Qual è la differenza tra Cistanche coltivata selvaggiamente e Cistanche coltivata artificialmente sull'attività di miglioramento dell'immunità

Contatto: Audrey Huaudrey.hu@wecistanche.com

Zhao Bing; Yang Xiumei; Wu Daocheng; Ba Xueli; Li Quanxiao; Tan Yachao; Zhang Ailian

Astratto:

Obiettivo:Confrontare gli effetti di potenziamento immunitario della cistanche a crescita spontanea e dei polisaccaridi di cistanche coltivati artificialmente da cistanche (di seguito: WCDPS e CCDPS rispettivamente).

Metodi:Dosi diverse (basse, medie e alte) di WCDPS e CCDPS e ovalbumina (OVA) sono state immunizzate per via sottocutanea con topi ICR, anticorpo specifico per OAV IgG e sottotipi di anticorpi IgGl e IgG2a sono stati rilevati da ELISA e con metodo MTT. Attività di proliferazione dei linfociti OAV-specifici, citometria a flusso per rilevare il livello di espressione delle cellule T CD4 + e delle cellule T CD8 + T.

Risultati:Sia WCDPS che CCDPS possono aumentare significativamente i livelli di espressione dell'anticorpo specifico per oAV IgG e la tipizzazione anticorpale IgG1 e IgG2a (P<0.05), and="" there="" is="" no="" statistically="" significant="" difference="" between="" the="" same="" doses="" of="" wcdps="" and="" ccdps="" (f="">0. 05); WCDPS e CCDPS possono promuovere significativamente la proliferazione dei linfociti OAV-specifici e la differenza tra la stessa dose non è statisticamente significativa (P> 0,05); WCDPS e CCDPS possono anche aumentare significativamente la percentuale di sottocontenuto delle celle CD4+T e CD8+T (P<0.05), and="" the="" difference="" between="" the="" same="" dose="" was="" not="" statistically="" significant="" (p="">0,05), WCDPS e CCDPS non hanno avuto alcun effetto sul peso dei topi immunizzati.

Conclusione:Sia WCDSP che CCDPS possono migliorare significativamente le risposte immunitarie umorali e cellulari specifiche dell'OAV e non vi è alcuna differenza statisticamente significativa tra i due e hanno una buona sicurezza.

Parole chiave: cistanche; polisaccaridi da cistanche; ovoalbumina; adiuvante

Cistanche (C. deserticola. YC Ma),conosciuta anche come Cunyun e Dayun, è una pianta erbacea parassitaria delle Lydanaceae per molti anni. È un materiale medicinale cinese raro e prezioso. I suoi ingredienti principali includono polisaccaridi di cistanche, composti glicosidi feniletanoidi di Cistanche, acidi organici, alcaloidi, ecc.(4), hanno molteplici funzioni come nutrire l'essenza e il sangue, assistere lo yang e tonificare il rene e alleviare l'invecchiamento(5). A causa dell'altissimo valore medicinale della cistanche, lo sfruttamento eccessivo delle specie selvatiche è sull'orlo dell'estinzione e la cistanche coltivata artificialmente ha avuto successo. I ricercatori in patria e all'estero hanno fatto molte ricerche sui componenti chimici e sui principi attivi della cistanche a crescita selvatica e della cistanche coltivata artificialmente, ma ci sono pochi rapporti sul confronto tra polisaccaridi di cistanche selvatici e coltivati dall'attività adiuvante della cistanche (WCDPS / CCDPS). Un gran numero di studi hanno dimostrato che i polisaccaridi vegetali di cistanche come coadiuvante possono regolare la risposta immunitaria del corpo. Molti ricercatori hanno usato la fitoterapia cinese come coadiuvante vaccinale e hanno fatto buoni progressi".

Questo studio si basa sulla ricerca precedente (6) per confrontare ilimmuno-potenzianteattività di Xinjiang WCDPS e CCDPS. Principalmente attraverso esperimenti di immunizzazione sui topi, diverse dosi di WCDPS e CCDPS sono state immunizzate per via sottocutanea con OAV nei topi ICR e i loro effetti sul livello umoraleImmunitàe l'immunità cellulare indotta dall'OAV dopo l'immunizzazione sono stati testati. Confrontarecistanche selvaticheecistanche coltivate artificialmentepolisaccaridi L'attività immuno-potenziante dei polisaccaridi negli agrumi può fornire un riferimento per il migliore sviluppo e utilizzo della cistanche coltivata artificialmente nello Xinjiang.

