Determinazione strutturale NMR inequivocabile di ( più )-catechina-prodotti di reazione dimerica laccasi come potenziali marcatori di ossidazione dell'uva e del vino

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Astratto:( più )-Catechina—laccaseossidazionegli standard dimerici sono stati sintetizzati mediante emi-sintetizzazione utilizzando laccasi di Trametes Versicolor è una soluzione di acqua-etanolo a pH 3,6. Sono state rilevate otto frazioni corrispondenti a otto potenziali prodotti dimerici di ossidazione. I profili delle frazioni sono stati confrontati con i profili ottenuti con altre due ossidoreduttasi:polifenolo ossidasiestratto da uva e laccase da Botrytis cinerea. I profili erano molto simili, sebbene alcune differenze minori suggerissero possibili differenze nella reattività di questi enzimi. Cinque frazioni sono state quindi isolate e analizzate mediante spettroscopia NMR 1D e 2D. L'aggiunta di tracce di nitrato di cadmio nei campioni solubilizzati in acetone ha portato a segnali NMR completamente risolti di protoni fenolici, consentendo la determinazione strutturale inequivocabile di sei prodotti di reazione, una delle frazioni contenente due enantiomeri. Questi prodotti possono essere ulteriormente utilizzati come marcatori di ossidazione per studiarne la presenza e l'evoluzione nel vino durante la vinificazione e l'invecchiamento del vino.

Parole chiave: marcatore di ossidazione;( più )-catechina; segnali NMR fenolici; laccasi; nitrato di cadmio; polifenolo ossidasi

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1. Introduzione

Polifenolisono una famiglia di composti chimici ampiamente presenti in natura. Si trovano in quantità significative nel tè [1], nel cacao [2,3], nei mirtilli [4], nell'uva [5l e nei prodotti fermentati come il vino [6]. Essendo bersagli di ossidazione primaria J7,8], le strutture chimiche dei polifenoli si evolvono continuamente. Questi cambiamenti incidono sulle proprietà organolettiche di molti tipi di alimenti; sono responsabili di fenomeni quali l'imbrunimento degli alimenti [9] e le modificazioni delle caratteristiche sensoriali del vino [10,11. In enologia, questo fenomeno di ossidazione avviene nell'uva o nei vini. Per quanto riguarda l'ossidazione enzimatica, i principali enzimi responsabili dell'imbrunimento sono le ossidoreduttasi, più precisamente,polifenolo ossidasipresente nelle uve e nelle laccasi prodotte da Botrytis cinerea [12].

Enzimaticoossidazionesi verifica principalmente nel mosto d'uva, ma un ulteriore imbrunimento del vino può essere dovuto a reazioni chimiche di ossidazione |7,13]o alla Botrytis cinerea laccasi che può essere molto stabile durante l'invecchiamento del vino14. Sui substrati fenolici possono verificarsi due attività enzimatiche di ossidazione: attività monofenolossidasica caratterizzata dall'idrossilazione di un gruppo idrossile esistente in posizione adiacente e attività difenolossidasica corrispondente all'ossidazione di orto-diidrossibenzeni in orto-benzochinoni.

Secondo il Comitato per la nomenclatura dell'Unione internazionale di biochimica e biologia molecolare (NC-IUBMB), queste attività enzimatiche sono catalizzate da enzimi di classe 1-EC corrispondenti alle ossidoreduttasi. Tra questi, le tre classi principali di ossidoreduttasi che catalizzano l'ossidazione dei polifenoli sono EC1.14.18.1 (monofenolomonoossigenasi), EC1.11.1 (perossidasi/POD) ed EC1.10.3 (ossidoreduttasi che agiscono sui difenoli).

Quest'ultima classe è suddivisa in diverse sottoclassi e due di esse sono apparse particolarmente interessanti per questo studio: EC1.10.3.1 (polifenolo ossidasi/PPO) e EC1.10.3.2 (laccasi) (vedi Materiali supplementari Figura S1).

PPO, laccasi e perossidasi sono le ossidoreduttasi principalmente responsabili dell'imbrunimento durante la lavorazione dell'uva [13]. L'imbrunimento causato da POD è trascurabile nei frutti ma può aumentare la degradazione dei fenoli se combinato con PPO[15]. Il PPO è naturalmente presente nell'uva ed è in grado di catalizzare l'ossidazione dei monofenoli a catecoli e dei catecoli a pigmenti marroni [8,13,16]. Le laccasi, che si trovano nelle uve infettate da Botrytis, hanno uno spettro d'azione più ampio|17|poiché possono catalizzare l'ossidazione di molti substrati diversi. I principali bersagli di ossidazione delle laccasi rimangono 1-2 e 1-4 diidrossibenzene.

