MTr (5 mg/ml in DMEM) è stata aggiunta alle piastre a pozzetti 96- e le cellule sono state lasciate incubare per 4 ore a 37 gradi. Dopo che il mezzo è stato rimosso, la cellula e i cristalli del colorante sono stati alimentati in modo solubile aggiungendo 200μL di DMSO e l'assorbimento è stato misurato a 570 nm (540 nm come riferimento) con un lettore di micropiastre modello 550 (Bio-Rad). La vitalità cellulare è stata analizzata anche utilizzando il metodo di esclusione del trypan blue. Le cellule sono state raccolte, pellettizzate delicatamente e colorate con una soluzione allo 0,6% di trypan blue per 3 piogge. La percentuale di cellule non colorate è stata successivamente valutata in dieci campi microscopici selezionati casualmente. Come farmaco positivo è stato utilizzato il fattore di crescita epidermico (EGF) da 100 ng／ml.

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Rilevazione dell'apoptosi mediante citometria a flusso

Le cellule apoptotiche sono state rilevate mediante citometria a flusso utilizzando ioduro di propidio (PI) [11]. In breve, circa 1 × 106 cellule incubate con le sostanze in esame sono state raccolte mediante centrifugazione e lavate una volta con PBS. Le cellule sono state fissate con etanolo al 70% per 24 ore a - 20 gradi e lavate una volta con PBS. Le cellule sono state quindi risospese in 300μL di PBS contenente 0,5 mg/ml di RNasiA e 0,5 mg/ml di PI. Dopo un'ulteriore incubazione per 30 minuti al buio, è stata eseguita la citometria a flusso con un FACScan (Becton Dickinson, Heidelberg, Germania).

Analisi della frammentazione del DNA mediante elettroforesi

Abbiamo applicato il protocollo di Moore [12] che isolava solo il DNA frammentato e gli esperimenti sono stati normalizzati utilizzando un numero uguale di colture da ciascun gruppo di test. In breve, 3 × 106 neuroni di ciascuno dei campioni trattati sono stati lavati nella soluzione salina bilanciata di Hank (1000g per 10 minuti) e i pellet formati sul fondo della provetta sono stati omogeneizzati con 1 ml di tampone di lisi (10 mM Tris a pH 7,4,5 mM EDTA, 1% Triton X-100) per 20 minuti su ghiaccio. Dopo la centrifugazione a 11,000 g per 20 giorni di pioggia a 4 gradi, i surnatanti contenenti DNA frammentato sono stati rimossi e digeriti con 20 mg/ml di RNasi A a 37 gradi per 1 ora e 0,1 mg/ml di proteinasi K a 56 gradi per un'ulteriore 1 ora. Il DNA frammentato è stato estratto utilizzando fenolo e cloroformio e centrifugato a 1O,000g per 1 pioggia a 4 C. La fase acquosa è stata trasferita in una nuova provetta Eppendorf, miscelata con 2 volumi di etanolo ghiacciato e poi posizionato a 20 gradi per almeno 1 ora per far precipitare il DNA. Dopo la centrifugazione a 15,000g per 20 minuti a 4 gradi, i surnatanti sono stati rimossi e i pellet di DNA sono stati lavati una volta con etanolo all'80% (15.000 g per 15 minuti a 4 gradi), asciugati all'aria e sciolti in 20μL Tampone TE a pH 7,6. L'intero campione è stato quindi elettroforizzato su un gel di agarosio all'1,5% per 1 ora a 85 V. Il gel è stato esaminato e fotografato da un Ultra Violet Products Gel Documentation System (GELDOC-2000, Bio-Rad, USA).