Materiali e Metodo

Materiali sperimentali:

Cistanche coltivate selvaggiamente e cistanche coltivate (disponibili in commercio). Il terreno di coltura RPMI 1640 è stato acquistato da GIBCO; Il siero bovino fetale è stato acquistato da Israel Bioind; Anticorpi citometria a flusso: PE rat-anti mouse CD3, APC rat-anti mouse CD4, FITC rat-anti mouse CD8a sono stati acquistati dalla società americana BD, il prodotto Sigma Protein (Ovalbumin, OVA) Sigma, il prodotto anti-topo di capra marcato con perossido di rafano, IgGl e IgG2a sono stati acquistati da Southbiotech, USA. Gli altri reagenti chimici sperimentali sono tutti reagenti analitici domestici.

Animali da esperimento:

Topi ICR femmina di grado pulito (6-8 settimane, 18-22 g) sono stati acquistati dal Centro sperimentale per animali dell'Università di Medicina dello Xinjiang. Gli animali sono stati tenuti nella stanza degli animali del nostro laboratorio e l'esperimento è stato avviato 7 giorni dopo che gli animali sono stati acclimatati.

Preparazione di WCDPS e CCDPS:

Il riferimento [17] utilizza il metodo di estrazione dell'acqua e di precipitazione dell'alcol. I brevi passaggi sono i seguenti: Prendi la polvere di cistanche secca coltivata e selvatica dello Xinjiang, aggiungi 10 volte il volume di vaselina ed etanolo assoluto agli ultrasuoni per 1 ora; dopo la filtrazione di aspirazione, trattenere il residuo del medicinale e asciugare, aggiungere 10 volte il volume di acqua distillata 37T Ultrasuoni due volte, centrifugazione a 4 000 r / min per 10 minuti, combinare i supernatanti, evaporare e concentrare rotativamente e precipitare durante la notte con alcool; dopo la filtrazione sotto vuoto e l'essiccazione, si ottiene la polvere di estratto grezzo; Il metodo Savage (8) rimuove le proteine da WCDPS e CCDPS. Il contenuto di polisaccaridi da cistanche in WCDPS e CCDPS determinato con il metodo dell'acido solforico della cipolla era rispettivamente del 76,82% e del 59,58%.

Immunizzazione del topo e raccolta del siero:

I topi femmina ICR di 6-8 settimane sono stati usati come modelli animali sperimentali. L'esperimento è stato diviso in 9 gruppi, 5 in ogni gruppo: 0,9% NaCl, OVA 10 jig, OVA-Alum 200 |jLg, OVA-WCDPS 10 |xg, OVA -WCDPS 50 |xg, OVA-WCDPS 100 net, OVA-CCDPS 10 |jLg, OVA-CCDPS 50 |xg, OVA-CCDPS 100 net. Sciogliere con lo 0,9% di NaCl prima dell'immunizzazione e immunizzare i topi per via sottocutanea due volte con un intervallo di 2 settimane. Il sangue viene raccolto prima dell'immunizzazione e il siero-80Y viene preparato e conservato per un uso successivo.

Gli effetti di WCDPS e CCDPS sulla crescita dei topi:

Per osservare gli effetti di WCDPS e CCDPS sulla crescita dei topi, i pesi dei topi in ciascun gruppo sono stati pesati a 0 d prima dell'immunizzazione iniziale, 14 d e 21 d dopo l'immunizzazione.