Nel vino, il benzochinone prodotto per ossidazione (PPO o laccasi) può facilmente subire ulteriori reazioni a seconda delle loro proprietà redox e affinità elettroniche [15]. Possono agire come elettrofili e reagire con derivati ​​amminici [18] o agire come ossidanti e reagire, tra gli altri, con substrati fenolici. A seconda della loro conformazione chimica (chinone o semichinone), il benzochinone può portare a diversi prodotti di reazione di ossidazione. A pH neutro, (più)-catechina sarà ossidata a chinone sulla posizione dell'anello A C5 o C7 e porterà alla formazione di sei possibili isomeri dimerici che implicano un collegamento tra la posizione dell'anello B C2', C5', o C6' dell'unità catechina superiore e la posizione dell'anello ad A C6 o C8 dell'unità inferiore [19,20]. La deidrodicatechina è un noto prodotto di questo accoppiamento [21]. Le posizioni di etichettatura delle strutture sono mostrate in Figura 1. In condizioni acide, forme semi-chinoniche possono essere presenti anche sull'anello B (posizione OH3'o OH4') e portare a quattro possibili isomeri dimeri [20,22] con l'unità catechina superiore e l'A-ring dell'unità inferiore (posizione C6 o C8). L'ossidazione enzimatica della catechina è stata studiata in studi precedenti [22,23] e i prodotti di ossidazione associati sono stati caratterizzati da HPLC [24], sebbene più raramente isolati e mai completamente caratterizzati da NMR.

Lo scopo di questo lavoro è stato innanzitutto confrontare mediante UHPLC-MS i profili dei prodotti di ossidazione dimerica( più )-catechina in presenza di tre estratti di ossidoreduttasi, ovvero PPO estratto dall'uva, laccasi dal fungo Botrytis cinerea presente nei vini dolci botritizzati [14], e laccase da Trametes Versicolor.

Il secondo obiettivo è stato quello di emisintetizzare e caratterizzare le strutture di alcuni prodotti di ossidazione dimerica mediante spettroscopia NMR ottenuta con laccasi da Trametes Versicolor.

2. Risultati e discussione

2.1. Confronto dei profili dei prodotti di reazione dimerica con tre diverse ossidoreduttasi e (più)-catechina

( più )-La catechina è stata prima ossidata in presenza di laccasi da Trametes Versicolor a pH 3,6 nella soluzione di vino modello. Dopo la separazione della frazione dimerica dalla catechina residua (più) e da altre frazioni polimeriche, otto frazioni principali sono state raccolte e analizzate mediante UHPLC-UV-MS, annotate da N1 a N8 in ordine di tempo di ritenzione crescente (Tabella 1). Gli spettri di massa dell'elettrospray in modalità positiva hanno mostrato i picchi ionici [M più H] più a m/z 579 da N1 a N6, ipoteticamente corrispondenti a un dimero formato da un legame singolo tra due unità di catechina, e [M più H] più a m/577 per N7 e N8, suggerendo ipoteticamente la formazione di un collegamento aggiuntivo.

Questi ottoossidazionefrazioni sono state potenzialmente osservate dopo la depolimerizzazione chimica di una frazione tannica in lavori precedenti [25,26] e potrebbero essere le stesse già descritte da Guyot et al. [20], anche se le condizioni sperimentali erano leggermente diverse. Infatti, in questo studio precedente, un estratto grezzo di PPO è stato utilizzato a pH3 e 6 per ottenere otto frazioni. Nel presente studio, tre diversi enzimi sono stati confrontati a pH 3,6 nella soluzione di vino modello. L'analisi comparativa LC-MS delle principali frazioni di ossidazione ottenute con i tre diversi enzimi (laccase da Trametes Versicolor, lac-case da Botrytis cinerea e polifenolo ossidasi estratta dall'uva) sono presentate nella Tabella 2. Per ciascuna delle otto frazioni, i tempi di ritenzione erano quasi identici con i diversi enzimi e m/z simili sono stati determinati con l'analisi MS. Questi risultati supportano l'ipotesi che le stesse frazioni siano state ottenute per ciascun enzima, contenenti prodotti con strutture simili a quelle ipotizzate da Guyot et al. [20]. Lopez-Serrano e Ros Barcel6 [27] hanno anche condotto uno studio comparativo dei prodotti di ossidazione della (più)-catechina con due diversi enzimi: la perossidasi e la polifenolo ossidasi, entrambi estratti dalle fragole. Hanno concluso che i prodotti ottenuti con i due enzimi erano qualitativamente gli stessi. Un ulteriore composto denominato N4' con m/z=578 Th e Rt=15.66 min è stato osservato in esperimenti con laccasi da Botrytis cinerea ed estratto PPO ma non con laccasi da Trametes Versicolor, il che suggerisce possibili differenze in reattività per questi enzimi.

