Marcatori dei podociti urinari nelle malattie renali

per ulteriori informazioni:ali.ma@wecistanche.com

Lingfeng Zeng, et al

Astratto

I podociti svolgono un ruolo importante nel mantenimento della funzione renale e sono l'obiettivo principale di moltirenemalattie. La lesione dei podociti provoca lo spargimento di frammenti cellulari derivati ​​dai podociti e bersagli molecolari specifici dei podociti nelle urine, che possono fungere da biomarcatori direnemalattie. I podociti intatti, vitali o morti, e le microvescicole derivate dai podociti potrebbero essere quantificati nelle urine mediante vari metodi di centrifugazione, visualizzazione e coltura. Gli obiettivi proteici specifici dei podociti dal nucleo, dal citoplasma, dal diaframma a fessura, dalla membrana basale dei capillari glomerulari e dal citoscheletro, nonché il loro corrispondente RNA messaggero (mRNA), nelle urine, potrebbero essere quantificati mediante western blotting, ELISA o polimerasi quantitativa reazione a catena. Sebbene alcune di queste tecniche possano essere attualmente costose o laboriose, potrebbero diventare ampiamente disponibili in futuro grazie al miglioramento della tecnologia e dell'automazione. L'applicazione diurinariopodocitamarcatori per la diagnosi e il monitoraggio di varirenemalattieè stato esplorato, ma i dati pubblicati in questo settore non sono sufficientemente sistematici e mancano di convalida esterna. Ulteriori ricerche dovrebbero concentrarsi sulla standardizzazione, il confronto e l'automazione dei metodi di laboratorio, nonché sulla definizione del loro valore aggiunto ai test clinici di routine.

Parole chiave:Podocita, Biomarcatore, mRNA, miRNA, Nefrina, Podocina, Podocalyxin, Synaptopodin,Cronicorenepatologia

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1. Introduzione

1.1. Epidemiologia della malattia renale cronica

Cronicorenepatologia(CKD) è una malattia non trasmissibile importante e costosa [1]. Con la disponibilità della terapia sostitutiva renale, la spesa sanitaria utilizzata per il trattamento dell'insufficienza renale cronica (Ccronicorenepatologia)aumentò notevolmente dopo gli anni '60 [2,3]. Nel 2015, oltre 2,5 milioni di pazienti hanno ricevuto una terapia sostitutiva renale in tutto il mondo e si prevede che questo numero raddoppierà entro il 2030 [4]. Mezzi efficaci per la diagnosi, il trattamento e il monitoraggio direnepatologiasono molto necessari.

1.2. I podociti al centro delle malattie renali

La funzione primaria del rene è l'escrezione dei rifiuti metabolici e dell'eccesso di acqua corporea [5], che si ottiene mediante tre processi: (1) filtrazione del sangue circolante attraverso il glomerulo per formare un ultrafiltrato nello spazio di Bowman; (2) riassorbimento selettivo di sostanze utili attraverso il tubulo renale; e (3) secrezione selettiva di altri rifiuti metabolici dal capillare peritubulare al fluido tubulare [6]

Sebbene il rene sia costituito da più tipi cellulari disposti in una delicata 3-architettura dimensionale, i podociti svolgono un ruolo chiave nel mantenimento della normale funzione renale ed è l'obiettivo principale di moltirenemalattie. I podociti sono cellule terminali differenziate altamente specifiche che, insieme alle cellule endoteliali e alla membrana basale capillare glomerulare (GCBM), costituiscono la barriera di filtrazione glomerulare [7]. I podociti hanno un corpo cellulare voluminoso che è separato dal GCBM da uno spazio sub-podocitario [8]. Il corpo cellulare dà origine a lunghi processi primari che si estendono verso il GCBM e sono fissati a quest'ultimo da una vasta gamma di processi del piede [8].

I podociti hanno diverse funzioni fisiologiche. Mantengono la morfologia dell'ansa vascolare glomerulare, regolano la filtrazione glomerulare e partecipano alla risposta immunologica e infiammatoria locale. Inoltre, i podociti sono in parte responsabili della sintesi e del turnover del GCBM [9], nonché della produzione di fattori paracrini come il fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF), importante nella regolazione della permeabilità e della proliferazione delle cellule endoteliali [10]. La disfunzione dei podociti gioca un ruolo fondamentale nella patogenesi e nella progressione di moltirenemalattie. Risultano mutazioni di vari geni correlati ai podocitirenemalattie, che in genere si presentano clinicamente come sindrome nefrosica resistente agli steroidi e istologicamente come glomerulosclerosi focale (FGS). D'altra parte, le disfunzioni podocitarie acquisite, inclusa una riduzione del numero o della densità dei podociti e la fusione dei processi del piede dei podociti, portano a lesioni secondarie endoteliali e GCBM, perdita di carica negativa GCBM, anomalia proteica della membrana iatale e infine proteinuria attraverso vari meccanismi. 11,12].

Una conseguenza caratteristica della lesione dei podociti è l'interazione indebolita con GCBM, che si è accumulata nel distacco dei podociti dal GCBM. Poiché i podociti hanno una limitata capacità di rigenerazione e compensazione funzionale, i restanti podociti non sono in grado di mantenere le funzioni di barriera meccanica e di carica del GCBM, che sarebbero irreversibilmente danneggiate, e il risultato finale è la proteinuria [13]. A seconda della gravità dell'insulto, il danno ai podociti potrebbe portare alla perdita dei processi del piede, alla formazione di vacuoli e pseudocisti, alla dedifferenziazione e all'apoptosi. Le strutture vicine sarebbero successivamente interessate, inclusa la proliferazione delle cellule epiteliali parietali, il restringimento del GCBM, la perdita del tufo capillare glomerulare e infine la glomerulosclerosi [14].