Rilevamento di anticorpi sierici di topo IgG e tipizzazione dopo immunizzazione WCDPS e CCDPS:

Il metodo ELISA indiretto è stato utilizzato per determinare gli anticorpi sierici. Rivestito la piastra ELISA con 2,5 jig/ml OVA, 4Y durante la notte; lavato con PBST 3 volte e poi aggiunto il 5% di latte non grasso in polvere 37L per il blocco per 1 ora; lavato 3 volte con PBST e aggiunto l'anticorpo primario ai topi dopo l'immunizzazione in ciascun gruppo Siero, il rapporto di diluizione degli anticorpi primari è 1: 100, 100 pillola per pozzetto, 37Tl h; dopo il lavaggio 3 volte con PBST, aggiungere anticorpi secondari: capra anti-topo IgG, IgGl, IgG2a (l: 5 000) etichettato con HRP 37 Incubare il drago per 1 ora; dopo il lavaggio 4 volte con PBST, aggiungere la soluzione di substrato di tetrametilbenzidina (TMB) per evitare la luce per 15 minuti. Aggiungere 50 a ciascun pozzetto per interrompere la reazione con 2 mol/L H2SO4 e misurare il valore A45O/655. Confronta i livelli di anticorpi in ciascun gruppo.

Rilevazione della proliferazione dei linfociti splenici di topo dopo immunizzazione WCDPS e CCDPS:

Il metodo MTT è stato utilizzato per rilevare la proliferazione dei linfociti nella milza di topi immunizzati con CCDPS e WCDPS. La milza dei topi è stata isolata in condizioni asettiche 21 giorni dopo l'immunizzazione iniziale e le cellule della milza sono state diluite con il 10% di terreno RPMI 1640 contenente FBS per rendere le singole cellule Sospensione, conteggio e regolazione delle cellule (r cellule / ml si diffondono in una piastra di coltura cellulare a 96 pozzetti, aggiungere 20 OAV (concentrazione finale 10 |xg / ml) e ConA (concentrazione finale 5 maiale / ml) rispettivamente Stimolare, impostare un controllo a celle vuote e un controllo a siero vuoto allo stesso tempo, metterlo in un incubatore di cellule a 37 anni per 48 ore, aggiungere 20 MTT a ciascun pozzetto, 37 ^ e continuare a incubare per 4 ore, aggiungere 100|±1 DMSO a ciascun pozzetto per sciogliere e testare il cuore 0/63。 Valore, calcolare l'indice di stimolazione (SI) di ciascun gruppo di topi.

L'espressione di CD4 e CD8 sulle cellule T CD3+ dopo immunizzazione WCDPS e CCDPS:

La citometria a flusso è stata utilizzata per rilevare l'espressione delle cellule CD4+T e CD8*T sulla superficie delle cellule T CD3+. La milza di topo è stata isolata in condizioni asettiche 21 giorni dopo l'immunizzazione primaria e la milza è stata trattata con un mezzo RPMI 1640 contenente il 10% di FBS. Preparare una sospensione a singola cellula, contare e regolare il numero di cellule a 1x106 cellule/campione, eseguire la colorazione CD4 e CD8 sulla superficie delle cellule T CD3 +, proteggere dalla luce a temperatura ambiente per 25 minuti e utilizzare 10 ml di una soluzione tamponata con fosfato contenente lo 0,5% di FBS (soluzione tamponata con fosfato). soluzione salina, PBS) 1 200 r/min 7 min lavare una volta, aggiungere 250 |jil PBS, passare 200 mesh di rame mesh, citometria a flusso per rilevare l'espressione di CD4 e CD8 sulla superficie delle cellule CD3*T.

Metodi statistici:

Il software Flowjo 7.6 elabora i risultati dei test di citometria a flusso; GraphPad Prism 5.0 viene utilizzato per l'analisi dei dati e i dati sono tutti basati sulla deviazione media ± standard. Usa Student e test per confrontare i dati tra i gruppi sperimentali. P<0.05 means="" that="" there="" is="" a="" difference.="" statistical="">

Risultato

1. L'effetto di WCDPS e CCDPS sulla crescita dei topi: dopo la co-immunizzazione con WCDPS e CCDPS e OVA, pesare il peso dei topi (Tabella 1). Non c'è stata alcuna differenza statisticamente significativa nel peso corporeo dei topi in ciascun gruppo durante lo stesso periodo di crescita ( P>0.05).