2.2. Studio e ottimizzazione dei parametri fisico-chimici sui segnali OH fenolici e alifatici 1H-NMR

La caratterizzazione strutturale dei dimeri delle procianidine può essere ottenuta mediante analisi NMR. In particolare, la posizione di collegamento precisa tra le unità può essere determinata utilizzando gli spettri di correlazione HMBC e/o ROESY [28,29](Figure S2 e S3). Nel caso di un legame di tipo etere (COC), è necessaria l'attribuzione dei protoni segnale idrossile. Può anche essere cruciale nel caso di collegamenti CC se alcuni protoni alifatici o aromatici si sovrappongono o se mancano alcune correlazioni chiave. Tuttavia, anche in un solvente aprotico, i protoni idrossilici dei polifenoli appaiono spesso come segnali ampi dai quali non è possibile ottenere informazioni strutturali [30]. Questo problema è stato provvisoriamente affrontato con l'aggiunta di tracce di

Cd(NO3)2 nelle soluzioni campione. Infatti, i segnali 'H ampi dei gruppi OH sono dovuti allo scambio intermolecolare tra questi protoni OH e altri protoni nel solvente o nel soluto. Riducendo i legami intermolecolari, la presenza di nitrato di cadmio nei campioni può diminuire questi scambi, migliorando così la nitidezza dei segnali protonici OH.

2.2.1.Effetto dell'aggiunta di cadmio

Dopo liofilizzazione, le cinque frazioni N2, N3, N4, N6 e N8 sono state solubilizzate in acetone-dg. Quindi, gli spettri NMR di protoni 1D sono stati acquisiti a 25 gradi prima (Figura 2A) e dopo l'aggiunta di piccole quantità di cadmio (Figura 2B). In puro acetone-d., i protoni fenolici OH di tutte le frazioni apparivano come ampi picchi. Dopo l'aggiunta di cadmio, questi protoni hanno mostrato segnali altamente risolti nel caso delle frazioni N6 e N8, mentre per le frazioni N2, N3 e N4 i segnali erano solo un po' più nitidi. Va anche menzionato che l'aumento del contenuto di Cd non ha avuto alcun effetto sulla risoluzione del segnale OH, poiché non è stata osservata nitidezza o ampiezza della larghezza di linea del picco quando sono state aggiunte successive piccole quantità di Cd ai campioni (dati non mostrati).

I segnali OH fenolici altamente risolti dai prodotti N2, N3 e N4 sono stati ottenuti grazie all'essiccazione e alla risolubilizzazione aggiuntive (Figura 2C,D).

La differenza di comportamento all'aggiunta di Cd tra le frazioni può essere spiegata dalla forza delle interazioni molecolari: più forti nel caso di N2, N3 e N4 rispetto a N6 e N8, essendo necessario un ulteriore passaggio per rompere questi legami.

Questo passaggio aggiuntivo può essere il passaggio chiave quando si utilizza Cd per ottenere segnali OH fenolici altamente risolti in qualsiasi situazione, indipendentemente dall'origine dei campioni, dalla reazione di sintesi o dai prodotti polifenolici naturali.

Un lavoro precedente che si occupa della caratterizzazione strutturale inequivocabile dipolifenolodimeri che utilizzano segnali NMR fenolici OH altamente risolti grazie all'aggiunta di nitrato di cadmio è stato pubblicato nel 1996[30]. A nostra conoscenza, da allora nessun altro documento di ricerca che utilizza questa metodologia è stato pubblicato. Successivamente sono state intraprese altre indagini per raggiungere questo obiettivo, sia mediante aggiunte dosate di acido picrico [31] sia utilizzando una bassa temperatura di acquisizione [32]. Ciò può essere spiegato dall'ulteriore passaggio necessario per ottenere un effetto decisivo sulla nitidezza del picco di OH con l'aggiunta di Cd, come descritto sopra. Tuttavia, il cadmio sembra essere di grande valore, poiché è possibile ottenere segnali altamente risolti senza la necessità di aggiungere quantità precise, in contrasto con l'acquisizione di spettri di acido picrico o NMR a basse temperature.

2.2.2. Effetto della temperatura

Una diminuzione della temperatura da 25 gradi C a 15 gradi non ha avuto alcun impatto sulla nitidezza dei segnali OH fenolici o OH alifatici. Tuttavia, gli spostamenti verso il basso dei picchi di protoni scambiabili ci hanno permesso di separare alcuni segnali OH fenolici e alifatici sovrapposti, rendendo la loro identificazione più ovvia (Figura 3). Diminuendo la temperatura, il tasso di scambio protonico è stato ridotto e ci si potrebbe aspettare picchi di OH alifatici più acuti [31]. La temperatura di 15 gradi non è ovviamente sufficientemente bassa per ottenere segnali OH alifatici ben risolti. Tuttavia, ci ha permesso di identificare chiaramente la risonanza di due protoni OH alifatici nei campioni N3 e N6 e di uno nel campione N8. Lo spettro del campione N2 mostrava anche due segnali di protoni alifatici OH, che erano più distinguibili a 25 gradi C rispetto a 15 gradi (Figura 2E). Nel caso del campione N4, i segnali derivanti dall'OH alifatico erano visibili solo in parte nel spettri, indipendentemente dal fatto che la temperatura sia stata impostata a 25 gradi oa 15 gradi C, a causa della persistente sovrapposizione (Figura 2E).

