Le cellule tumorali non riescono a presentare epitopi ristretti per MHC-II derivati ​​da oncogeni alle cellule T CD4+

Le cellule T CD4+ svolgono un ruolo fondamentale nell'immunità antitumorale attraverso il riconoscimento degli antigeni peptidici presentati sull'MHC di classe II (MHC-II). Sebbene alcuni tumori solidi possano essere indotti a esprimere MHC-II, non è chiara la misura in cui ciò consente il riconoscimento diretto da parte delle cellule T CD4+ specifiche del tumore. Abbiamo isolato e caratterizzato i recettori dell'antigene delle cellule T (TCR) da cellule T CD4+ innescate naturalmente specifiche per 2 oncoproteine, HPV-16 E6 e la mutazione attivante KRASG12V, da pazienti con carcinoma a cellule squamose della testa e del collo e adenocarcinoma duttale pancreatico, rispettivamente, e hanno determinato la loro capacità di riconoscere le cellule tumorali che esprimono l'antigene autologhe o umane. Abbiamo scoperto in entrambi i casi che i TCR erano in grado di riconoscere le cellule bersaglio caricate con peptidi che esprimevano le cellule presentanti l'antigene (APC) rilevanti MHC-II o cellule B quando gli antigeni erano espressi endogenamente e diretti verso la via endosomiale ma non riuscivano a riconoscere il tumore cellule che esprimono la proteina sorgente anche dopo l'induzione dell'espressione MHC-II di superficie da parte dell'IFN- o trasduzione con CIITA. Questi risultati suggeriscono che il priming e il riconoscimento funzionale sia di un'oncoproteina nucleare (E6) che di un'oncoproteina associata alla membrana (KRAS) sono prevalentemente limitati alle APC con presentazione incrociata piuttosto che tramite il riconoscimento diretto delle cellule tumorali indotte ad esprimere MHC-II.

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introduzione

La trasformazione maligna delle cellule somatiche viene avviata dall'azione di oncogeni attivati ​​che disregolano i percorsi di crescita cellulare e portano a una proliferazione incontrollata (1). Nel caso dei tumori associati all'HPV, l'espressione dei geni precoci dell'HPV E6 ed E7 contribuisce all'oncogenesi inibendo rispettivamente i geni oncosoppressori p53 e Rb (2). In alternativa, l'attivazione costitutiva dell'oncogene può verificarsi attraverso una mutazione somatica nei geni che regolano la crescita cellulare e le vie di proliferazione, come la famiglia RAS. Infatti, le mutazioni attivanti di KRAS come KRASG12V si trovano comunemente nei pazienti con cancro del pancreas, del colon e del polmone (3). Sebbene gli oncogeni promuovano la malattia, possono anche fornire bersagli per il sistema immunitario ospite. Negli ultimi anni, il ruolo del sistema immunitario nel controllo dei tumori associati all’HPV è stato ampiamente riconosciuto. Le cellule T CD8+ e CD4+ che riconoscono l'HPV E6 ed E7, così come altre proteine ​​dell'HPV, sono state identificate sia nel sangue periferico che nei linfociti infiltranti il ​​tumore (TIL) di pazienti con infezione associata all'HPV. tumori (4–6). Le immunoterapie mirate a questi antigeni, compresi i vaccini terapeutici contro il cancro e la terapia cellulare adottiva (ACT) con TIL o cellule T ingegnerizzate con TCR, sono un'area attiva di ricerca preclinica e clinica (2). Anche le risposte delle cellule T contro le mutazioni oncogene sono state ampiamente descritte (7–9). Inoltre, esiste prova clinica diretta che l'ACT con TIL che prendono di mira il KRAS mutante può promuovere risposte obiettive (10). Sebbene le cellule T CD8+ che riconoscono epitopi derivati ​​da oncogeni mediano la citotossicità diretta contro le cellule tumorali (11–13), il ruolo delle cellule T CD4+ nell'immunità antitumorale è meno ben compreso. Studi recenti hanno evidenziato un sottoinsieme di cellule T CD4+ che esprimono marcatori citotossici, come il granzima B (GrzmB), nei tumori umani (14, 15). Le specificità antigeniche di queste cellule, tuttavia, e quindi il loro potenziale terapeutico, rimangono in gran parte sconosciute. Inoltre, affinché queste cellule T citotossiche CD4+ riconoscano e uccidano le cellule tumorali, non solo la cellula tumorale deve esprimere MHC-II, ma anche gli antigeni rilevanti devono essere diretti verso la via di presentazione appropriata. In questo studio, abbiamo studiato la capacità delle cellule T CD4+ specifiche per le oncoproteine ​​HPV-16 E6 e KRASG12V di riconoscere le cellule tumorali che esprimono l'antigene. Sebbene entrambi i TCR fossero in grado di riconoscere direttamente gli antigeni elaborati e presentati per via endogena diretti al compartimento endosomiale delle cellule B HLA-compatibili, nessuno dei due era in grado di riconoscere le cellule tumorali che esprimono l'antigene con espressione indotta di MHC-II. Nel complesso, i nostri risultati suggeriscono che solo alcuni antigeni sono presentati direttamente sulle cellule tumorali MHC-II+, il che può limitare il pool di cellule T CD4+ in grado di riconoscere ed eliminare direttamente le cellule tumorali.