2. L'effetto di WCDPS e CCDPS sull'anticorpo OAV-specifico IgG: WCDPS e CCDPS sono stati immunizzati per via sottocutanea con OAV per rilevare l'espressione dell'anticorpo specifico dell'OAV IgG nel siero dopo 14 giorni e 21 giorni di immunizzazione. I risultati sono mostrati in Figura 1, WCDPS e CCDPS hanno promosso l'espressione di anticorpi IgG nel siero in modo dose-dipendente; OVA+WCDPS 50 p,g rispetto a OVA+CCDPS 50 |xg può promuovere significativamente gli anticorpi OVA-specifici rispetto a OVA+CCDPS 50 |xg. L'espressione di IgG (F<0.05), but="" the="" difference="" was="" not="" statistically="" significant="" compared="" with="" the="" aluminum="" adjuvant="" group="" (p="">0.05); la differenza tra WCDPS e CCDPS alla stessa dose non era statisticamente significativa (P>0,05).

3. L'effetto di WCDPS e CCDPS sulla tipizzazione degli anticorpi specifici dell'OAV: 21 giorni dopo l'immunizzazione, è stata rilevata l'espressione di anticorpi OVA-specifici che tipizzano IgG1 e IgG2a nel siero. I risultati sono mostrati nella Figura 2. OVA-WCDPS 50 jig e OVA-WCDPS 100 |xg Mumu hanno promosso significativamente l'espressione dell'anticorpo IgG2a nel siero rispetto al solo gruppo OAV (P<0.05); both="" ova-wcdps="" 50="" and="" ova-ccdps="" 50="" pigs="" could="" significantly="" promote="" the="" expression="" of="" ova-specific="" antibody="" iggl=""><0. 001);="" compared="" with="" ova-wcdps="" 50="" p,g,="" and="" ova-wcdps="" 100="" jig,="" the="" aluminum="" adjuvant="" group="" can="" significantly="" promote="" the="" expression="" of="" antibody="" igg2a=""><0.05); the="" expression="" of="" antibody="" typing="" is="" different="" between="" wcdps="" and="" ccdps="" at="" the="" same="" dose="" no="" statistical="" significance="" (p="">0.05).

4. L'effetto di WCDPS e CCDPS sulla proliferazione dei linfociti OAV-specifici del topo: al fine di rilevare l'effetto di WCDPS e CCDPS sui linfociti splenici, i polisaccaridi da cistanche sono stati immunizzati per via sottocutanea con OAV e le cellule della milza sono state separate 21 giorni dopo l'immunizzazione e il metodo MTT è stato utilizzato per rilevarli Promuovere la proliferazione dei linfociti OAV-specifici. I risultati sono mostrati nella Figura 3. WCDPS e CCDPS hanno migliorato la proliferazione dei linfociti OAV-specifici in modo dose-dipendente. La combinazione di WCDPS e CCDPS con il gruppo OAV può promuovere significativamente la proliferazione dei linfociti OVA-specifici rispetto al solo gruppo OAV. Proliferazione dei linfociti (P<0.05); ova-wcdps="" 50="" jig="" and="" ova-ccdps="" 50="" |xg="" compared="" with="" an="" aluminum="" adjuvant="" group="" can="" significantly="" promote="" ova-specific="" lymphocyte="" proliferation=""><0.05); the="" same="" dose="" of="" wcdps="" there="" was="" no="" statistically="" significant="" difference="" between="" ccdps="" and="" ccdps="" (p="">0.05).

5. L'effetto di WCDPS e CCDPS sulle cellule T CD3+ CD4+ T e CD3+ CD8+: 21 giorni dopo che WCDPS e CCDPS sono stati immunizzati per via sottocutanea con OAV, l'espressione di CD4 e CD8 nelle cellule T CD3+ è stata rilevata mediante citometria a flusso, come mostrato nella Figura 4A È dimostrato che OVA-WCDPS 50, OVA-CCDPS 50 jig e OVA-WCDPS 100 possono promuovere significativamente la proliferazione delle cellule T CD3+CD4+ (P<0.05); as="" shown="" in="" figure="" 4b,="" ova-wcdps="" 10="" a,="" ova-wcdps="" 50="" zhao="" significantly="" promotes="" the="" proliferation="" of="" cd3+cd8+="" t="" cells=""><0.05), ova-wcdps="" 100="" |xg,="" ova-ccdps="" 100="" significantly="" promotes="" the="" proliferation="" of="" cd3+cd8+="" t="" cells=""><0.01); but="" the="" same="" dose="" there="" was="" no="" significant="" difference="" between="" wcdps="" and="" ccdps="" (p="">0.05); non vi era alcuna differenza significativa tra WCDPS e CCDPS e OVA rispetto a un gruppo adiuvante in alluminio (P>0,05).