1.3. Metodo di revisione della letteratura

Abbiamo condotto una revisione della letteratura con termini di ricerca tra cui "podocita", "molecole associate ai podociti" o "biomarcatore", insieme a "cronicorenepatologia", "danno renale acuto", "glomerulonefrite", "nefropatia diabetica" o "diabeticorenepatologia", sono stati utilizzati per cercare la letteratura pertinente da Medline, Embase e Cochrane Library. I riferimenti di pubblicazioni pertinenti sono stati esaminati per ulteriori potenziali documenti. Gli studi ammissibili includevano studi sull'uomo e sugli animali pubblicati prima di luglio 2020. Pubblicazioni con argomenti irrilevanti, come la biologia cellulare dei podociti, La fisiologia della membrana e la manipolazione molecolare dei podociti sono state escluse.

1.4. Target specifici dei podociti come biomarcatori

La lesione dei podociti porta allo spargimento di varie molecole derivate dai podociti nello spazio urinario e può fungere da biomarcatore direnemalattie(Fig. 1). I corpi cellulari dei podociti potrebbero essere divisi in tre compartimenti anatomicamente e funzionalmente distinti: la parte di base, la parte superiore e la parte a diaframma scorrevole (SD) [15]. Specifiche proteine ​​della membrana cellulare sono presenti in ciascuna parte e la loro interazione con il sistema citoplasmatico del citoscheletro è responsabile della stabilità della struttura e della funzione dei podociti [16]. Le principali molecole derivate dai podociti che sono potenziali bersagli per lo sviluppo di biomarcatori sono riassunte nella Tabella 1.

Fig. 1. Lesione dei podociti e potenziali marcatori derivati ​​dai podociti nelle urine. La lesione ai podociti provoca 3 processi patologici correlati: cambiamento morfologico, apoptosi e distacco. I podociti possono rimanere vitali ma manifestarsi come cambiamenti morfologici che hanno conseguenze funzionali a valle, come proteinuria e fibrosi tubulo-interstiziale. L'apoptosi dei podociti può svilupparsi come risultato di cambiamenti morfologici cumulati o direttamente da insulti specifici. La perdita di podociti nei glomeruli (cioè podocitopenia) porta a cambiamenti architettonici nell'ansa capillare glomerulare e provoca glomerulosclerosi. I podociti, apoptotici o vitali a causa della perdita di 3 1 integrina, possono staccarsi nello spazio urinario, essere identificati nelle urine e fungere da marcatori direnepatologia. Vescicole, microparticelle o molecole specifiche dei podociti derivate da podociti feriti o apoptotici possono anche essere rilevate nelle urine e fungere da biomarcatori. (GCBM, membrana basale capillare glomerulare; AgII, angiotensina II; TGF-, fattore di crescita trasformante-beta; ROS, specie reattive dell'ossigeno).

1.5. Bersagli nucleari e citoplasmatici

Il gene oncosoppressore di Wilms{0}} (WT1) è un fattore di trascrizione simile a un dito di zinco nel nucleo del podocita ed è probabilmente il marker specifico del podocita più comunemente usato per lo studio istologico [17]. Il gene WT1 è costituito da 10 esoni, di cui gli esoni da 7 a 10 codificano i 4 dita di zinco del dominio di legame del DNA. WT1 è specificamente espresso nei podociti e probabilmente regola l'espressione della nefrina [18]. Mutazioni eterozigoti negli esoni 8 e 9 del gene WT1 portano alla sindrome di Denys-Drash, che si presenta con sindrome nefrosica, pseudoermafroditismo maschile e tumore di Wilms [19].

Altre proteine ​​nucleari e citoplasmatiche dei podociti sono meno studiate come biomarcatori. La chinasi contenente il dominio aarF-4 (ADCK4) è specificamente presente nei mitocondri all'interno dei processi del piede dei podociti di ratto [20]. L'ADCK4 è responsabile della stabilizzazione del complesso CoQ ed è necessario per la normale funzione dell'omeostasi dei podociti [20]. L'ablazione dell'ADCK4 specifica per i podociti nei topi provoca l'annullamento del processo del piede, la disorganizzazione della fessura di filtrazione, i mitocondri ingranditi e disfunzionali e la riduzione del CoQ10 [21] e il trattamento ripristina il CoQ10, la funzione mitocondriale, il miglioramento della morfologia dei podociti e l'annullamento del processo del piede prevenuto [21] ,22].