2.3. Caratterizzazione strutturale degli standard dimerici: analisi dello spettro NMR

Gli spettri NMR delle frazioni N2, N3, N4, N6 e N8 hanno mostrato che i prodotti di ossidazione erano di elevata purezza poiché le intensità del segnale di altri composti rilevati erano inferiori al 10 percento rispetto a quelle di questi prodotti.

In tutti gli spettri si possono distinguere quattro regioni di spostamento chimico lH tipiche delle unità di catechina (Figura 2C): i segnali dei protoni alifatici degli anelli piranici (anelli C) si trovano nella regione da 2,3 a 5.0 ppm, e quelli dei protoni segnale aromatico degli anelli resorcinolici (anelli A) e degli anelli catecolici (porta) rispettivamente da 5,5 a 6,3 ppm e da 6,3 a 7,1 ppm. I segnali OH fenolici di entrambi gli anelli A e B apparivano da 7,1 a 10 ppm. Gli spettri NMR di entrambe le frazioni hanno mostrato la presenza di distinti insiemi di segnali di unità di catechina in un rapporto di intensità costante: sono stati osservati due insiemi di segnali negli spettri delle frazioni N2, N3, N6 e N8 in accordo con la presenza di dimeri e quattro insiemi negli spettri N4, che possono corrispondere a un tetramero, due dimeri o una miscela di oligomeri diversi, cioè un trimero più un monomero. Per determinare il grado di oligomerizzazione dei prodotti presenti nella frazione N4 è stato condotto un esperimento 'H DOSY utilizzando una miscela contenente aliquote di entrambe le frazioni N4 e N2. I coefficienti di diffusione di tutti i segnali mostravano valori simili (Figura 4), indicando la presenza di due dimeri di catechina nella frazione N4.

Grazie ai segnali del fenolo OH completamente risolti che forniscono risultati quantitativi affidabili, il tipo di legame tra le unità di catechina può essere dedotto direttamente dall'integrazione della superficie del picco. Pertanto, per entrambe le frazioni, N3 e N6, la mancanza di un OHfenolo (appartenente alla resorcina o a un anello catecolo) e la mancanza di un protone aromatico della resorcina indicavano un legame interflavanico (IFL) di tipo etereo che implica un'opposizione in un A o B e una posizione C6 o C8 in un anello A. Nel caso del campione N2, mancavano due protoni aromatici, uno di un anello B e uno di un anello A, il che implica un IFL CA-CB. Lo spettro 1D 'H della frazione N4 ha mostrato che mancavano due protoni dell'anello B, così come due protoni dell'anello A. I legami tra le unità dimeriche della frazione N4 sono quindi entrambi di tipo CC. Gli spettri della frazione N8 erano abbastanza diversi dagli altri quattro. Alcuni segnali erano tipici delle unità di catechina, in cui mancavano tre fenoli OH, un anello A aromatico e un anello B protoni, oltre a un OH alifatico. D'altra parte, alcuni altri segnali NMR sono atipici di un'unità di catechina: metilene con spostamenti chimici 13C smacchiati (~ 40 ppm) e un gruppo chetonico (~ 192 ppm).

I sistemi di spin protonico degli anelli C, A e B sono stati determinati utilizzando entrambi gli spettri 'H 1D e 1H 2D TOCSY (non mostrati). Sono stati osservati due sistemi di spin ABMX C-ring (tipico della catechina) negli spettri delle frazioni N2, N3, N6 e N8 e quattro per la frazione N4. Negli spettri delle frazioni N2, N3, N6 e N8, due doppietti meta-accoppiati (J~2Hz) e un singolo nella regione aromatica dell'anello A sono stati assegnati, rispettivamente, ai protoni dell'anello A dell'unità di catechina non legata e al protone residuo dell'anello A dell'unità di catechina legata a C6-o C8-. Negli spettri di N4, a causa della presenza di due dimeri, sono stati rilevati e assegnati quattro doppietti meta-accoppiati e due singoletti come descritto sopra. Anche i sistemi protonici dell'anello B sono stati facilmente determinati da questi spettri e ci hanno permesso di identificare due sistemi di spin protonico ABM per i dimeri delle frazioni N3 e N6, mentre un sistema di spin protonico ABM e uno AB sono stati rilevati per il dimero N2 e un sistema ABM e un sistema di spin protonico AM per il dimero N4. Il dimero N8 ha mostrato un solo sistema di spin ABM B-ring tipico di un monomero di catechina.