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Risultati

Identificazione delle risposte delle cellule T CD-16 E6-specifiche dell'HPV4+ e CD8+ dai TIL del carcinoma a cellule squamose della testa e del collo. Abbiamo sottoposto a screening una serie di colture TIL individuali isolate da frammenti tumorali da 2 a 4 mm da un paziente (Hu-56) con carcinoma a cellule squamose della testa e del collo HPV-16+ (HNSCC) (Tabella supplementare 1; materiale supplementare disponibile online con questo articolo; https://doi.org/10.1172/jci.insight.165570DS1) mediante test IFN-ELISPOT per identificare le risposte delle cellule T dirette contro le oncoproteine ​​virali E6 ed E7 dell'HPV-16, utilizzando pool di peptidi comprendenti 15-meri sovrapposti che coprono la lunghezza delle proteine ​​E6 ed E7. In particolare, i frammenti TIL 12 e 29 hanno generato un numero sostanziale di punti sullo sfondo quando restimolati con il pool di peptidi E6 e contenevano cellule T CD4+ e CD8+ (Figura 1A e Figura 1A supplementare). Per identificare i sottoinsiemi di cellule T rilevanti, abbiamo analizzato queste colture TIL utilizzando un test di secrezione di citochine. Ciò ha rivelato che il frammento TIL 29 (F29) conteneva cellule T E6-reattive CD8+, mentre il frammento 12 (F12) conteneva sia cellule T CD4+ che CD8+ capaci di riconoscendo il pool di peptidi E6 (Figura 1B). Nessuna delle cellule T CD4+ ha prodotto IL-5 in risposta alla restimolazione E6, convalidando un fenotipo simile a Th1-. Per determinare la clonalità TCR dei TIL specifici per E6-, abbiamo ordinato singole cellule T CD4+ secernenti IFN da F12 e cellule T CD8+ da F12 e F29. Il sequenziamento del TCR ha rivelato un singolo TCR espresso dalle cellule T CD4+ secernenti IFN- (n=31 di 31 cellule sequenziate), nonché un singolo clone di TCR condiviso dalle cellule T CD{{53) secernenti IFN- }} Cellule T di F12 e F29 (n=40 di 41 e 37 di 38 cellule sequenziate, rispettivamente) (Tabella supplementare 2). Questi risultati indicano che cellule T monoclonali CD4+ e CD8+ reattive a E6 sono presenti nei TIL di questo paziente. Le cellule T CD8+ ristrette per HLA-A*02:01 provenienti da TIL riconoscono E6 presentato da una linea cellulare tumorale derivata dal paziente. I TIL di F29 hanno prodotto IFN- quando restimolati con il peptide E629-38, suggerendo che il TCR F29 ha riconosciuto questo epitopo ristretto HLA-A*02:01 precedentemente descritto (Figura 1B supplementare) (11). Ciò è stato confermato da studi di legame del tetramero utilizzando E629-38/HLA-A*02:01 per etichettare cellule J76 carenti di TCR che esprimono CD8 umano e utilizzando un TCR specifico per E628-38 precedentemente descritto come positivo controllo (Figura 2A) (11). Entrambi i TCR hanno mostrato livelli simili di avidità funzionale, come dimostrato dalla sovraregolazione del marcatore di attivazione acuta CD69 su J76 dopo stimolazione con linee cellulari linfoblastoidi B autologhe (B-LCL) pulsate con concentrazioni titolate di peptide E629-38 (Figura 2, B e C). Questi dati convalidano la presenza di un clone di cellule T CD8+ specifico per un epitopo noto di E6 con caratteristiche funzionali simili a un TCR che è stato testato in ambito clinico (16). Successivamente abbiamo cercato di determinare se il TCR E6-specifico CD8+ potesse riconoscere antigeni espressi a livello endogeno e quindi mediare la citotossicità antitumorale. Per fare ciò, abbiamo utilizzato una linea tumorale HLA-A*02:01+ HPV-16+ ben caratterizzata, CaSki, nonché una linea cellulare tumorale autologa, HNSCC-56, generata tramite riprogrammazione cellulare del tessuto tumorale primario come precedentemente descritto (17) per test di citotossicità in vitro. L'analisi RNA-Seq ha convalidato l'espressione dei geni precoci dell'HPV-16, incluso E6, sia nel campione di tumore primario che nella linea cellulare autologa (Figura 1C supplementare). Le cellule T umane primarie CD8+ che esprimono il TCR F29 potrebbero mediare l'uccisione cellulare sia di CaSki che di HNSCC-56 in una gamma di rapporti effettore-bersaglio in vitro (Figura 2, D ed E). Insieme, questi dati confermano che il TCR F29 riconosce l'antigene E6 espresso a livello endogeno. Identificazione di una cellula T CD4+ specifica per E6-ristretta per HLA-DQ dai TIL. Per espandere i TIL specifici di E6- per ulteriori analisi funzionali, abbiamo utilizzato il protocollo di coltura a espansione rapida descritto in precedenza con OKT-3 e abbiamo irradiato PBMC allogenici per espandere i TIL da F12. Sebbene la coltura primaria F12 contenesse originariamente sia cellule T CD8+ che CD4+ con reattività E6, il prodotto cellulare finale dopo una rapida espansione conteneva il 99% di cellule T CD4+, di cui circa 38,33 La percentuale ha dimostrato reattività contro E6, come dimostrato dalla colorazione delle citochine intracellulari per IFN- (Figura 3A).

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Oltre all'IFN-, i TIL stimolati per E6-CD4+ specifici potrebbero secernere TNF- ma non IL-2 (Figura 2A supplementare). Sebbene la frequenza totale delle cellule GrzmB+ non aumentasse con la stimolazione dell'antigene, il gating sulle cellule secernenti TNF ha rivelato che i TIL CD specifici per E4+ contenevano più GrzmB intracellulari immagazzinati rispetto ai TIL non specifici (Figura 2B supplementare ). I TIL CD4+ secernenti IFN esprimevano anche il marcatore coinibitorio di morte cellulare programmata 1 (PD-1), in linea con le firme pubblicate dei TIL CD4+ reattivi al tumore (Figura 2C supplementare) ( 18, 19). I TIL E6-CD specifici4+ hanno dimostrato un'elevata avidità funzionale perché queste cellule potevano secernere citochine a concentrazioni di peptidi inferiori a 1 ug/mL (Figura 3B). Per determinare la specificità della coltura TIL F12, abbiamo pulsato B-LCL autologhe con singoli peptidi corrispondenti a ciascuno dei 37 peptidi contenuti nel pool E6 originale (Tabella supplementare 3). I TIL CD4+ dell'IFN- secreto da F12 quando stimolati con i peptidi E61-15 ed E65-19, che condividono una sequenza centrale di 11 aminoacidi (Figura 2D supplementare). Esperimenti di cocoltura in presenza di anticorpi HLA-bloccanti hanno rivelato una secrezione di IFN significativamente ridotta da parte dei TIL quando i B-LCL erano bloccati con anticorpi anti-HLA-DQ ma non anticorpi anti-HLA-DR o controllo isotipico (Figura 3C). Per determinare quali alleli HLA-DQ sono responsabili della presentazione di questo epitopo, abbiamo pulsato le B-LCL che esprimono alleli HLA-DQ noti (Tabella supplementare 4) con E61-15 e abbiamo scoperto che le cellule KAS011 che esprimono HLA-DQA1*01 :02 e DQB1*05:02, ma non le B-LCL Hu-195 che esprimono DQA1*05:05 e DQB1*03:01, potrebbero presentare l'antigene ai TIL in modo paragonabile all'Hu autologo{{63} } B-LCL (Figura 3D). Infine, abbiamo cercato di verificare che la sequenza TCR identificata in precedenza fosse effettivamente responsabile del riconoscimento di E6. L'espressione del TCR F12 nelle cellule T CD4+ di donatori umani primari sani era sufficiente a promuovere il riconoscimento del peptide E61-15, come evidenziato dalla sovraregolazione di CD69 e PD-1 (Figura 3E ). Presi insieme, questi risultati dimostrano l'identificazione di un epitopo di E6 ristretto per HLA-DQ riconosciuto dai TIL monoclonali CD4+. Le cellule T CD6-specifiche E4+ non riconoscono né uccidono le cellule tumorali autologhe che esprimono MHC-II. Studi recenti hanno identificato firme genetiche di TIL CD4+ citotossici in alcuni tumori umani (14, 15). Tuttavia, non è noto se le cellule T citotossiche CD4+ svolgano un ruolo nei tumori provocati dall'HPV. Per determinare se le cellule T CD4+ specifiche per E6- dei TIL potessero riconoscere direttamente l'HNSCC-56, abbiamo prima studiato il suo stato di espressione MHC-II. Sebbene le cellule tumorali non esprimessero MHC-II di superficie rilevabile in coltura, il trattamento con IFN- per 72 ore è stato sufficiente per indurre la sovraregolazione di MHC-II (Figura 4A). Successivamente, abbiamo coltivato HNSCC-56 con TIL CD4+ F12. È importante sottolineare che le cellule tumorali MHC-II+ precondizionate con IFN- non sono state in grado di stimolare i TIL CD4+ misurati mediante la secrezione di IFN- (Figura 4B).