1.6. Complesso proteico a diaframma a fessura

I componenti proteici del diaframma a fessura del podocita sono stati ampiamente studiati come biomarcatori direnemalattie. Le principali proteine ​​di questo gruppo includono nefrina, podocina, proteina associata a CD2-(CD2AP) e podoplanina [23]. La nefrina è una proteina transmembrana con domini extracellulari che formano il nucleo del diaframma a fessura. Agisce sia come barriera fisica del setaccio che come scaffold di segnalazione [24]. Le mutazioni del gene della nefrina sono state la prima causa segnalata di sindrome nefrosica congenita nell'uomo [25]. Podocina e CD2AP sono responsabili del collegamento della nefrina al citoscheletro di actina sotto la membrana cellulare. La podocina è una proteina simile a una forcina della famiglia delle stomatine ed è espressa esclusivamente nei podociti [26]. È codificato dal gene NPHS2 che consiste di otto esoni e si trova nella regione del cromosoma 1q25-q31 [27]. Le mutazioni del gene NPHS2 causano una sindrome nefrosica autosomica recessiva resistente agli steroidi sia nei pazienti pediatrici che adulti [27,28]. CD2AP è una molecola di scaffolding che interagisce direttamente con l'actina filamentosa e altre proteine ​​della membrana cellulare ed è implicata nel rimodellamento dinamico dell'actina e nel traffico di membrana [29]. La podoplanina è una piccola glicoproteina transmembrana con un gran numero di catene O-glicosidici. La perdita selettiva di podoplanina nei podociti porta a proteinuria, seguita da alterazioni della morfologia dei podociti in un modello di ratto di proteinuria spontanea [30].

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1.7. Obiettivi collegati al GCBM

I principali componenti proteici della regione basale dei podociti sono l'integrina 3 1 e il -distroglicano (-DG). Queste proteine ​​ancorano i podociti al GCBM e svolgono un ruolo importante nel mantenimento della corretta posizione del podocita e nell'integrità della membrana di filtrazione [31,32]. L'integrina 3 1 è una proteina transmembrana con il dominio extracellulare legato al dominio G-simile alla laminina G (LG) della laminina 521 nel GCBM, mentre la sua regione citoplasmatica è collegata al citoscheletro del podocita dalla -actinina{{ 9}}. La proteina glicosilata -DG è collegata al citoscheletro tramite l'utrofina e al podocita e al GCBM attraverso la sua interazione con la laminina 521.

1.8. Bersagli sulla membrana superiore

Podocalyxin è la principale proteina transmembrana sul lato apicale del podocita. È una proteina dell'acido sialico a carica negativa che contribuisce alla barriera di carica della filtrazione glomerulare [33]. La podocalyxin ha tre funzioni: (1) impedire la fuoriuscita di proteine ​​caricate negativamente nelle urine; (2) mantenere la separazione dei podociti adiacenti; e (3) per prevenire l'adesione tra le cellule epiteliali e le anse capillari [34]. La podocalyxin è collegata al citoscheletro di actina da ezrin e dal fattore di regolazione dello scambiatore sodio-protone 2 (NHERF2).

1.9. Obiettivi correlati all'actina

Un certo numero di proteine ​​specifiche dei podociti sono legate al citoscheletro di actina e mantengono la 3-struttura dimensionale del podocita. I bersagli meglio studiati di questo gruppo sono sinaptopodina e -actinina-4. Entrambi si legano allo scheletro dell'actina interagendo con la guanilato chinasi associata alla membrana con orientamento invertito-1 (MAGI{7}}) [35]. La sinaptopodina è una proteina lineare ricca di prolina codificata dal gene SYNPO [36] ed è espressa nei podociti differenzianti quando sviluppano i processi del piede. Di conseguenza, la sinaptopodina è considerata un marker di podociti maturi [37].

2. Metodi di studio

2.1. Marcatori intraglomerulari dei podociti

Anche se il focus di questa recensione è suurinariopodocitamarcatori, è logico discutere brevemente il rilevamento di questi marcatori nel tessuto renale. L'esaurimento dei podociti può essere assoluto (perdita di podociti) o relativo (ridotto numero di podociti per volume di glomerulo) [38]. Il metodo gold standard per quantificare i podociti nei reni sono le metodologie stereologiche (microscopi ottici o elettronici, microscopi confocali a scansione laser, ultrasuoni, tomografia computerizzata o risonanza magnetica) [39]. Tuttavia, sono tutti dispendiosi in termini di tempo e lavoro. Recentemente, Venkatareddy et al. valutato il metodo per la stima della densità dei podociti mediante singole sezioni fissate in formalina incluse in paraffina, in cui i nuclei dei podociti sono stati visualizzati mediante immunofluorescenza indiretta con anticorpi contro WT1 o potenziatore di split simil-transducina [40]. Uno studio successivo ha mostrato che questo metodo ha fornito un'enumerazione accurata dei podociti in un modello murino transgenico di deplezione selettiva dei podociti, confermando che questo approccio fornisce uno strumento quantitativo efficiente per l'analisi della deplezione dei podociti nell'intero glomeruli [41]. Tuttavia, questo metodo richiede ancora una biopsia renale e quindi non è adatto per il monitoraggio seriale.

2.2. Quantificazione e coltura dei podociti urinari

Poiché i podociti sono fissati nella loro posizione fisiologica solo dai processi del piede, sono vulnerabili alla perdita come cellule vitali nelle urine [42]. Infatti, i podociti intatti sono rilevabili nelle urine di persone sane e pazienti conrenemalattie[43], e la perdita urinaria è probabilmente uno dei principali meccanismi di deplezione dei podociti durante la progressione dell'insufficienza renale cronica(Ccronicorenepatologia)[42]. Il metodo tradizionale per l'identificazione dei podociti nelle urine prevede tecniche di citospin e studio di immunofluorescenza con anticorpi specifici anti-podocalyxin [44], per i quali l'automazione è in parte fattibile. Tuttavia, la tecnica ha una sensibilità e specificità limitate a causa della contaminazione dei detriti cellulari nel sedimento urinario.