Misurazione della formazione di ROS intracellulari

La formazione di perossidi intracellulari è stata rilevata con un microscopio laser a scansione confocale utilizzando un composto non fluorescente, 2"7"-diclorofluoresceina diacetato (DCFH-DA) [13], che viene deesterificato all'interno delle cellule dalle esterasi endogene nella parte libera ionizzata acido, 2;7"-diclorofluoresceina. 2",7-La diclorofluoresceina può essere ossidata in 2"7"-diclorofluoresceina fluorescente (DCF) da idroantiossidanti. Le cellule sono state incubate con 10 μM di DCFH-DA per 30 minuti a 37 gradi. Le colture sono state lavate due volte con la soluzione salina bilanciata di Hank e esposte nello stesso mezzo. L'imaging è stato eseguito utilizzando un microscopio laser a scansione confocale, il DCF è stato eccitato a 488 nm e il filtro di emissione era un filtro barriera da 510 nm. Per fornire un confronto valido, sono stati utilizzati gli stessi parametri di acquisizione per tutte le osservazioni. È stata impostata la posizione verticale ottimale al centro delle celle, quindi il campo è stato rapidamente scansionato. Poiché l'illuminazione alla lunghezza d'onda di eccitazione di 488 nm causava un aumento della fluorescenza a causa dell'ossidazione di questo colorante, ciascun campo era esposto alla luce per lo stesso tempo. I valori basali delle cellule non stimolate sono stati utilizzati come valori di controllo da confrontare con le cellule trattate con MPP＋ in presenza o assenza ditubuloside B. Dopo la scansione, l'intensità relativa media della fluorescenza in 15-20 corpi cellulari neuronali per campo del microscopio è stata quantificata in quattro colture separate per condizione di trattamento.

analisi statistica

Tutti i valori ottenuti sono stati espressi come media ± DS. La significatività statistica delle differenze tra i gruppi è stata determinata dal test t di Student; I valori p calcolati inferiori a 0,05 sono stati considerati statisticamente significativi.

Risultati

Come mostrato in Fig. 2, MPP+ ha prodotto una diminuzione dose-dipendente della vitalità delle cellule PCI2. Al contrario, l'EGF, un noto fattore neurotrofico, ha prodotto una protezione significativa della vitalità cellulare a 100 ng/mL. Gli effetti citotossici indotti da MPP＋ sono stati attenuati anche in presenza di tubuloside B (5, 10, 50 o 100 ug-ml{{12} }), anche se con meno potenza rispetto al riferimento

farmaco (Fig．3)． Il tubuloside B a queste concentrazioni ha mostrato effetti citoprotettivi in ​​modo dose-dipendente e il composto da solo non ha causato alcuna apparente citotossicità (dati non mostrati)． L'elettroforesi su gel dell'estratto di DNA dalle cellule PCI 2 trattate con 200 µM MPP+ per 48 ore ha mostrato il laddering del DNA． un classico segno distintivo dell'apoptosi, il tubuloside B, a dosi di 10 e 100μ g·ml-1indotta dalla formazione della scala del DNA (Fig．4) ． La Fig．5 mostra tipici istogrammi dell'analisi citometrica a flusso della morte cellulare per apoptosi indotta da MPP＋ in cellule PC12 in presenza o assenza di tubuloside B．La quantificazione del profilo del ciclo cellulare con PI ha rivelato il numero di cellule con caratteristiche subdiploidi (regione M1) indicativo di frammentazione apoptotica del DNA． Nelle cellule non trattate, la frazione subdiploide apoptotica era minima fino al 5．94% delle 10.000 cellule totali (Fig.5 A). Dopo 48 ore di esposizione a MPP＋, la percentuale di apoptosi è aumentata a 43．02;j;(Fig．5 B)． Quando aggiunto alla coltura cellulare, il tubuloside Bha inibito l'apoptosi indotta da MPP+-in modo dose-dipendente． Ad una concentrazione di 10 ug·ml-1la protezione da parte del tubuloside B non era statisticamente significativa, ma a 50 e 1 00ug·ml-1, una diminuzione del 45％e del 63％．rispettivamente, è stato osservato. aumentando la percentuale di cellule sopravvissute (Fig．5D, E)．

L'accumulo di ROS intracellulari può essere rilevato utilizzando cellule DCFH-DA．PC12 trattate con 200 uM MPP＋ per 48 ore che mostrano un'intensa fluorescenza all'interno della cellula dopo la colorazione con colorante DCFH-DA (Fig．6)． Il trattamento simultaneo con tubuloside B (a dosi di 10 e 100 ug·ml) ha inibito la produzione di ROS indotta da MPP (le percentuali ridotte erano rispettivamente del 24．52% e 55．63%)．