Figura 1. Identificazione dei TIL E6-CD{2}} e CD{3}} reattivi da HPV-16+ HNSCC. (UN)

Figura 2. Caratteristiche funzionali di un TCR specifico per E6-ristretto per HLA-A*02:01 da TIL Hu-56. (UN)

Tuttavia, le linee cellulari tumorali trattate con IFN pulsate con E61-15 prima dell'aggiunta di TIL sono state in grado di stimolare una risposta delle cellule T, indicando che l'espressione superficiale degli alleli HLA-DQ restrittivi in ​​una linea cellulare che esprime endogenamente E6 non era sufficiente per il riconoscimento del tumore ma richiedeva il caricamento esogeno del peptide bersaglio. Lo stesso requisito di caricamento del peptide bersaglio esogeno è stato osservato con le cellule tumorali trasdotte da CIITA (HNSCC-56 CIITA), che esprimono costitutivamente alti livelli di MHC-II di superficie (Figura 4B). Per verificare se i TIL CD4+ potessero riconoscere una versione endogena elaborata e presentata dell'epitopo E6 su un APC, abbiamo trasdotto retroviralmente B-LCL autologhi con un costrutto di espressione che codifica i primi 50 aminoacidi di E6 fusi all'MHC- I dominio transmembrana (E6-MITD), che induce la localizzazione della sequenza di aminoacidi fusi sulla membrana plasmatica e supporta la presentazione su MHC-II tramite il traffico endosomiale (20). Le B-LCL che esprimono il costrutto E6-MITD potrebbero stimolare i TIL CD4+ specifici per E6-, indicando che l'epitopo peptidico riconosciuto da questi TIL può essere naturalmente elaborato e presentato su MHC-II quando diretto al percorso appropriato (Figura 4C).

Figura 3. Caratteristiche funzionali dei TIL CD4+ E6-specifici espansi clonalmente, limitati per HLA-DQ. (UN)

Successivamente, abbiamo cercato di determinare se i TIL F12 E6-specifici per CD4+ fossero capaci di citotossicità diretta sul tumore. Coerentemente con i dati dei nostri test di riconoscimento, i TIL CD4+ specifici per E6- non sono stati in grado di limitare la crescita delle cellule tumorali HNSCC-56, che non esprimono MHC-II (Figura 4D) . Inoltre, anche le cellule tumorali HNSCC-56 CIITA crescevano senza inibizioni in presenza di TIL CD4+. Tuttavia, la crescita delle cellule tumorali HNSCC-56 CIITA pulsate con il peptide E61-15 è stata inibita in modo dose-dipendente delle cellule effettrici. Nel complesso, questi dati suggeriscono che sebbene HNSCC-56 possa presentare epitopi E6 alle cellule T CD8+, i TIL E6-CD4+ specifici non sono in grado di riconoscere e lisare direttamente MHC- Cellule tumorali autologhe II+. I geni coinvolti nella presentazione dell'antigene sono spesso mutati nei tumori, il che può impedire il riconoscimento da parte delle cellule T (21). Per determinare se le cellule tumorali HNSCC-56 contenessero mutazioni somatiche che precludevano la presentazione dell'antigene su MHC-II, abbiamo eseguito il sequenziamento dell'intero esoma di cellule tumorali e PBMC da Hu-56 come campione di riferimento. Delle 104 mutazioni somatiche non sinonime identificate, non c'erano mutazioni apparenti nei componenti del percorso di presentazione MHC-II, inclusi HLADMA, HLADMB e CD74 (Tabella supplementare 5). Identificazione di un TCR HLA-DRB5*01:01-specifico per KRASG12V dal sangue di un paziente con adenocarcinoma duttale pancreatico. A seguito di questi risultati, abbiamo deciso di determinare se l'incapacità delle cellule tumorali di presentare l'antigene sull'MHC-II fosse vera per altri oncogeni. Dato che le cellule T circolanti tumore-specifiche sono state identificate in pazienti umani affetti da cancro (8, 22), abbiamo stimolato le PBMC di un paziente (Hu-66) con adenocarcinoma duttale pancreatico (Tabella supplementare 1) con un pool di peptidi corrispondenti a mutazioni oncogene comuni (Tabella supplementare 6) per 14 giorni prima della restimolazione con singoli peptidi per identificare le risposte delle cellule T rilevanti mediante ELISPOT. Questi risultati hanno indicato la presenza di una risposta delle cellule T diretta contro KRASG12V, come evidenziato da un numero maggiore di spot IFN sullo sfondo in risposta agli aminoacidi 1-15 di KRASG12V (Figura 5A). Per identificare i TCR rilevanti associati a questa risposta, abbiamo nuovamente utilizzato il test di secrezione di citochine per selezionare le cellule secernenti IFN. Il test di secrezione di citochine ha rivelato una produzione specifica di IFN- da parte delle cellule T CD4+ in risposta alla restimolazione con KRASG12V (Figura 5B). Il confronto delle catene TCR delle cellule secernenti IFN selezionate con quelle presenti nelle PBMC non espanse di questo paziente ha rivelato un singolo clonotipo TCR presente con la frequenza più alta in entrambe le popolazioni (Figura 5C e Tabella supplementare 2). Questi risultati indicano che la frequenza di questo clone di cellule T è stata ampliata al basale nelle PBMC, suggerendo una risposta naturale in vivo piuttosto che un priming in vitro nella nostra coltura di espansione. Per verificare la specificità dell'antigene di questo TCR, lo abbiamo espresso in cellule T CD4+ primarie umane mediante trasduzione retrovirale e abbiamo coltivato queste cellule con B-LCL autologhe pulsate con il mutante KRASG12V o il corrispondente peptide WT. Le cellule T ingegnerizzate secrete IFN- quando stimolate con il peptide KRAS mutante, ma non WT, verificando che questo TCR è specifico per KRASG12V (Figura 5D). Coerentemente con i nostri risultati dal TCR E6, le cellule T ingegnerizzate che esprimono il TCR specifico per KRASG12V sono state anche in grado di riconoscere le B-LCL che esprimono un frammento di KRASG12V, ma non WT KRAS, diretto all'endosoma mediante inclusione di un MITD, suggerendo che questo Il TCR riconosce l'antigene elaborato e presentato endogeno (Figura 5D).