In alternativa, i podociti potrebbero essere identificati mediante la rilevazione di peptidi triptici specifici dei podociti con cromatografia liquida accoppiata con spettrometria di massa tandem (LC-MS/MS). Sebbene il costo dell'attrezzatura di questa tecnica sia elevato, presenta i vantaggi di essere indipendente dall'operatore e altamente riproducibile [45] e probabilmente avrà una crescente applicabilità nella pratica clinica di laboratorio.

Studi precedenti hanno dimostrato che con la tecnica dell'immunofluorescenza con citospin, le persone sane espellono meno di 0,5 podociti/mg di creatinina, mentre i pazienti con malattia glomerulare attiva espellono fino a 400 podociti/mg di creatinina [43]. La maggioranza diurinariopodocitisono vitali se testati con esclusione di ioduro di propidio e colorazione TUNEL [43]. In teoria, la coltura di podociti vitali ex vivo migliorerebbe quindi la specificità dell'identificazione dei podociti rimuovendo le cellule morte e non specifiche. Tuttavia, i podociti normalmente non proliferano in vivo e sono necessarie condizioni sperimentali speciali per la loro coltura ex vivo [46]. Rapporti precedenti hanno mostrato che i podociti potrebbero essere prima coltivati ​​in condizioni favorevoli alla crescita, dove i podociti immortalati si replicano [46]. Il terreno di coltura cellulare per questo scopo è generalmente costituito dal Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 o dal terreno Eagle's modificato di Dulbecco, con il 10% di siero bovino fetale integrato con 20-100 U/ml di interferone-gamma di topo (INF-) e il i piatti di coltura sono solitamente rivestiti con collagene di tipo I per promuovere la proliferazione dei podociti [46]. Questo metodo ha un grande valore nello studio traslazionale e nell'identificazione del target terapeutico, ma è troppo complicato per l'uso clinico di routine.

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2.3. Frammenti urinari derivati ​​da podociti

Le vescicole extracellulari (EV) sono corpi membranosi sferici rilasciati da vari tipi cellulari [47]. Nel sistema urinario, i veicoli elettrici contenenti membrana apicale e liquido intracellulare vengono eliminati da tutti i segmenti del nefrone, inclusi i podociti, le cellule epiteliali tubulari renali e le cellule uroepiteliali nelle urine. Gli EV urinari contengono marcatori proteici di disfunzione e danno strutturale del rene. Studi recenti suggeriscono inoltre che i veicoli elettrici possono essere rilevanti per la comunicazione intercellulare [48]. Inoltre, studi precedenti hanno anche dimostrato che frammenti di membrane cellulari apicali vengono rilasciati dai podociti feriti nelle urine [49] e potrebbero essere identificati come strutture granulari podocalyxin-positive (PPGS) mediante microscopia elettronica [49]. Nei modelli di topi diabetici, gli esosomi urinari dai podociti potrebbero essere isolati mediante centrifugazione seriale e le microparticelle potrebbero essere quantificate mediante citometria a flusso utilizzando l'anticorpo dell'annessina V (che rileva tutte le microparticelle), seguito dall'anticorpo contro la podocalyxin o la podoplanina (che identificano specificamente le microparticelle derivate dai podociti) [50,51]. L'ulteriore analisi della diffusione della luce potrebbe essere utilizzata per determinare ulteriormente la dimensione delle microparticelle [52]. Con queste sofisticate tecniche, è stato dimostrato che le microparticelle derivate dai podociti sono aumentate nei topi dopo l'esposizione a livelli elevati di glucosio [51], così come nei topi diabetici prima dell'inizio dell'albuminuria [52]. Nel primo caso, l'anomalia è stata soppressa da un inibitore della Rho-chinasi, indicando che la riorganizzazione del citoscheletro è il principale fattore scatenante del rilascio di microparticelle [51]. Tuttavia, l'applicazione di queste tecniche all'uomorenepatologianon è stato esplorato.

Piuttosto che misurare il numero e la dimensione degli EV e delle microparticelle derivati ​​dai podociti nelle urine, recentemente c'è un crescente interesse nella misurazione delle molecole specifiche dei podociti negli esosomi urinari. Ad esempio, i fattori di trasduzione del segnale derivati ​​dai podociti (PDSTF) negli EV urinari sono stati proposti come potenziali candidati per la valutazione delle lesioni dei podociti [52]. Tuttavia, le loro applicazioni cliniche rimangono in fase di sviluppo.

2.4. Bersagli proteici specifici dei podociti urinari

I livelli urinari di diversi target proteici specifici dei podociti sono facilmente misurabili e il loro ruolo come biomarcatori direnepatologiaè stato studiato. Il livello di podocalyxin urinario può essere misurato mediante immunofluorescenza indiretta, ELISA o citometria a flusso [53], ed è stato proposto come marker perurinariopodocitacontare. Tuttavia, uno studio precedente ha mostrato che la podocalyxin urinaria ha avuto origine principalmente dalla membrana apicale dei podociti feriti piuttosto che da quelli intatti triturati nelle urine e il suo livello è aumentato nel danno renale precoce [49]. La podocalixina e la nefrina, un altro importante bersaglio proteico specifico per i podociti nelle urine, non sono rilevabili nelle urine di persone sane mediante il tradizionale Western blotting [54] ma sono rilevabili mediante ELISA convenzionale nei pazienti con pre-eclampsia [55]. Inoltre, il livello di nefrina urinaria è correlato alla gravità della proteinuria [56] e alla funzionalità renale [57]. Si potrebbe anche misurare il livello di nefrina plasmatica [57], ma la sua rilevanza biologica o clinica non è stata determinata. Il problema principale dell'utilizzo dei livelli urinari di bersagli proteici specifici dei podociti come biomarcatore clinico è la bassa concentrazione (di solito nell'intervallo di ng/ml) e l'effetto confondente della concentrazione-diluizione dell'urina.