2.3.1.Determinazione della posizione dell'anello A dell'IFL dei dimeri delle frazioni N2, N3, N4 e N6

L'istituzione del ponte situato sull'anello di dimeri A (es., posizione C6A-o C8A) richiede l'attribuzione del protone HA residuo dell'unità di catechina CA-linked. Grazie ai segnali OH fenolici altamente risolti, un facile punto di partenza è stata l'identificazione dei due protoni OHfenolo delle unità legate all'anello A, cioè l'anello A che

had one isolated lHspin. This may be achieved using lH-13C long-range correlations, as illustrated in Figure5. The OH5A has readily been identified thanks to a correlation with the C4aC. This quaternary carbon is indeed characterized by both its chemical shift at~100 ppm and a long-range correlation observed with the H4Cprotons. OH5A also correlated with two other carbons∶ the most deshielded （δ>145 ppm） was obviously C5A, while the other (6>125 ppm) was C6A, which also showed a correlation with the other OHA phenol proton,i.e., OH7A. This latter correlated with two other carbons: a deshielded quaternary carbon（δ>145ppm） and a more shielded carbon（δ>125 ppm） che sono stati facilmente attribuiti rispettivamente a C7A e C8A. Una volta assegnati C6A e C8A, il protone HA residuo può essere attribuito direttamente agli spettri HSQC. Si è così trovato che questo protone HA residuo era H6A per tutte le frazioni N2, N3, N4, N6. L'IFL tra le unità di catechina implicava quindi una posizione C8A per tutti i dimeri.

2.3.2. Determinazione della posizione dell'anello B dell'IFL

Dimeri delle frazioni N2 e N4. Gli spettri della frazione N2 hanno mostrato due diversi tipi di sistemi di spin protonico dell'anello B: un AMX corrispondente all'anello B dell'unità non collegata e un AM con una costante di accoppiamento di circa 8 Hz, caratteristica di H6'B e H5' B di un'unità collegata a C2'B. Il collegamento tra le unità del dimero N2 è quindi C2'B-C8A. Gli spettri NMR della frazione N4 hanno anche mostrato diversi sistemi di spin B: due AMX, corrispondenti all'anello B non collegato, e due sistemi AXspin, entrambi con costanti di accoppiamento di circa 2 Hz, che sono caratteristici di H2'B e H6' B protoni di unità C5'B-linkate. La presenza di correlazioni H/13C a lungo raggio tra la banda H6 e C8A, osservate negli spettri HMBC dei due dimeri, è conforme a un collegamento C5/'B-C8A (Figura 5).

Dimeri delle frazioni N3 e N6. Gli spettri delle frazioni N3 e N6 hanno mostrato la presenza di due sistemi protonici AMX B-ring e la mancanza di un segnale OH fenolo. Poiché sono stati identificati tutti i protoni fenolici OHA delle unità dimeriche (come descritto sopra), il segnale fenolico OH mancante può essere quello di OH3'B o quello di OH4'B.

La posizione OH (3'B o 4'B) può essere facilmente determinata tramite correlazioni ROE con H2'Bor H5'B, rispettivamente, o utilizzando correlazioni HMBC a lungo raggio come illustrato nella Figura 5.

L'attribuzione dell'OH residuo degli anelli B è stata prontamente eseguita utilizzando correlazioni HMBC o ROESY a lungo raggio, come illustrato nella Figura 5. Nel caso del dimero N3, è stata osservata una correlazione ROE tra H5'B e l'OH residuo 'B dell'unità catechina collegata attraverso il suo anello B. Questo OH è stato quindi identificato come OH4'B. Nel caso della frazione N6, l'OH'B residuo è stato assegnato a OH3'B, poiché è stata osservata una correlazione ROE tra questo OH e H2'B. Le correlazioni HMBC a lungo raggio sono conformi a queste attribuzioni. Le posizioni di collegamento di questi due dimeri sono state quindi determinate come segue: CO3'B-C8A e CO4'B-C8A per N3 e N6. rispettivamente.

Frazione N8. L'analisi dello spettro del dimero N8 ha mostrato che un'unità di questo dimero è la catechina con due posizioni di collegamento una sull'anello A, una in C8A e l'altra in posizione C-O7A, poiché i protoni H8A e OH7A sono mancante. L'altra unità di questo dimero mostrava caratteristiche spettrali singolari, indicando la perdita dell'aromaticità dell'anello B e la presenza di diverse posizioni di collegamento su entrambi gli anelli B e C.

I segnali NMR 'H derivanti dall'anello B erano due doppietti a 2,49 e 2,71 ppm, che mostravano un accoppiamento geminale di ~ 15 Hz (12,03 ppm) tipico di un gruppo metilenico e una singoletto a 6,38 ppm derivante da un protone etilenico. Poiché questi protoni di metilene ed etilene non erano accoppiati, è probabile che si trovino nelle posizioni 2'B e 5'B. Lo spettro HIMBC ha mostrato tutte le correlazioni, consentendo attribuzioni accurate di questi atomi di carbonio dell'anello B, come illustrato nella Figura 5. L'H2C di questa unità ha fornito tre correlazioni con i atomi di carbonio dell'anello B: uno è il carbonio di metilene a ~45 ppm, che è stato quindi attribuito a C2'B e i restanti due, con carboni che risuonano a ~90 ppm e~162 ppm, che possono essere assegnati a C1'B e C6'B.H5'B hanno fornito solo forti correlazioni 3J con due carboni quaternari di questo anello B : uno è il carbonio precedentemente assegnato a C3'B(~95 ppm), e l'altro, che risuonava a ~90 ppm, potrebbe quindi essere attribuito a C1'B. Il carbonio a ~162 ppm è stato quindi dedotto come C6'B.