Figura 4. Le cellule tumorali autologhe non presentano cellule T endogene da E61-15 a MHC-II a CD4+. (UN)

Figura 5. Identificazione di un TCR HLA-DRB5*01:01 specifico per KRASG12V dal sangue di un paziente con adenocarcinoma duttale pancreatico. (UN)

Per identificare l'allele HLA restrittivo, abbiamo ripetuto questi esperimenti di stimolazione del peptide utilizzando B-LCL che esprimono diverse combinazioni di geni HLA. Le B-LCL che esprimono l'aplotipo comune HLA-B7-DR15-DQ6 potrebbero stimolare le cellule T ingegnerizzate, mentre le B-LCL senza questi alleli non potrebbero (Figura 5E). In definitiva, la stimolazione di queste cellule mediante IHW03304 pulsato con peptidi, una linea cellulare DAP3 di topo trasfettata con HLA-DRB5*01:01 umano, ha verificato che questa è la molecola HLA restrittiva (Figura 5F). Le cellule tumorali MHC-II+ NCI-H2444 e DAN-G non presentano l'epitopo derivato da KRASG12V nelle cellule T CD4+. Successivamente, abbiamo studiato la capacità delle cellule tumorali di presentare direttamente epitopi derivati ​​da KRASG12V su MHC-II. Per generare linee cellulari MHC-II+ abbinate a HLA per questi studi, abbiamo trasdotto le linee cellulari KRASG12V+ NCI-H2444 e DAN-G, derivate da tumori umani del polmone e del pancreas, rispettivamente, con CIITA e un costrutto che codifica HLA-DRB5*01: 01 con un gene reporter CD34 troncato (Figura 6A). Coerentemente con i nostri risultati precedenti, le cellule tumorali MHC-II+ che esprimono l'allele HLA restrittivo non erano in grado di stimolare le cellule T ingegnerizzate con TCR a meno che le cellule bersaglio non fossero prima pulsate con peptide esogeno (Figura 6B). È importante sottolineare che non sono state elencate mutazioni somatiche nei geni di presentazione MHC-II (vale a dire HLADMA, HLADMB, CD74) né per NCI-H2444 né per DAN-G nei dati di sequenziamento disponibili al pubblico (23). Le cellule CIITA NCI-H2444 sono cresciute senza inibizioni in presenza di cellule T ingegnerizzate con TCR, mentre le cellule CIITA NCI-H2444 pulsate con il peptide KRASG12V hanno sperimentato una crescita tumorale ritardata (Figura 6C). Coerentemente con i risultati ottenuti per HNSCC-56, le cellule T CD8+ che esprimono un TCR HLA-A*03:01-ristretto, KRASG12V-specifico (24) sono state in grado di riconoscere le cellule NCI-H2444 ma non Cellule CaSki, che esprimono HLA-A*03:01 ma non KRASG12V (Figura 6D). Questi risultati dimostrano che anche un oncogene distinto presente nel citosol non può essere presentato dalle cellule tumorali MHC-II+ nonostante sia effettivamente presentato su MHC-I. L'espressione di ligandi coinibitori come il ligando di morte cellulare programmata 1 (PD-L1) da parte delle cellule tumorali limita la segnalazione del TCR nelle cellule T (25). Per determinare se questo meccanismo potrebbe impedire il riconoscimento delle cellule tumorali MHC-II+ da parte delle cellule T CD4+, abbiamo coltivato cellule T CD4+ che esprimevano il nostro TCR specifico per KRASG12V o quello specifico per E6- F12 TCR con NCI-H2444 CIITA e HNSCC-56 CIITA, rispettivamente, con o senza anticorpi anti-PD-L1 bloccanti. Il blocco delle interazioni PD-L1/PD-1 non è stato sufficiente per promuovere il riconoscimento delle cellule tumorali (Figura 3 supplementare). Allo stesso modo, l’aggiunta dell’agonista anti-CD28 Ab non ha modulato il riconoscimento delle cellule tumorali. Questi risultati suggeriscono che responsabile di questo fenotipo è la mancanza di presentazione dell'antigene, piuttosto che la presenza o l'assenza rispettivamente di segnali coinibitori o costimolatori. Alcuni studi suggeriscono che le proteine ​​endogene internalizzate dalla membrana plasmatica vengono caricate preferenzialmente sul MHC-II per la presentazione, rispetto ad altri compartimenti subcellulari (26). Sebbene le proteine ​​KRAS siano spesso associate alle membrane tramite modificazioni lipidiche, non esprimono un dominio transmembrana e queste interazioni non sono stabili (3, 27). Abbiamo quindi pensato che l'ancoraggio del frammento immunogenico di KRASG12V alla membrana plasmatica delle cellule tumorali potesse consentire il riconoscimento diretto dell'antigene da parte delle cellule T CD4+. Tuttavia, le cellule tumorali che esprimono il costrutto KRASG12V-MITD, come evidenziato dall'espressione di un reporter EGFP legato a P2A, non erano similmente in grado di stimolare le cellule T CD4+ ingegnerizzate con TCR (Figura 4 supplementare). Questi risultati suggeriscono che la localizzazione dell'oncogene subcellulare non è l'unico determinante della presentazione diretta dell'MHC-II da parte delle cellule tumorali. Inoltre, questi risultati suggeriscono che la sovraespressione dell'antigene non è sufficiente per promuovere la presentazione di MHC-II. I nostri risultati finora suggeriscono che le cellule T CD4+ tumore-specifiche potrebbero avere maggiori probabilità di riconoscere gli antigeni presentati dalle APC rispetto alle cellule tumorali stesse. Pertanto, abbiamo valutato la capacità delle DC HLADRB5*01:01+ di presentare antigeni derivati ​​da proteine ​​esogene. Le DC HLA-compatibili generate in vitro erano in grado di stimolare le cellule T CD4+ ingegnerizzate con TCR che esprimevano il TCR specifico per KRASG12V quando le DC immature venivano pulsate con il peptide KRASG12V 20-mer o alimentate con proteina intera KRASG12V ma non la proteina KRAS WT (Figura 6E). Questi risultati suggeriscono che sebbene il TCR non possa riconoscere gli antigeni endogeni presentati dalle cellule tumorali, può riconoscere gli antigeni esogeni presentati in modo incrociato nel contesto delle DC.