2.5. MRNA specifici per i podociti urinari

Misura diurinariopodocita-livello di mRNA specifico è stato proposto come metodo alternativo per la determinazione della conta dei podociti urinari. La quantità di mRNA specifico per i podociti nelle urine di solito non è sufficiente per il tradizionale studio del Northern blot, ma è prontamente misurata mediante reazione a catena della polimerasi quantitativa in tempo reale (RT-QPCR). Due studi precedenti hanno mostrato che i livelli di mRNA della nefrina urinaria avevano una stretta correlazione con la conta dei podociti urinari [56,58]. In un modello murino di malattia della membrana basale glomerulare con una biopsia renale seriale,urinariopodocita-livelli di mRNA specifici correlati con il tasso di perdita di podociti glomerulari [52].

Studi recenti, tuttavia, hanno spostato l'attenzione sugli indici di mRNA urinario derivati ​​come marcatori surrogati per lo stress dei podociti o la relativa lesione dei podociti. In un modello di ratto, la malattia glomerulare progressiva era associata a una diminuzione dei livelli di mRNA di nefrina rispetto ai livelli di mRNA di podocina e il rapporto mRNA di podocina-nefrina urinario era correlato alla gravità della progressione istologica [59]. In uno studio successivo, è stato dimostrato che la pressione arteriosa media di persone sane è correlata con il rapporto mRNA della podocina urinaria/creatinina (un marker del distacco dei podociti), il rapporto mRNA della podocina/nefrina (un marker dello stress dei podociti) e la podocina urinaria rapporto tra -a-acquaporina-2 mRNA (un marker di danno relativo ai podociti rispetto a danno tubulare) [60]. Il danno glomerulare è specificamente associato all'aumento del rapporto mRNA tra podocina e acquaporina-2 urinario e tra nefrina e acquaporina-2 [61].

2.6. Marcatori di miRNA urinari specifici per i podociti

I micro-RNA (miRNA) sono brevi RNA non codificanti che regolano molti percorsi biologici prendendo di mira specifici mRNA [62]. Simile all'mRNA, il miRNA urinario è prontamente quantificato mediante RT-qPCR [63]. Dal punto di vista dello sviluppo di biomarcatori, il miRNA ha il vantaggio di essere resistente alla degradazione, il che ne facilita l'uso clinico e lo studio di campioni d'archivio [63]. Sono stati osservati numerosi cambiamenti specifici del miRNArenemalattie[9]. Ad esempio, è stato riscontrato che la perdita di miRNA funzionali specifici per i podociti, inclusi miR-23b, miR-24 e miR-26a, provoca un rapido danno glomerulare e tubulare [64]. In particolare, miR-27b regola la sopravvivenza dei podociti mirando al recettore dell'adenosina 2B [65]. Allo stesso modo, è stato riportato che i livelli urinari di miR-21, miR-124 e miR-192 sono correlati alla gravità della disfunzione renale (albuminuria e GFR stimato) eurinariopodocitamarcatori (nefrina, sinaptopodina e podocalyxin) nei pazienti diabetici [66]. Studi recenti hanno ulteriormente identificato percorsi a valle specifici per diversi miRNA che possono essere rilevanti per la patogenesi o la progressione direnemalattie. In particolare, miR-193a sopprime l'espressione di WT- 1, che influisce sulla differenziazione dei podociti [67] e può svolgere un ruolo nella patogenesi della malattia glomerulare [68]. D'altra parte, miR-21 inibisce l'espressione dell'inibitore tissutale della metalloproteinasi 3 (TIMP3) [69,70], miR-26a inibisce il fattore di crescita trasformante beta-1 (TGF{{ 11}}) espressione [71,72], miR-23b mira a Ras proteina attivante la GTPasi SH3 proteina legante il dominio 2 (G3BP2) [73], miR-29c mira a Sprouty omologo 1 (Spry1 ) [74]; tutti coinvolti nella progressione della nefropatia diabetica.

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Tuttavia, il podocita contribuisce solo a una piccola parte del miRNA urinario. Qualsiasi alterazione specifica del miRNA osservata nei podociti potrebbe non essere facilmente distinguibile nelle urine, mentre qualsiasi alterazione dei livelli di miRNA urinario può riflettere il cambiamento patologico in altri tipi di cellule renali [75,76]. Ad esempio, sebbene i livelli urinari di miR-155, miR-663 e miR-1915 siano significativamente diversi tra i pazienti con FGS o nefropatia a cambiamento minimo (MCN) e controlli sani [77], non è stato dimostrato che miR-155, miR-663 o miR-1915 provengano specificamente dai podociti. Correlazioni significative tra molti livelli di miRNA e marker di danno tubulare, inclusi i livelli urinari di N-acetil{10}}D-glucosaminidasi (NAG) e molecola di danno renale-1 (KIM-1) [66], sono stati anche segnalati. In altre parole, è difficile confermare la loro specificità come marker di danno podocitario. La notevole eccezione a questa regola è miR-26a. Uno studio recente ha mostrato che i livelli di miR-26a urinario esosomico erano significativamente più alti nella nefrite da lupus rispetto al controllo sano, miR-26a era il miRNA più abbondantemente espresso nel glomerulo di topo C57BL/6 normale e miR-26a era responsabile della regolazione della differenziazione dei podociti e dell'integrità del citoscheletro [78]. Tuttavia, il ruolo del miR urinario-26a come marcatore specifico dei podociti deve essere convalidato.