La presenza di un OH alifatico (~5,8 ppm) nella posizione C3'B (~95 ppm) è stata determinata attraverso la sua correlazione ROE con entrambi i protoni H2'B. Inoltre, OH3/B ha fornito una correlazione HMBC con un carbonio quaternario a ~ 192,5 ppm, caratteristica di un gruppo chetonico nella posizione C4'B.

La schermatura di questo C1'B di circa 40 ppm è conforme ad una perdita di aromaticità dell'anello B. Inoltre, la mancanza di OH nella posizione C7A dell'altra unità è in accordo con un collegamento etere C1'BO-C7A.

I dati NMR hanno mostrato che l'anello C di questa unità non ha OH3C. La presenza di un collegamento C3C-O-C3'B è conforme alla schermatura di C3C di circa 1,5 ppm nonché allo spostamento chimico di C3'B che è tipico del carbonio emichetale (95 ppm).

Complessivamente, i dati spettrali NMR ci consentono di concludere che questo dimero corrisponde alla deidrocatechina A descritta in precedenza da Winges et al.[33] e poi da Guyot et al.[20].

Le strutture dei sei composti dimerici determinati da queste analisi NMR sono mostrate nella Figura 6, N2, N3, N6 e N8 sono prodotti puri e N4 è una miscela di due isomeri.

3. Materiali e metodi

3.1.Prodotti chimici

(più)-catechina idrato Maggiore o uguale al 98 per cento; laccase da Trametes Versicolor(0.94 U·mg-1); sodio fosfato bibasico diidrato Maggiore o uguale al 98 percento; acido citrico (reagente ACS, nitrato di cadmio tetraidrato 99,997 percento; acido formico e Amberlite XAD7HP sono stati ottenuti da Sigma-Aldrich) (Saint-Louis, MO, USA). Acetone-dg è stato acquistato da Euriso-top (Saarbrüicken, Germania) e trifluoroacetico acido (TFA) di Roth Labo (Karlsruhe, Germania). Acqua LC-MS, acetonitrile LC-MS (ACN) e metanolo LC-MS (MeOH) provenivano tutti da VWR (Radnor, PA, USA).

3.2. Preparazione della soluzione di vino modello

La soluzione di vino modello era una soluzione etanolo/acqua (12/88;o/o) con acido tartarico 0.033 M, aggiustata a pH 3,6 con NaOH 1 M [34].

3.3. Estratti di PPO d'uva grezza

L'estratto di PPO è stato preparato come descritto in precedenza da Singleton et al.[35]. L'uva congelata è stata prima miscelata in un tampone acetato (1,5 M, pH5; acido ascorbico 10 gL-I). La miscela è stata quindi filtrata e centrifugata (3000 g; 10 min). Il residuo è stato infine lavato con acetone (80 percento) ed essiccato all'aria.

3.4.Laccasi da Botrytis Cinerea

La laccasi da Botrytis cinerea è stata ottenuta come descritto da Quijada-Morin et al.[36]. È stato prodotto dal ceppo VA612 (raccolto in 2005 in un vigneto a Hautvillers, Champagne, Francia, dalla cultivar Pinot Nero). In breve, le colture su terreno di lievito di malto solido sono state lasciate per una settimana a 24 gradi sotto luce blu. Le spore sono state quindi raschiate e inoculate in un matraccio Erlenmeyer da 500 ml contenente 125 ml di terreno di coltura (4{{30}} gL-1glucosio, 7 gL{{10}}glicerolo, 0,5 g·L-1L-istidina, 0,1 g:L-1 CuSO,1,8 gL-1 NaNO3,0,5 g:L -1 KCl, 0,5 gL-1 CaCl2·H2O, 0,05 g: L-1 FeSO4,7H2O, 1,0 g L-1KH2PO4 e 0,7 gL-1 MgSO 4-7H2O). Dopo 3 giorni di incubazione e 2 giorni di crescita nello stesso terreno precedente, alle precolture è stato aggiunto acido gallico (2 gL-1). Dopo 5 giorni, il mezzo liquido è stato filtrato e il supernatante è stato sottoposto a filtrazione tangenziale in un sistema di filtrazione Quixstand (GE Healthcare UK, Little Chalfont, Inghilterra) dotato di un peso molecolare di 30 kDa tagliato la membrana. Il concentrato è stato infine sottoposto a diafiltrazione contro acqua distillata e sono state mantenute solo le frazioni che presentavano attività ossidante contro ABTS (grado -80).

3.5.Procedura di ossidazione

Una soluzione di laccasi (1 gL-1) in tampone fosfato-citrato è stata precedentemente preparata e aggiunta a una soluzione di 6 g.L-1(più)-catechina (vino modello) per ottenere una concentrazione finale di laccasi di { {6}}.3 gL-1. La soluzione ottenuta è stata quindi agitata lentamente (180 rpm) a temperatura ambiente per 2 h. Le concentrazioni sono state precedentemente ottimizzate e la sperimentazione è stata eseguita in triplicato.