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Discussione

L'obiettivo di questo studio era determinare se i TCR isolati da cellule T naturali ottenute da pazienti affetti da cancro potessero riconoscere le cellule tumorali che esprimono oncogeni. Per quanto riguarda il TCR HPV-16 E629-38 ristretto alla classe I (HLA-A*02:01) ottenuto da TIL HNSCC, il riconoscimento è stato, forse non sorprendentemente, affermato sia per una linea cellulare tumorale autologa e una cellula tumorale ben caratterizzata che esprime HLA ed E6-, CaSki (soprattutto, vedere la Figura 2). Gli stessi TIL (Figura 1) contenevano anche un numero significativo di cellule T CD4+ E6-specifiche che producono IFN (Figura 3), che, al contrario, non riconoscevano E6- esprimendo cellule tumorali, anche quando sono state indotte a esprimere un'ampia superficie MHC di classe II dell'allele di presentazione corretto (DQA1*01:02/DQB1*05:02) mediante trattamento IFN o trasduzione CIITA (Figura 4). L'espressione CIITA induce non solo l'espressione superficiale delle proteine ​​MHC-II ma anche HLA-DM e molecole a catena invariante, necessarie per l'elaborazione e la presentazione dell'antigene (28). Le cellule B HLA-compatibili, al contrario, venivano riconosciute da questo TCR quando l'antigene era diretto verso la via MHC-II. Una situazione simile è stata osservata nel caso di un TCR specifico per KRASG12V, ristretto per HLA-DRB5*01:01, che poteva riconoscere le cellule B HLA-compatibili, ma non le cellule tumorali che esprimevano MHC-II, quando l'antigene era diretto al Percorso di presentazione MHC-II. Entrambi i TCR possedevano un'avidità funzionale sufficiente per mediare il riconoscimento di antigeni espressi a livello endogeno nelle condizioni sopra descritte, ed entrambi potevano mediare la citotossicità delle cellule bersaglio caricate con peptidi. Quest'ultima osservazione rispecchia la circostanza presentata in diversi rapporti sulle cellule T citotossiche CD4+, sebbene i nostri dati estendano il contesto di questa osservazione mostrando che l'espressione endogena dell'antigene sorgente e l'induzione di MHC-II da parte dell'IFN- sono improbabili per produrre un bersaglio fisiologico sulle cellule tumorali di derivazione epiteliale per i TCR contro antigeni nucleari o associati alla membrana. Studi recenti sul cancro della vescica umana e sul melanoma hanno identificato firme genetiche corrispondenti alle cellule T citotossiche CD4+ tra i TIL (14, 15). Funzionalmente, questi TIL citotossici CD4+ sono in grado di riconoscere direttamente il tumore dipendente da MHC-II, portando infine alla lisi bersaglio da parte dei granzimi in modo simile alle loro controparti CD8+. Tuttavia, la traduzione terapeutica di questi risultati può essere limitata dal fatto che pochi tumori solidi esprimono MHC-II. Infatti, i risultati di 2 studi indipendenti hanno suggerito che solo circa un terzo dei pazienti con melanoma presenta cellule tumorali MHC-II+ e la frequenza di queste cellule all'interno del tumore è spesso inferiore al 10% (15, 29). Invece, la fonte cellulare predominante di MHC-II nel microambiente tumorale sembra essere l'infiltrazione dei leucociti (26).

Figura 6. Le cellule tumorali MHC-II+ KRASG12V+ non presentano epitopi derivati ​​da KRASG12V nelle cellule T CD4+. (UN)

