La proteina non strutturale 4B del virus Zika interagisce con DHCR7 per facilitare l'infezione virale

ASTRATTO

Il virus Zika (ZIKV) evolve proteine ​​non strutturali per eludere la risposta immunitaria e garantire una replicazione efficiente nelle cellule ospiti. Recentemente è stato segnalato che l'enzima metabolico del colesterolo 7-deidrocolesterolo reduttasi (DHCR7) influisce sulle risposte immunitarie innate nell'infezione da ZIKV. Tuttavia, le proteine ​​non strutturali vitali e i meccanismi coinvolti nell'evasione virale mediata dal DHCR7- non sono ben chiariti. In questo studio, abbiamo dimostrato che l'infezione da ZIKV facilita l'espressione di DHCR7. In particolare, il DHCR7 sovraregolato a sua volta ha facilitato l’infezione da ZIKV e il blocco di DHCR7 ha soppresso l’infezione da ZIKV. Meccanicamente, la proteina non strutturale 4B (NS4B) di ZIKV ha interagito con DHCR7 per indurre l'espressione di DHCR7. Inoltre, DHCR7 ha inibito la fosforilazione della chinasi 1 legante il TANK (TBK1) e del fattore regolatore dell'interferone 3 (IRF3), che ha comportato la riduzione delle produzioni di interferone-beta (IFN-) e di geni stimolati dall'interferone (ISG). Pertanto, proponiamo che ZIKV NS4B si leghi a DHCR7 per reprimere l'attivazione di TBK1 e IRF3, che a sua volta inibisce IFN e ISG, facilitando così l'evasione di ZIKV. Questo studio amplia le conoscenze su come le proteine ​​virali non strutturali antagonizzano l’immunità innata per facilitare l’infezione virale tramite enzimi metabolici e intermedi del colesterolo.