3.6. Reazione Arresto su Resina Amberlite XAD7HP

Una colonna di lite ambrata è stata condizionata con etanolo (assoluto) e risciacquata con due volumi di colonna di acqua milli-O. Il precedente mezzo di reazione laccasi/(più)-catechina è stato gocciolato sulla colonna e prima eluito con due volumi di colonna di milli-Qacqua [37]. La colonna è stata quindi eluita con etanolo fino a quando la frazione raccolta non è stata colorata. Solo le frazioni di etanolo sono state conservate, evaporate e liofilizzate. La polvere è stata conservata a -80 gradi fino al momento dell'uso.

3.7.Procedura di purificazione della frazione dimerica mediante cromatografia flash

La polvere liofilizzata è stata prima purificata utilizzando un sistema di cromatografia flash puriflash430 dotato di un rivelatore UV impostato a 280 nm e una colonna Puriflash diol 50 um f0025. La fase mobile binaria era costituita da acetonitrile (solvente A) e metanolo (solvente B), entrambi acidificati con 0,1 percento di TFA. Una serie di iniezioni è stata eseguita a una portata costante di 20 ml·min-1, utilizzando il seguente gradiente: 100 percento A per 4,4 min; 0-10 percentuale B in 10 min; 10 percento B per 5 min; 10-90 percentuale B in 5 min; 90 percento B per 3 min;90-10 percentuale B in 2 min; 10 percento B per 10 min. Il volume di iniezione era 1 ml (300 mg di polvere liofilizzata disciolti in 1 ml di solvente A). Ogni volta sono state raccolte tre frazioni distinte. Il primo corrispondeva alla catechina residua (più) e il terzo era una miscela di polifenoli ad alto peso molecolare. La seconda frazione eluita, contenente una miscela di prodotti di ossidazione dimerica, è stata evaporata e liofilizzata prima della seconda fase di purificazione.

3.8. Procedura di purificazione dei prodotti di ossidazione dalla frazione dimerica utilizzando un sistema cromatografico di semi-preparazione

La frazione contenente prodotti di ossidazione dimerica è stata purificata utilizzando un sistema cromatografico a media pressione Bio-Rad NGC 10 semi-preparativo dotato di una colonna Varian Dynamax C18 Microsorb a fase inversa (250 × 21,2 mm; 3 um). La fase mobile binaria era costituita da acqua milli-O (solvente A) e 80 percento di acetonitrile, 20 percento di acqua Milli-Q (solvente B), entrambi acidificati con 0,05 percento di TFA. Una serie di iniezioni (300 μL) della polvere liofilizzata (20 mg disciolti in 200 μL di solvente A e 100 μL di ACN) sono state eseguite nelle seguenti condizioni di eluizione: 100 percento A per 4 min; 0-35 percentuale B in 46 min;35-100 percentuale B in 2 min;100% B per 5 min. Ogni volta sono state raccolte otto frazioni distinte, corrispondenti a segnali UPLC puri a 280 nm. Ciascuna frazione è stata evaporata e liofilizzata prima dell'analisi NMR.

3.9.Preparazione del campione per l'analisi NMR

Circa 1 mg di ciascuna polvere liofilizzata pesata in provette Eppendorf è stata risolta in 500 μL di acetone-dg. Quindi, ~ 10 ul di una soluzione concentrata di nitrato di cadmio in acetone-d, sono stati aggiunti ai campioni e le soluzioni risultanti sono state trasferite in tubi NMR da 5 mm per l'analisi NMR. Per alcuni campioni è stato eseguito un ulteriore passaggio: dopo solubilizzazione delle polveri liofilizzate in acetone-dg in presenza di tracce di cadmio, i campioni sono stati evaporati a secco e quindi risolubilizzati in acetone-d senza ulteriore aggiunta di Cd.

3.10.Specifiche dello strumento

Analisi UPLC-MS. Le reazioni sono state monitorate utilizzando due sistemi UPLC-MS. Il primo è stato utilizzato per identificare con precisione i tempi di ritenzione dei prodotti utilizzando un metodo a gradiente lungo. cioè, cromatografia liquida ad altissime prestazioni in fase inversa di Waters accoppiata alla spettrometria di massa (UHPLC-MS). Il sistema di cromatografia liquida era un Acquity UPLC (Waters, Milford, MA, USA) dotato di un rivelatore a matrice di fotodiodi. Abbiamo utilizzato una colonna Acquity UPLC HSS T3 (1,8 um, 2,1 × 150 mm). La temperatura della colonna era di 25 gradi. La fase mobile binaria era costituita da 0,1 percento di acido formico in acqua (solvente A) e acetonitrile (solvente B). La separazione è stata eseguita a una portata costante di 0,25 ml·min-1, utilizzando il seguente gradiente:8-11 percentuale B in 2 min; 11 percento B per 8 min; 11-25 percento B in 15 min;25-55 percento Bin 5 min;55-99 percento Bin 1 min;99 percento B per 4 min;99-8 percento Bin1 min;8 percento B per 4 min. Il volume di iniezione era di 5 μL. Lo spettrometro di massa era un quadrupolo semplice a ionizzazione elettrospray (ESI) Waters Acquity QDa (Waters, Milford, MA, USA). La tensione capillare è stata fissata a 0,8 kV. Gli spettri di massa sono stati acquisiti in un intervallo di massa di 200-900 Thin the positive ion mode.