Sebbene alcune cellule tumorali solide esprimano MHC-II costitutivo o inducibile, i nostri risultati indicano che, nonostante la presenza di cellule T CD4+ oncogene-specifiche tra TIL e PBMC, queste cellule non possono riconoscere e lisare direttamente l'antigene cellule tumorali MHC-II+, mentre gli epitopi della stessa proteina possono essere efficacemente presentati alle cellule T CD8+ su MHC-I (13). Ciò suggerisce che la semplice espressione di un antigene bersaglio potrebbe non essere sufficiente per conferire il riconoscimento da parte delle cellule T CD4+ per il sottogruppo di tumori che esprimono MHC-II. Inoltre, questi risultati sembrano essere coerenti tra più tipi di tumore, poiché le linee cellulari analizzate in questo studio includono quelle derivate da HNSCC, adenocarcinoma polmonare e cancro del pancreas. Il riconoscimento diretto delle cellule T CD4+ delle linee cellulari di melanoma che esprimono MHC-II naturalmente o dopo trasduzione CIITA è stato riportato in 2 studi (30, 31). Tuttavia, in entrambi questi studi, una frazione significativa dei TCR testati non ha riconosciuto direttamente le cellule tumorali. Non è chiaro se questi TCR rappresentino clonotipi "astanti" che non riconoscono gli antigeni tumorali o TCR tumore-specifici che non sono in grado di riconoscere il loro antigene affine a causa di carenze nella presentazione dell'antigene come quelle evidenziate in questo studio. Oliveira et al. (31) hanno dimostrato che il riconoscimento diretto da parte delle cellule T CD4+ era limitato a 2 melanomi con carichi mutazionali tumorali estremamente elevati, suggerendo che questo fenotipo può conferire ulteriori alterazioni necessarie consentendo la presentazione MHC-II degli antigeni tumorali. Sebbene l'attacco di un MITD al frammento immunogenico di KRASG12V non abbia comportato il riconoscimento diretto delle cellule tumorali da parte delle cellule T CD4+, gli studi hanno descritto una distorsione per i peptidi endogeni derivati ​​dalle proteine ​​legate alla membrana eluite da MHC-II, presumibilmente a causa del riciclo della membrana (26, 32). L'antigene del melanoma Trp1 esiste nella membrana plasmatica, che può facilitare la presentazione diretta alle cellule T CD4+ da parte delle cellule tumorali B16 (33). Un altro antigene associato al melanoma, gp100, viene presentato dalle cellule tumorali alle cellule T CD4+ in modo dipendente dal dominio transmembrana di gp100 (34). In un recente lavoro che studiava il ruolo delle cellule T CD4+ specifiche del neoantigene in un modello di sarcoma murino, gli epitopi derivati ​​da una subunità integrina mutata, anch'essa una proteina legata alla membrana, sono stati eluiti da MHC-II su tumore trasdotto con CIITA celle (35). I nostri risultati suggeriscono che sebbene le proteine ​​legate alla membrana possano essere trafficate preferenzialmente verso gli endosomi per la presentazione diretta su MHC-II, la presenza di una proteina di membrana immunogenica da sola non è sufficiente per promuovere questa presentazione. Sono stati descritti altri percorsi di presentazione non classici che possono consentire alle proteine ​​citosoliche o nucleari l'accesso all'MHC-II, inclusa la presentazione associata all'autofagia delle proteine ​​intracellulari e il trasportatore associato alla presentazione dipendente dall'elaborazione dell'antigene alle cellule T CD4+, per cui l'antigene i peptidi vengono presumibilmente trasferiti da MHC-I a MHC-II durante il riciclo della membrana (36, 37). È stato segnalato il riconoscimento diretto MHC-II-dipendente delle cellule tumorali autologhe da parte delle cellule T CD4+ specifiche per gli epitopi E7 (38, 39); tuttavia, questi studi riguardavano entrambi le proteine ​​E7 espresse da sottotipi di HPV oncogeni meno prevalenti (vale a dire, HPV-33 e HPV-59) presentati dalle cellule di cancro cervicale su molecole HLA-DR. È possibile, pertanto, che anche il sottotipo HPV, l'istologia tumorale e gli alleli HLA restrittivi possano essere fattori rilevanti nella presentazione differenziale degli antigeni nucleari HPV sulle cellule tumorali MHC-II+. Sebbene i nostri dati suggeriscano che la citotossicità diretta del tumore non sia un meccanismo probabile delle cellule T CD4+ specifiche per E6- e KRASG12V, sono stati descritti altri meccanismi antitumorali delle cellule T CD4+ e il trasferimento adottivo di cellule T CD4+ tumore-specifiche in pazienti affetti da cancro ha dimostrato attività antitumorale (7, 40, 41). Pertanto, i TCR ristretti per MHC-II come quelli identificati in questo studio possono essere utili per l'ACT nei pazienti umani, dato che tali TCR hanno come target gli epitopi derivati ​​da oncoproteine ​​driver limitate agli aplotipi HLA stimati all'1,27% e al 16,10% dei bianchi statunitensi popolazione, rispettivamente, per HLADQA1*01:02/DQB1*05:02 e HLA-DRB5*01:01 (42). In particolare, le cellule T CD4+ aiutano nel priming delle cellule T CD8+ tumore-specifiche autorizzando le DC portatrici di antigene in modo CD40L-dipendente (43–45). Dimostriamo che il TCR specifico per KRASG12V identificato in questo studio riconosce gli antigeni presentati in modo incrociato nel contesto delle DC, suggerendo che queste cellule potrebbero essere in grado di contribuire all'immunità antitumorale attraverso questa funzione. Le cellule T CD4+ possono anche fornire un aiuto locale alle cellule T CD8+ all'interno dei tumori secernendo citochine come IL-2 e IFN-, supportando la sopravvivenza delle cellule T CD8+ e reclutamento nel tumore (46). Inoltre, i TIL CD4+ possono riconoscere antigeni nel microambiente tumorale sulle cellule mieloidi come i macrofagi. Infatti, studi preclinici hanno dimostrato che in assenza di MHC-II sulle cellule tumorali, le cellule T Trp1 CD4+ trasferite adottivamente possono ancora esercitare un'immunità antitumorale dipendente dall'IFN e correlarsi con un'aumentata attività citotossica dei macrofagi (47). Tuttavia, questo fenomeno sembra dipendere dalla secrezione dell'antigene tumorale, che secondo noi è minima nel caso della maggior parte degli oncogeni. Nel complesso, il nostro studio evidenzia la selettività della presentazione diretta degli antigeni endogeni da parte delle cellule tumorali MHC-II+ e dimostra che né l'espressione CIITA né la presenza di un antigene legato alla membrana sono sufficienti da sole a promuovere il riconoscimento diretto delle cellule tumorali da parte del CD{{115} } Cellule T. Sono necessari ulteriori studi per caratterizzare quali antigeni possono essere presentati direttamente dalle cellule tumorali MHC-II+ e in quali condizioni per comprendere appieno i ruoli dipendenti dal contesto delle cellule T CD4+ nel cancro.