2.7. Marcatori di podociti circolanti

Molti dei suddetti marcatori podociti, in particolare bersagli proteici specifici dei podociti e mRNA, potrebbero essere misurati nella circolazione sistemica [56,79,80] e i loro livelli plasmatici come biomarcatori direnemalattiesono stati esplorati [55,81–84]. Tuttavia, una discussione completa su questo argomento va oltre lo scopo di questa recensione. I principali vantaggi e svantaggi delle metodologie sopra menzionate sono riassunti nella Tabella 2.

3. Marcatori dei podociti urinari in specifiche malattie renali

3.1. Malattia renale diabetica

Diabeticorenepatologia(DKD) è la causa più comune di CKD(Ccronicorenepatologia)in tutto il mondo, e c'è una ricchezza di letteratura sull'uso di variurinariopodocitamarcatori per la diagnosi e il monitoraggio di DKD. Ad esempio, Jim et al [14] hanno riportato che i livelli di nefrina urinaria erano rilevabili in tutti i pazienti con DKD con albuminuria, ma solo nel 54% in quelli senza albuminuria. I livelli di nefrina urinaria erano correlati con il livello di albuminuria e inversamente con la funzione renale [14]. Ma et al hanno riportato che il livello urinario simile all'angiopoietina-4 (Angptl4) era aumentato in DKD [85]. Il livello di podocalyxin urinario era aumentato nei pazienti diabetici prima dell'inizio della microalbuminuria ed era probabilmente più sensibile della microalbuminuria per la diagnosi precoce di DKD [86]. Nella DKD accertata, il livello di podocalyxin nelle urine era correlato positivamente con il livello di HbA1c e il rapporto albumina/creatinina [87,88]. Presi insieme, i risultati disponibili indicano che i livelli urinari di diversi target specifici dei podociti sono indicatori precoci di DKD e il livello di podocalyxin urinario è il marker più promettente a questo proposito [54].

Sono stati anche esplorati i livelli del target specifico del podocita nei singoli componenti dell'urina.Urinariopodocitai livelli di microparticelle, come determinato dalla citometria a flusso, erano più alti nel diabete di tipo 1 rispetto ai controlli sani e il livello aumentava ulteriormente con il clamp iperglicemico [89]. I livelli esosomiali urinari di WT-1 erano correlati alla gravità della proteinuria, alla funzionalità renale, al danno glomerulare e al tasso di declino della funzionalità renale nei pazienti diabetici [58,90]. In un altro studio, i livelli di glicogeno sintasi chinasi (GSK)3 nelle cellule esfoliate urinarie erano più accurati dell'albuminuria nel discriminare i pazienti diabetici con e senza insufficienza renale progressiva [91]. Tuttavia, la metodologia di questo test è ingombrante e potrebbe non essere applicabile alla pratica clinica di routine.

Per quanto riguarda i marcatori di mRNA specifici dei podociti nelle urine, uno studio precedente ha mostrato che i livelli di mRNA urinario di nefrina, podocina, sinaptopodina, WT-1 e -actina-4 erano più elevati nei pazienti con DKD rispetto ai controlli normali [92]. C'era una differenza significativa nei livelli di mRNA urinario di nefrina, podocina, -actinina-4 e proteine ​​associate a CD2- nei pazienti diabetici con vari livelli di albuminuria [93]. Anche i livelli di mRNA urinario di nefrina, podocina, sinaptopodina, WT-1 e -actina-4 erano correlati conurinariopodocitaconta, livello di nefrina urinaria, albuminuria e gravità dell'insufficienza renale [93]. Più recentemente, è stato riscontrato che i livelli di mRNA specifici dei podociti urinari precedono l'insorgenza di microalbuminuria nei pazienti con diabete di tipo 2 [94] e il rapporto mRNA-creatinina della podocina urinaria, un marker di distacco dei podociti, è significativamente correlato con il successivo tasso di declino della funzionalità renale [94]. Inoltre, il livello di mRNA della sinaptopodina urinaria era inferiore dopo 12 settimane di terapia combinata con inibitore dell'enzima di conversione dell'angiotensina (ACE) e bloccante del recettore dell'angiotensina (ARB) rispetto alla monoterapia con ACE-inibitore [95]. Nel loro insieme, le prove disponibili suggeriscono che la misurazione dei livelli di mRNA specifici dei podociti nelle urine può essere preziosa per la stratificazione del rischio e il monitoraggio della risposta terapeutica nella DKD.

3.2. Minimo cambiamento nella nefropatia e nella glomerulosclerosi focale

MCN e FGS sono spesso considerate malattie dei podociti e il ruolo diurinariopodocitaobiettivi è stato testato. Zhou et al. [96] hanno riportato che il livello urinario esosomico di WT-1, misurato mediante la tecnica di immunoblotting, era significativamente più alto nei pazienti con FGS rispetto a quelli con sindrome nefrosica sensibile agli steroidi (SSNS) o nei volontari sani. I livelli urinari esosomiali di WT-1 sono diminuiti significativamente dopo il trattamento con corticosteroidi e la remissione di FGS o SSNS [96]. In un altro studio, il livello di nefrina urinaria, misurato con un test ELISA convenzionale, era significativamente più alto negli adulti con FGS rispetto ad altre cause di sindrome nefrosica [97].