Discussione

Numerosi studi hanno dimostrato che la fitoterapia cinese ha funzione immunomodulatoria "Da", e ci sono anche un gran numero di rapporti che dimostrano che i polisaccaridi della medicina erboristica cinese da cistanche possono essere usati come coadiuvante per migliorare l'effetto immunitario dei vaccini"3], e la carne del deserto dello Xinjiang di Congrong selezionata in questo studio è un materiale medicinale unico nello Xinjiang, e le specie selvatiche sono sull'orlo dell'estinzione, combinate con il loro più alto valore medicinale, coltivare specie coltivate è particolarmente importante per lo sviluppo e l'utilizzo delle risorse vegetali medicinali. I nuovi vaccini sul mercato attuale hanno una buona specificità dell'antigene, ma una scarsa immunogenicità. I polisaccaridi vegetali di cistanche possono compensare questa carenza. il mio paese ha un grande vantaggio nella ricerca della fitoterapia cinese. Esaminiamo gli adiuvanti vaccinali delle medicine naturali a base di erbe cinesi. Alta fattibilità. Gli studi hanno dimostrato che i polisaccaridi a base di erbe cinesi di cistanche hanno vari gradi di regolazione sull'immunità specifica e sull'immunità non specifica, come i polisaccaridi ganoderma di cistanche, i polisaccaridi Radixisatidis di cistanche, i polisaccaridi di Poria cocos di cistanche koji, i polisaccaridi di inulina di cistanche 27], ecc. Può migliorare l'effetto immunitario del vaccino.

A causa del rapido aumento della domanda di cistanche, le sue specie selvatiche sono state estratte e sono ora elencate come piante in via di estinzione e protette nel mio paese. Sulla base del successo della piantagione artificiale del deserto Caulis Carlsbad, le specie coltivate dovrebbero sostituire le specie selvatiche. In questo esperimento, cistanche coltivate in natura e polisaccaridi di cistanche coltivati artificialmente coltivati sono stati usati come coadiuvanti OAV per effettuare esperimenti di immunizzazione in vivo sui topi. Testando vari indicatori, è stato inizialmente valutato l'effetto immunitario della cistanche selvatica e coltivata, che ha fornito un riferimento per l'uso efficace della cistanche coltivata nello Xinjiang.

Al fine di comprendere la sicurezza delle cistanche coltivate spontaneamente e coltivate artificialmentecistanche saccaridida cistanche, esperimenti di immunizzazione animale in vivo hanno osservato le caratteristiche di aspetto dei topi e hanno scoperto che i topi non hanno diarrea, capelli eretti o lacrime dopo l'immunizzazione, e le loro attività e respirazione sono normali e non ci sono contrazioni muscolari. Non c'era alcuna differenza significativa nel peso corporeo dei topi in ciascun gruppo a causa del fenomeno del disturbo, indicando che l'immunizzazione WCDPS e CCDPS non ha influenzato la crescita dei topi e ha un certo grado di sicurezza. Le IgG anticorpali e i risultati dei test di tipizzazione mostrano: WCDPS e CCDPS possono aumentare significativamente l'espressione dell'anticorpo specifico OVA IgG dopo la co-immunizzazione con OVA e l'effetto è equivalente all'adiuvante di alluminio; può migliorare significativamente l'espressione di anticorpi OVA-specifici di tipo IgG2a e IgGl, Mostra che i polisaccaridi da cistanche migliorano la risposta immunitaria Th1 e Th2 allo stesso tempo, e non vi è alcuna differenza significativa tra WCDPS e CCDPS. I risultati della tipizzazione anticorpale IgG2a hanno rilevato che WCDPS e CCDPS e il gruppo di co-immunizzazione OVA possono migliorare significativamente l'espressione di IgG2a rispetto al gruppo adiuvante in alluminio, un adiuvante di alluminio è più debole nel promuovere l'espressione delle cellule T, il che dimostra che WCDPS e CCDPS sono usati come adiuvanti La capacità di promuovere l'immunità cellulare è significativamente superiore a quella degli adiuvanti di alluminio.