Cistanche pianta che aumenta il sistema immunitario

Metodi

Coltura cellulare. I TIL sono stati raccolti e coltivati ​​come precedentemente descritto (48). In breve, il tessuto tumorale primario è stato sezionato in frammenti di 2–3 mm, che sono stati posizionati in una 24-piastra a pozzetti e coltivati ​​in RPMI-1640 integrato con 1{{102}}% siero umano AB, penicillina-streptomicina, HEPES, gentamicina e 6,000 UI/ml IL-2. I TIL stravasati sono stati coltivati ​​mediante sostituzione di mezzi mezzi ogni 2-3 giorni. Le cellule T umane primarie del sangue periferico sono state coltivate in un terreno 50:50 costituito da 50% AIM V più 50% RPMI-1640 integrato con siero umano AB al 10%, penicillina-streptomicina (100 U/ mL ciascuno; Gibco, Thermo Fisher Scientific), 300 UI/mL IL-2, 5 ng/mL IL-7 e 5 ng/mL IL-15. Le linee cellulari tumorali derivate dal paziente sono state generate e coltivate come precedentemente descritto (17). In breve, il tessuto tumorale primario è stato tagliato in frammenti inferiori a 2 mm e dissociato utilizzando un GentleMACS Octo Dissociator (Miltenyi Biotec). Le cellule tumorali sono state risospese in F-Media contenente 5 μM di inibitore della chinasi Rho e placcate su un letto di fibroblasti 3T3 irradiati (30 Gy). Dopo la coltura iniziale, le cellule tumorali sono state propagate in una miscela 3:1 di mezzo condizionato 3T3- irradiato e F-Media contenente 5 μM di inibitore della chinasi Rho. CaSki (ATCC), NCI-H2444 (ATCC), DAN-G (ATCC), J76 Jurkat (ATCC), 3T3-CD40L e B-LCL sono stati mantenuti in terreno RPMI integrato con l-glutammina e HEPES ( 10 mM; Gibco, Thermo Fisher Scientific), 10% FBS, piruvato di sodio 1 mM (Gibco, Thermo Fisher Scientific), amminoacidi non essenziali 1× MEM (Gibco, Thermo Fisher Scientific) e penicillina-streptomicina (100 U/ ml ciascuno; Gibco). Abbiamo mantenuto 293GP (ATCC) nel supplemento medio DMEM con FBS al 10% e penicillina-streptomicina (100 U/mL ciascuno; Gibco, Thermo Fisher Scientific). Le cellule IHW03304, GM3107, KAS011, D8 e D66 sono state donate da Alessandro Sette (Istituto di immunologia La Jolla). Saggi ELISPOT. I TIL o i PBMC sono stati placcati a 100,000 cellule per pozzetto in piastre ELISPOT rivestite con antiIFN-Abs (1-D1K, Mabtech). Le cellule sono state restimolate con pool di peptidi HPV-16 E6 ed E7 PepMix (JPT), pool di peptidi che rappresentano mutazioni oncogene selezionate o singoli peptidi indicati a 5 ug/ml per i pool o 10 ug/ml per i peptidi per 22 ore prima dello sviluppo Piastre ELISPOT secondo le indicazioni del produttore (Mabtech). Per un controllo positivo sono stati utilizzati 5 ug/mL di fitoemoagglutinina-L. Coltura di espansione ex vivo. Le PBMC sono state placcate con un pool di peptidi che rappresentava mutazioni oncogene selezionate a 5 ug/mL. Il terreno fresco contenente 10 UI/mL di IL-2 è stato aggiunto nei giorni 4, 7 e 10. Il giorno 14, le PBMC sono state restimolate per l'uso nei test ELISPOT o di secrezione di citochine. Sequenziamento del TCR. I TIL o i PBMC sono stati restimolati con 5 ug/ml di HPV-16 E6 PepMix (JPT) o peptide KRASG12V e le cellule secernenti IFN sono state marcate in modo fluorescente utilizzando il kit di analisi della secrezione di IFN umano secondo le istruzioni del produttore (Miltenyi Biotec) . Le singole cellule IFN- + sono state ordinate in una piastra a pozzetti 96- utilizzando un FACSAria (BD Biosciences) e l'RNA-Seq è stato eseguito utilizzando un Illumina Miseq per identificare TCR e catene accoppiati. Per l'identificazione del clone TCR E6-CD4+ specifico, le cellule secernenti IFN sono state selezionate come sopra e le sequenze TCR e TCR sono state amplificate mediante PCR nidificata e multiplexata, come precedentemente descritto (49). I prodotti della PCR sono stati inviati per il sequenziamento di Sanger (ETON Biosciences). Per l'analisi della frequenza del TCR, i PBMC prima e dopo 14-giorno l'espansione ex vivo con i peptidi indicati sono stati inviati ad Adaptive Biotechnologies. Analisi dell'espressione dell'HPV. L'RNA è stato isolato dalle cellule tumorali primarie Hu-56 e dalla linea cellulare tumorale e inviato per il sequenziamento dell'RNA in massa. Le letture del sequenziamento bidirezionale sono state mappate utilizzando BWA (v0.7.12) (50) sul genoma completo dell'HPV (accesso GenBank n. NC_001526.2) e sul suo trascrittoma corrispondente. Il file della mappa di allineamento della sequenza risultante è stato convertito in una mappa di allineamento binario ordinata e indicizzata, seguita dal conteggio delle letture mappate utilizzando SAMtools (v1.2) (50). Sequenziamento dell'intero esoma. Il sequenziamento dell'intero esoma e l'RNA-Seq sono stati eseguiti presso il La Jolla Institute for Immunology Sequence Core utilizzando rispettivamente i kit Agilent di cattura dell'intero esoma e Illumina. I campioni biologici FFPE sono stati distribuiti dal Moores Cancer Center a Tempus per il sequenziamento di prossima generazione insieme al DNA di riferimento abbinato utilizzando campioni di sangue periferico. Le letture della sequenza dal sequenziamento dell'esoma del tumore e i campioni normali sono stati allineati al genoma di riferimento GRCh38 utilizzando SpeedSeq Align (v0.1.0) (51). Le varianti dell'esoma sono state identificate utilizzando SpeedSeq Somatic e le varianti sono state annotate utilizzando SNPeff (v4.3i) (52). I dati di sequenziamento dell'RNA-Seq e dell'intero esoma per questo manoscritto sono stati caricati su NCBI BioProject, numero di accesso PRJNA924789. Trasduzione retrovirale delle cellule T. Le sequenze nucleotidiche del TCR sono state sintetizzate e clonate nello scheletro del retrovirus MSGV1 utilizzando un BioXP 3200 (Codex). La sequenza era un codone ottimizzato per l'espressione nelle cellule umane. Le regioni costanti del TCR umano sono state scambiate con regioni costanti del TCR murino con sostituzioni per migliorare l'espressione superficiale e promuovere l'accoppiamento preferenziale (53, 54). I PBMC umani sono stati isolati dai buffy coat. Le cellule T CD4+ o CD8+ sono state rimosse mediante selezione magnetica e la frazione negativa contenente tutti i linfociti rimanenti è stata coltivata in un terreno per cellule T con 50 ng/mL di anticorpi anti-CD3 (OKT3) per 2 giorni.