Sono stati studiati anche i livelli urinari di mRNA specifico per i podociti. Uno studio iniziale ha mostrato che i livelli urinari di nefrina e podocina mRNA non erano significativamente diversi tra i pazienti con MCN e volontari sani, e i loro livelli erano significativamente inferiori rispetto ai pazienti con DKD [98]. Uno studio successivo ha mostrato che i livelli di mRNA di nefrina e podocina urinari erano più bassi nei pazienti con MCN rispetto a FGS o controlli sani e l'entità della riduzione era correlata al grado di proteinuria [99]. In questo studio, è stato riscontrato che i livelli di mRNA della sinaptopodina urinaria sono correlati al successivo tasso di declino della funzione renale nei pazienti con FGS [99], suggerendo che un'alterazione qualitativa nei podociti FGS potrebbe essere identificata nelle urine.

3.3. Nefropatia membranosa

Sebbene la principale alterazione patologica della nefropatia membranosa (MGN) sia la deposizione di un immunocomplesso nello spazio subepiteliale, che si traduce nell'alterazione della barriera di filtrazione glomerulare, studi suurinariopodocitai marcatori in MGN sono scarsi. I livelli di mRNA del sedimento urinario di nefrina, podocina e sinaptopodina erano significativamente elevati in MGN, ma i livelli differenziavano MGN in modo affidabile da altre cause di sindrome nefrosica [98]. Più recentemente, Lu et al [100] hanno riportato che il numero diurinariopodocita-le microparticelle derivate sono diminuite contemporaneamente al miglioramento dei parametri clinici dopo la terapia immunosoppressiva, suggerendo un ruolo nel monitoraggio della MGN.

3.4. Nefropatia da IgA

Sebbene la nefropatia da immunoglobulina A (IgAN) sia principalmente una malattia mesangiale, il ruolo diurinariopodocitacontare come biomarcatore è stato esplorato. In particolare, Shen et al [101] hanno scoperto che i pazienti con IgAN presentavano un aumento della perdita di podociti urinari, un minor numero di podociti nei glomeruli e una fusione più grave del processo del piede nei campioni bioptici renali. In questo studio, il podocita urinario è stato identificato mediante uno studio di immunofluorescenza indiretta della podocalyxin e ilurinariopodocitaconta correlata con creatinina sierica e proteinuria [101]. Uno studio successivo ha mostrato che il numero di podociti urinari nei pazienti con IgAN con sclerosi segmentale era maggiore rispetto a quelli senza sclerosi segmentale [102]. Nei bambini con nefrite porpora in linea IgAN o Henoch-Sch¨, Hara et al [103] hanno mostrato che la perdita cumulativa di podociti nelle urine era correlata alla gravità del danno istologico e al grado di glomerulosclerosi nella biopsia renale e nei pazienti conurinariopodocital'escrezione ha avuto una rapida progressione istologica.

Gli studi sulle molecole podocita-specifiche nelle urine come biomarcatori di IgAN sono frammentati e incompleti. Il livello di podocalyxin urinario era significativamente correlato con la gravità delle lesioni extra capillari acute nelle IgAN adulte [102]. È stato riportato che il livello di mRNA della podocina urinaria riflette la gravità del danno glomerulare attivo nella biopsia renale e fornisce informazioni prognostiche complementari al livello di proteinuria [104]. Poiché l'IgAN è la glomerulonefrite primaria più comune al mondo, sono sicuramente necessari ulteriori studi in quest'area.

Oltre a IgAN, il ruolo diurinariopodocitamarcatori è stato esplorato in altre glomerulopatie mesangiali. Per esempio,urinariopodocitala perdita è notevolmente aumentata sia nelle forme ereditarie che in quelle acquisite di sclerosi mesangiale diffusa [102]. Tuttavia, quest'area è meno studiata, probabilmente a causa dell'eterogeneità nella sua classificazione patologica.

3.5. Lupus nefrite

Urinariopodocitaè stato studiato lo spargimento nella nefrite da lupus. Un precedente rapporto ha mostrato che il maggiore diurinariopodocitinei pazienti con lupus nefrite attiva erano vitali ma dedifferenziati e la proporzione di podociti apoptotici nelle urine era significativamente inferiore a quella dei controlli sani [105]. In questo studio, i livelli urinari di podocalyxin, synaptopodin, podocin, nephrin e WT-1 (misurati dal western blotting) erano significativamente aumentati nel lupus sistemico, specialmente nella nefrite lupica attiva, e i loro livelli erano significativamente correlati con la gravità della proteinuria e attività istologica [105]. Uno studio successivo ha inoltre riportato che i livelli di mRNA urinario di nefrina, podocina e sinaptopodina erano significativamente più alti nei pazienti con nefrite lupica attiva rispetto a quelli con lupus quiescente [106]. In particolare, il livello di mRNA della nefrina urinaria era correlato alla proteinuria e all'attività della malattia sistemica, ma non alla classe istologica della nefrite da lupus, mentre il livello di mRNA della podocina urinario era un predittore indipendente del successivo declino della funzione renale [107].