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Discussione

La patogenesi della malattia di Parkinson comporta un forte stress ossidativo, ridotti livelli di antiossidanti e difetti mitocondriali. tutti noti per indurre l'apoptosi in diversi sistemi cellulari． In particolare, è stato dimostrato che i radicali liberi innescano la morte cellulare attiva nei neuroni[14]． L'MPTP produce una sindrome simil-parkinsoniana irreversibile e grave che causa la degenerazione selettiva dei neuroni dopaminergici nigrostriatali nell'uomo. Questa neurotossina è stata utilizzata per creare． modelli animali mangiati di PD[15]．MPTP viene convertito dalla monoaminossidasi B in Mpp＋, che viene accumulato nei mitocondri． dove inibisce il complesso mitocondriale I e la disfunzione mitocondriale. la funzione provoca l'apoptosi[16]． Pertanto, la neurotossicità indotta da MPP+一nei neuroni dopaminergici è stata ampiamente utilizzata come modello eziologico della PD per lo screening degli agenti neuroprotettivi.

Nel presente studio, abbiamo dimostrato che la morte cellulare indotta da MPP+-via stress ossidativo nelle cellule PC12 è stata ridotta dal tubuloside B. Inoltre, abbiamo dimostrato che il tubuloside B proteggeva anche in modo dose-dipendente contro l'MPP{{ 3}}laddering e apoptosi del DNA indotti, misurati mediante elettroforesi su gel di DNA e analisi citofluorimetrica. Inoltre, il trattamento simultaneo con concentrazioni più elevate di tubuloside B ha inibito la produzione di ROS indotta da MPP. Pertanto, il tubuloside B ha mostrato effetti neuroprotettivi multifunzionali. Diversi meccanismi, separatamente o in associazione, possono essere coinvolti nelle azioni del tubuloside B. L’effetto antiossidante è un possibile meccanismo per la neuroprotezione mediata dal tubuloside B. Xiong Q ha scoperto che il tubuloside B mostrava una forte attività di eliminazione dei radicali liberi sul radicale 1,1-difenil-2-picrilidrazil e sulla xantina]xantina ossidasi generato dal radicale anionico superossido.

È stato recentemente segnalato che diversi feniletanoidi possiedono proprietà di eliminazione dei radicali liberi e proteggono le lesioni tossiche indotte dallo stress ossidativo. I ROS prodotti da MPP+ come il perossido di idrogeno, l'anione superossido e il radicale idrossile danneggiano facilmente le molecole biologiche, che alla fine possono portare alla morte cellulare apoptotica o necrotica. Pertanto, il tubuloside B può avere effetti di eliminazione diretta dei ROS. Sebbene i nostri dati non stabiliscano il sito esatto in cui il tubuloside B agisce per sopprimere l’accumulo di ROS, suggeriscono che il meccanismo neuroprotettivo comporta la stimolazione delle vie antiossidanti. Uno studio della struttura molecolare del tubuloside B indica anche che possiede una potente capacità dieliminazione dei radicali liberi(comunicazione personale).

Potrebbero essere pertinenti anche altri meccanismi. Ad esempio, il tubuloside B può avere la capacità di contrastare la tossicità dell’MPP＋ inibendo l’apertura dei pori di transizione della permeabilità mitocondriale e la disfunzione. Inoltre, si dovrebbe considerare se il tubuloside B abbia un effetto diretto di promozione della crescita sulle cellule neuronali. L’esatto meccanismo dell’azione neuroprotettiva del tubuloside B rimane poco chiaro. Sono necessari ulteriori studi per chiarire il quadro completo del suo effetto neuroprotettivo.

In conclusione, tubuloside B daEstratto di salsa Cistancheha evidenti effetti protettivi sull'apoptosi e sullo stress ossidativo indotti da MPP+-. I suoi effetti neuroprotettivi contro la tossicità dell’MPP ＋ potrebbero essere importanti e suggerire che possa avere un potenziale terapeutico nella prevenzione e nel trattamento della malattia di Parkinson.

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