I risultati del rilevamento della proliferazione linfocitaria con il metodo MTT hanno mostrato che le cellule della milza dei topi in ciascun gruppo sono state stimolate dall'OAV. L'indice di stimolazione (SI) della proliferazione dei linfociti nel WCDPS e CCDPS combinato con l'OAV era significativamente superiore a quello nel solo gruppo di immunizzazione OAV. OVA- L'indice di stimolazione del gruppo jig WCDPS 50 Ah e OVA-CCDPS 50 era significativamente superiore a quello del gruppo adiuvante in alluminio; indica che WCDPS e CCDPS combinati con il gruppo OAV possono aumentare significativamente la proliferazione dei linfociti OAV-specifici rispetto al gruppo OAV e al gruppo adiuvante in alluminio.

Esistono diversi sottogruppi di linfociti T. CD3 è la molecola di superficie di tutti i linfociti T. Secondo diversi fenotipi, possono essere suddivisi in cellule T CD8 + e cellule T CD4. Le molecole CD4+ possono essere formate sotto l'azione delle molecole MHC fl, che vengono utilizzate principalmente come cellule helper (Th) dopo l'attivazione. Le molecole CD8+ devono essere formate sotto l'azione delle molecole MHC I. Dopo l'attivazione, diventano cellule killer (TC o CTL), che svolgono un ruolo importante nell'immunità contro le infezioni virali e l'immunità tumorale. 3". La citometria a flusso rileva l'espressione delle cellule CD3PD4+T e CD3+CD8+T, i risultati mostrano che WCDPS e CCDPS possono promuovere significativamente la proliferazione delle cellule CD4+T e CD8+T entro un certo intervallo di dose e non vi è alcuna differenza significativa tra WCDPS e CCDPS alla stessa dose. La combinazione di CCDPS e OVA può stimolare l'espressione di cellule CD3 + CD4 + T e CD3 + CD8 + T e i due effetti sono equivalenti.

In sintesi, WCDPS e CCDPS sono sicuri come coadiuvanti. Dopo essere stati immunizzati con oAV, possono contemporaneamente migliorare l'immunità umorale specifica e l'immunità cellulare. Rispetto agli adiuvanti in alluminio, WCDPS e CCDPS hanno effetti migliori sul potenziamento dell'immunità cellulare e non vi è alcuna differenza negli effetti di potenziamento dei due polisaccaridi da cistanche. Questi risultati della ricerca forniscono riferimenti materiali per i polisaccaridi cistanche coltivati artificialmente nello Xinjiang dalla cistanche come coadiuvanti e forniscono anche la base materiale per lo screening di adiuvanti immunitari sicuri ed efficienti dal deserto dello Xinjiangcistanche.

Referenze

[1] Zhao X, Sun W, Zhang S, et al. La risposta immunitaria adiuvante dei polisaccaridi di Atractylodis macrocephalus Koidz nei polli vaccinati contro la malattia di Newcastle (ND) [J]. Carbohydr Polym, 2016, 190-196. DOI: 10. 1016/j. carb pop. 2016. 01.033.

[2] Li J, Wang X, Wang W, et al. L'estratto di acqua di Pleurotus ferulate migliora la maturazione e la funzione delle cellule dendritiche derivate dal midollo osseo murino attraverso la via di segnalazione TLR4 [J]. Vaccino, 2015, 33(16) : 1923-1933. DOI: 10.1016/j. vaccine.2015.02. 063.

[3] Zhao H, Luo Y, Lu C, et al. La risposta immunitaria della mucosa enterica potrebbe innescare l'attività di immunomodulazione del polisaccaride Ganoderma nei topi. Planta Med, 2010, 76(3): 223-227. DOI: 10. 1055/S-0029-1186055.