Il secondo sistema UHPLC-MS, utilizzato per la verifica rapida durante le fasi di purificazione, era lo stesso descritto in precedenza, con una colonna Acquity UHPLC HSS T3 （1,8 μm, 2,1×100 mm） riscaldata a 38 gradi. La separazione è stata eseguita a una portata costante di 0,55 ml·min{10}}, utilizzando il seguente gradiente rapido: 0,{12}} percentuale di B in 5 minuti; 40-99 percentuale B in 2 minuti; 99 percento B per 1 minuto; 99-0,1 percento B in 1 min. Il volume di iniezione era di 2 μL. Lo spettrometro di massa era una trappola ionica a ionizzazione elettrospray (ESI) Bruker Amazon X (Bruker Daltonics, Brema, Germania). La tensione capillare è stata impostata a -5,5 kV. Gli spettri di massa sono stati acquisiti in un intervallo di massa di 50-2000 Thin the positive ion mode.

Tutte le analisi UPLC-MS sono state eseguite in triplicato.

Strumentazione NMR. Tutti gli spettri NMR sono stati registrati su uno spettrometro Agilent DD{{0}} MHz (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA), operante a 500,05 e 125,74 MHz per protoni e nuclei di carbonio-13, rispettivamente, utilizzando una sonda di rilevamento indiretto da 5 mm dotata di una bobina di gradiente.1D'H e 13C,2Dhomonuclear1H TOCSY e ROESY e esperimenti eteronucleari lH/13C HSQC e HMBC sono stati eseguiti utilizzando sequenze di impulsi classiche e analizzati utilizzando sia VNMRJ4.2 che MestReNova 14.2 .1 (Mestrelab Research, Spagna). Le misurazioni DOSY sono state acquisite ed elaborate come descritto in precedenza 38]. I parametri di acquisizione della sequenza di impulsi DgcsteSL erano i seguenti: il tempo di ritardo di diffusione e l'ampiezza dell'impulso del gradiente sono stati impostati rispettivamente a 50 ms e 2 ms, l'intensità del gradiente(g) è stata incrementata in 16 fasi con uguale spaziatura g2 da 0,3 a 32G·cm-I. Dopo la correzione di fase, gli spettri DOSY 2D sono stati costruiti dalla misurazione dell'altezza del picco utilizzando il software VNMRJ4.2.

Tutti gli spettri sono stati riferiti ai segnali solvente acetone-dg (segnale 'H residuo a 2,05 ppm e segnale 13C a 29,92 ppm).

4. Conclusioni

È stata studiata l'azione di tre diverse ossidoreduttasi (polifenolo ossidasi estratta dall'uva, laccasi da Botrytis cinerea e laccasi da Trametes Versicolor) sulla ( plus )-catechina e i profili risultanti LC-UV-MS erano molto simili, sebbene alcune differenze minori ha suggerito possibili differenze nella reattività di questi enzimi.

Le strutture di sei prodotti di ossidazione della catechina-laccasi (usando la laccasi di Trametes Versicolor) sono state ottenute sulla base di specifiche firme NMR (quattro prodotti puri, cioè N2, N3, N6 e N8 e N4, corrispondenti a una miscela di due isomeri). L'attribuzione completa dei segnali OH fenolici è stata possibile grazie all'aggiunta di nitrato di cadmio con una procedura di preparazione del campione che ha consentito l'attribuzione univoca dei legami tra le unità di catechina per alcuni dei composti di interesse. Questa procedura semplificherà notevolmente l'analisi NMR di miscele di polifenoli, sintetizzate o estratte da prodotti naturali.

Gli standard ottenuti in questo lavoro potranno essere utilizzati in futuro come marcatori di ossidazione per studiarne la presenza e l'evoluzione durante la maturazione dell'uva e l'invecchiamento del vino. Oltre alla catechina, anche altri composti polifenolici, inclusi flavonoidi e non flavonoidi, possono essere utilizzati come substrati della laccasi per ottenere nuovi standard aggiuntivi.

Abbreviazioni

NMR: risonanza magnetica nucleare,

Cd: cadmio,

TOCSY: spettroscopia di correlazione totale,

ROESY: spettroscopia a effetto Overhauser nucleare a telaio rotante,

HSQC: esperimento di correlazione eteronucleare di un singolo quantico,

HMBC: connettività multibanda eteronucleare,

DOSY: spettroscopia con ordine di diffusione.

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