3.6. Vasculite associata agli anticorpi anti-citoplasma dei neutrofili (ANCA).

Sebbene i podociti non siano l'obiettivo principale del danno renale nella glomerulonefrite ANCA-associata, la densità dei podociti intra-glomerulari è caratteristicamente ridotta [108]. Zou et al [108] hanno scoperto che il tasso di distacco dei podociti dalle urine predice la successiva perdita della funzione renale nella glomerulonefrite ANCA-associata e Minakawa et al [109] hanno riportato che il rapporto mRNA della podocina urinaria rispetto alla nefrina, un marker surrogato del podocita intraglomerulare stress, correlato con la percentuale di formazione a mezzaluna [109]. In quest'ultimo studio, i pazienti con livelli elevati diurinariopodocita-l'mRNA derivato ha avuto un esito renale favorevole, presumibilmente a causa della migliore riserva di podociti glomerulari e del potenziale di reversibilità [109].

3.7. Altro insufficienza renale cronica

L'utilità diurinariopodocitamarcatori in particolarerenemalattieè riassunto nella Tabella 3. Un certo numero di marcatori specifici dei podociti nelle urine sono stati anche esplorati come marcatori generici di CKD(Ccronicorenepatologia). Per esempio,urinariopodocita-le microvescicole extracellulari derivate, come quantificate dalla citometria a flusso, erano significativamente aumentate nei pazienti ipertesi con funzionalità renale compromessa rispetto a quelli senza compromissione renale [110]. Il livello di sinaptopodina urinaria, come determinato dal Western blotting, era correlato alla funzione renale sia nella CKD diabetica che non diabetica(Ccronicorenepatologia), indipendentemente dal grado di albuminuria, suggerendo che la sinaptopodina urinaria è un marker generico di danno podocitario [110]. Tra un pannello di bersagli mRNA urinari specifici dei podociti, il livello di mRNA del fattore neurotrofico cerebrale (BDNF) ha mostrato la migliore correlazione con la molecola di danno renale urinario-1 (KIM-1), che è un marcatore generico di danno renale [111]. Per i bersagli di miRNA, i livelli di miR esosomico urinario-21 sono stati aumentati in modelli animali di danno podocitario e di insufficienza renale cronica(Ccronicorenepatologia)pazienti [112], ma in questo studio non è stata determinata l'origine cellulare di miR-21.

Tuttavia, è importante notare che non tuttirenemalattieavere una lesione podocitaria. Un aumento inurinariopodocitala perdita è stata segnalata in varie malattie glomerulari ma non nella policistica autosomica dominanterenepatologia(ADPKD) [113]. Ancora più importante, l'associazione tra podocituria e proteinuria variava notevolmente tra le diverse malattie glomerulari, suggerendo cheurinariopodocitai marcatori dovrebbero essere considerati meglio come specifici della malattia [113].

4. Conclusione

La lesione dei podociti gioca un ruolo importante nella patogenesi e nella progressione di moltirenemalattie. I frammenti cellulari derivati ​​dai podociti e i bersagli molecolari specifici dei podociti nelle urine hanno un grande potenziale per essere sviluppati come biomarcatori per la diagnosi e il monitoraggio direnemalattie. Il processo di sviluppo dei biomarcatori comprende l'identificazione di marcatori specifici, la determinazione della metodologia di misurazione e la decisione sul contesto clinico per l'applicazione (Fig. 2). Con il progresso nella nostra comprensione della biologia dei podociti e la disponibilità di nuove tecnologie,urinariopodocitaci si aspetta che i marcatori abbiano un campo di applicazione in espansione, sia per l'identificazione di nuovi target sia per lo sviluppo di nuovi metodi per la loro quantificazione. In cambio, la convalida dei marcatori dei podociti urinari può far luce sulla nostra comprensione della fisiopatologia delrenemalattie. Esiste una vasta gamma di metodi per la quantificazione dei podociti e di vari marcatori specifici dei podociti nelle urine. Nel prossimo decennio, gli sforzi di ricerca dovrebbero concentrarsi sulla standardizzazione, il confronto e l'automazione dei metodi di laboratorio, nonché sulla definizione del loro valore aggiunto ai test clinici di routine.

Fig. 2. Aspetti da considerare per lo sviluppo di biomarcatori correlati ai podociti urinari perrenemalattie. (GCBM, membrana basale capillare glomerulare; CKD,cronicorenepatologia; DKD, diabeticorenepatologia; FGS, glomerulosclerosi focale).

Dichiarazione di interesse concorrente

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti o rapporti personali noti che avrebbero potuto sembrare influenzare il lavoro riportato in questo articolo.

Riconoscimento

Questo studio è stato sostenuto dal PD Research Fund della Richard Yu Chinese University of Hong Kong (CUHK) e dai conti di ricerca CUHK 6905134 e 8601286. I finanziatori non hanno avuto alcun ruolo nella progettazione dello studio, nella raccolta e nell'analisi dei dati, nella decisione di pubblicare o nella preparazione del manoscritto. Gli autori non dichiarano altri conflitti di interesse. I risultati presentati in questo documento non sono stati pubblicati in precedenza in tutto o in parte.

Migliora le malattie renali--Cistanche acteoside

Da: 'Marcatori di podociti urinari inrenemalattie' diLingfeng Zeng, et al

---Clinica Chimica Acta 523 (2021) 315–324