Benefici della cisanche tubulosa-Antitumor

I surnatanti retrovirali del TCR sono stati generati mediante cotrasfezione di cellule 293GP con il vettore MSGV1 contenente la sequenza TCR rilevante e il plasmide RD113. Due giorni dopo la trasfezione, i surnatanti retrovirali sono stati raccolti e utilizzati freschi o congelati a –80 gradi. Le trasduzioni sono state eseguite su piastre rivestite con RetroNectin (Takara), come precedentemente descritto (5). L'espressione della regione costante del TCR murino è stata valutata mediante citometria a flusso per determinare l'efficienza di trasduzione. Le cellule T ingegnerizzate con TCR sono state utilizzate non prima del giorno 7 dopo la stimolazione iniziale. Saggi funzionali delle cellule T. Abbiamo co-coltivato 5 × 104 TIL, cellule T trasdotte o cellule Jurkat J76 con 1 × 105 B-LCL pulsate durante la notte con le concentrazioni indicate di peptidi o cellule tumorali 5 × 103 seminate il giorno precedente in {{16} }piastre rispettivamente a fondo U o a fondo piatto. Dove indicato, gli anticorpi anti-CD28 agonisti (clone CD28.2, BioLegend) o anti-PD-L1 bloccanti (clone 29E.2A3, BioLegend) sono stati aggiunti alle cocolture di cellule T e cellule tumorali a 5 e 10 ug/mL, rispettivamente. Per i test sulle citochine e sui marcatori di attivazione, come controllo positivo è stato utilizzato 1× Cell Activation Cocktail (BioLegend) contenente PMA e ionomicina. Per gli studi sul blocco HLA, 20 ug/ml dei seguenti anticorpi sono stati aggiunti alle B-LCL pulsate con peptidi almeno 2 ore prima dell'aggiunta delle cellule T: anti–HLA-DQ (Tü169, BioLegend), anti–HLA-DR (L243, BioLegend) o controllo dell'isotipo IgG2a di topo (MOPC-173, BioLegend). Dove indicato, le cellule tumorali sono state coltivate per 72 ore con 10 ng/ml di IFN ricombinante prima dell'aggiunta delle cellule T. I surnatanti sono stati raccolti dopo 18-24 ore, l'IFN- è stato misurato mediante ELISA (Thermo Fisher Scientific) e i pellet cellulari sono stati colorati per la citometria a flusso. I test di citotossicità sono stati eseguiti mediante cocoltura di cellule T con cellule tumorali nei rapporti effettore-bersaglio indicati. In breve, 5 × 103 cellule tumorali sono state seminate e coltivate durante la notte prima di aggiungere cellule T nei rapporti indicati. La lisi delle cellule bersaglio è stata determinata utilizzando xCELLigence Real-Time Cell Analyser (ACEA Biosciences), che ha valutato l'impedenza elettrica dovuta all'aderenza cellulare ogni 30 minuti fino alla fine dell'esperimento. I dati sono stati analizzati utilizzando il pacchetto software xCELLigence RTCA e i risultati sono stati riportati come indice cellulare normalizzato a 1 nel momento in cui sono state aggiunte le cellule T. Saggio di presentazione MHC-II. I costrutti di DNA sintetico che codificano quanto segue sono stati generati e clonati in MSGV1 utilizzando un BioXP 3200 (Codex): i 25 aminoacidi N-terminali del gene HLA-B umano, seguiti dai primi 50 aminoacidi dell'HPV-16 E6 o 25 amminoacidi di KRASG12V fusi ai 55 amminoacidi C-terminali dell'HLA-B umano, un elemento autocliccante T2A e la sequenza codificante di EGFP. I surnatanti virali sono stati generati come descritto sopra e le B-LCL autologhe sono state trasdotte su piastre rivestite con RetroNectin dopo stimolazione notturna su un letto di cellule 3T3 irradiate (0,5 Gy) che esprimono CD40L umano (3T3-CD40L). L'efficienza di trasduzione è stata valutata mediante quantificazione citometrica a flusso dell'espressione di EGFP. Le B-LCL trasdotte sono state stimolate con 3T3-CD40L in presenza di 200 UI/mL di IL umana ricombinante-4 (PeproTech) per 2 cicli successivi di 2–3 giorni prima della cocoltura con TIL autologhi. Generazione di DC per test di presentazione dell'antigene. Le DC sono state generate utilizzando il metodo dell'aderenza plastica. I PBMC congelati sono stati scongelati e piastrati in terreno DC (RPMI-1640 integrato con l-glutammina, siero AB umano inattivato al calore al 5% e 100 U/mL ciascuno penicillina-streptomicina) per 2 ore a 37 gradi. Le cellule non aderenti sono state rimosse mediante lavaggio con PBS caldo e le cellule aderenti sono state coltivate in terreno DC arricchito con 800 U/mL GM-CSF (Tonbo, Cytek Biosciences) e 500 U/mL IL-4 (PeproTech) per 6 giorni . Abbiamo aggiunto 1 ug/ml di peptide KRASG12V o 20 ug/ml di KRASG12V o proteina WT KRAS (Abcam) direttamente alle DC immature durante la notte. Il giorno successivo, le DC sono state raccolte e coltivate in cocoltura con cellule T ingegnerizzate con TCR in un rapporto 1:1 durante la notte prima di valutare la sovraregolazione del CD137 mediante citometria a flusso. Trasduzione retrovirale delle cellule tumorali. La sequenza codificante del CIITA umano è stata sintetizzata (Integrated DNA Technologies) e clonata in MSGV1 da Gibson Assembly. Le sequenze codificanti di HLADRB5*01:01 e le catene separate da una sequenza P2A sono state sintetizzate (Integrated DNA Technologies) e clonate in un vettore lentivirale pHAGE modificato a monte di una sequenza T2A seguita da una sequenza reporter CD34 troncata da Gibson Assembly. I surnatanti retrovirali sono stati generati con MSGV1, come descritto sopra. I surnatanti lentivirali sono stati generati mediante cotrasfezione di cellule 293T con plasmidi pHAGE, tat, rev, gag/pol e vsv-g. I surnatanti virali sono stati raccolti 24 ore dopo e concentrati mediante centrifugazione in provette Amicon Ultra 5 (MilliporeSigma). Le cellule tumorali sono state piastrate e, 1 giorno dopo, il mezzo è stato sostituito con un surnatante retrovirale o lentivirale integrato con 10 ug/mL di polibrene. Quattro ore dopo, il surnatante contenente il virus è stato aspirato e sostituito con un terreno di coltura. Le cellule tumorali MHC-II+ e CD34+ sono state selezionate utilizzando un cell sorter FACS Fusion (BD Biosciences). Citometria a flusso. Le cellule sono state marcate con anticorpi monoclonali coniugati con fluorocromo ai seguenti antigeni: anti-umano CD3-PE (OKT3, Tonbo, Cytek Biosciences), CD4-PE-Cyanine7 (SK3, Tonbo, Cytek Biosciences), CD8-APC (Hit8a, Tonbo , Cytek Biosciences), CD34–Alexa Fluor 647 (581, BioLegend), CD69–PerCP–Cyanine5.5 (FN50, BioLegend), CD137–PE (4B4-1, Miltenyi Biotec), PD-1 –BV650 (EH12.2H7, BioLegend), HLA-II–APC (Tü39, BioLegend) e anti-topo TCR -APC (H57-597, Tonbo, Cytek Biosciences). Le cellule morte sono state colorate con DAPI o LIVE/DEAD Fixable Aqua (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific). Il tetramero E629-38– HLA-A*02:01–PE è stato assemblato ed etichettato dal NIH Tetramer Core Facility. Le cellule sono state colorate con 1 ug/mL di tetramero per 1 ora su ghiaccio. La colorazione Ab per gli antigeni di superficie è stata eseguita per 15 minuti su ghiaccio. Per la colorazione delle citochine intracellulari (ICS), le cellule T sono state coltivate in cocoltura con APC pulsate da peptidi per 4-6 ore in presenza di Brefeldina A. Le cellule sono state permeabilizzate e colorate per le citochine intracellulari con il kit Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences) dopo la colorazione della superficie , secondo le istruzioni del produttore. Per la colorazione delle citochine sono stati utilizzati i seguenti anticorpi coniugati con fluorocromo: IFN- –APC (4S.B3, BioLegend), IL-2–FITC (MQ1- 17H12, BioLegend), TNF- –BV785 (Mab11 , BioLegend) e Granzyme B–PE (QA16A02, BioLegend). I dati sono stati acquisiti con un citometro a flusso FACSCelesta (BD Biosciences) e analizzati con il software FlowJo v10.7. Statistiche. Le analisi statistiche sono state eseguite con Prism 8 (software GraphPad). Per i confronti ICS è stato utilizzato un test t a coda 2-non accoppiato. Per confrontare la soppressione mediata da Ab-Ab bloccanti HLA della segnalazione delle cellule T, è stata utilizzata una modalità ANOVA 2-. P <0,05 è stato considerato statisticamente significativo. Approvazione dello studio. I campioni umani deidentificati utilizzati in questo studio sono stati ottenuti previo consenso informato tramite il protocollo UCSD IRB 101391CX, "Tumor Environment Phenotyping and Cell Isolation". Il consenso informato scritto è stato fornito dai soggetti partecipanti allo studio.

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