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1. Introduzione

Essendo un flavivirus trasmesso dalle zanzare, il virus Zika (ZIKV) è stato inizialmente identificato dal macaco rhesus in Uganda nel 1947. Ha subito diverse epidemie in tutto il mondo, l'epidemia di ZIKV è diventata una minaccia cumulativa per la salute globale a causa dell'espansione esplosiva attraverso le rotte delle zanzare, i viaggi in tutto il mondo di trasportatori asintomatici e trasmissione sessuale. La maggior parte delle infezioni da ZIKV nelle epidemie passate erano asintomatiche o lievi (Wang et al., 2016), tuttavia, nelle ultime epidemie, l'infezione da ZIKV ha portato a malattie devastanti, comprese sequele neurologiche durante la gravidanza (microcefalia e morte fetale) e disturbi neurologici (sindrome di Guillain-Barre) negli adulti (Cao-Lormeau et al., 2016; Pierson e Diamond, 2020; Rasmussen et al., 2016). Il sistema immunitario innato è la prima e fondamentale linea di difesa immunitaria dell’ospite contro le infezioni virali. Dopo l’infezione da ZIKV, l’RNA virale è stato riconosciuto dal gene I inducibile dall’acido retinoico intracellulare (RIG-I) (Chazal et al., 2018; Hertzog et al., 2018; Kato et al., 2006), che ha avviato il sistema immunitario innato a valle risposte, inclusa l'attivazione della chinasi legante TANK 1 (TBK1), la fosforilazione del fattore regolatore dell'interferone 3 (IRF3) e quindi la produzione di interferoni di tipo I (IFN-I) (Fitzgerald et al., 2003; Grant et al., 2016); Xia et al., 2018) e l'espressione di dozzine di geni stimolati dall'interferone (ISG) con vari effetti antivirali (Savidis et al., 2016; Schneider et al., 2014). Il sistema immunitario ospite produce IFN e ISG per limitare l’infezione virale, tuttavia, lo stesso ZIKV ha sviluppato una varietà di meccanismi di fuga per garantire la sopravvivenza e la replicazione nella cellula ospite, come la codifica di specifiche proteine ​​non strutturali (NS). L'RNA genomico di ZIKV genera sette proteine ​​non strutturali, tra cui NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B e NS5 (Berthoux, 2020). ZIKV NS1 recluta la deubiquitinasi USP8 dell'ospite per stabilizzare la caspasi-1 e attenua la segnalazione dell'IFN di tipo I a beneficio dell'infezione da ZIKV (Zheng et al., 2018). È stato segnalato che un NS1 mutante si lega a TBK1 e diminuisce la fosforilazione di TBK1, portando a una ridotta produzione di IFN (Xia et al., 2018). ZIKV NS3 si lega e sequestra le proteine ​​dell'impalcatura umana (14-3-3ε e 14-3-3η) (Riedl et al., 2019), mentre NS4A interagisce con MAVS per attenuare RIG-I- e MDA{{50} }risposte immunitarie innate mediate (Ma et al., 2018). In particolare, ZIKV NS5 lega e degrada il trasduttore del segnale e l'attivatore della trascrizione 2 (STAT2) per attenuare la segnalazione dell'IFN di tipo I (Grant et al., 2016; Kumar et al., 2016). Inoltre, è stato anche dimostrato che NS5 interagisce con RIG-I e sopprime la poliubiquitinazione legata al K63- di RIG-I, reprimendo così la produzione di IFN (Li et al., 2020). Inoltre, è stato dimostrato che ZIKV NS2A, NS2B, NS4A e NS4B superano la produzione di IFN prendendo di mira elementi distinti nel percorso RIG-I (Xia et al., 2018). Per ottenere una replicazione efficiente nelle cellule dei mammiferi, il ZIKV fa affidamento anche sui componenti metabolici dei lipidi cellulari ospiti per formare un involucro e completare l’assemblaggio delle particelle virali (Chen et al., 2020; Leier et al., 2020). Il colesterolo è uno dei componenti lipidici delle membrane cellulari e partecipa a molteplici funzioni biologiche (Ikonen, 2008). L’omeostasi del colesterolo cellulare è strettamente modulata dalla sintesi del colesterolo, compreso l’assorbimento dalle particelle lipoproteiche e il rilascio agli accettori extracellulari. Praticamente tutte le cellule dei mammiferi dipendono dal metabolismo del colesterolo (Luo et al., 2020). Prove sempre più numerose hanno indicato che il metabolismo del colesterolo partecipa alla risposta immunitaria innata contro l’infezione virale (Blanc et al., 2013; Petersen et al., 2014; York et al., 2015). In seguito all'infezione virale, la sintesi del colesterolo è stata notevolmente modificata e accompagnata da una maggiore espressione di IFN-I e ISG nei macrofagi (Li et al., 2017; Liu et al., 2008; York et al., 2015). Essendo l'enzima chiave nel metabolismo del colesterolo, la colesterolo-25-idrossilasi (CH25H) converte il colesterolo in 25-idrossicolesterolo (25HC), che è stato identificato come il prodotto biologico che contribuisce a una risposta immunitaria innata contro la grande maggioranza dei soggetti di virus, incluso il virus dell'immunodeficienza umana 1 (HIV-1), il virus della stomatite vescicolare (VSV), il virus dell'herpes simplex 1 (HSV-1), il virus Ebola (EBOV), ZIKV, il virus dell'herpes gamma murino ( MHV68), virus della febbre della Rift Valley (RVFV) e virus dell'encefalite russa primaverile-estiva (RSSEV) (Blanc et al., 2013; Li et al., 2017; Liu et al., 2013). Gli studi attuali sono limitati nell'investigare come i prodotti metabolici del colesterolo (ad esempio 25HC) potrebbero manipolare la trasduzione del segnale e partecipare all'immunità innata. Ad oggi, gli enzimi o gli intermedi a monte della biosintesi del colesterolo non sono ancora ben chiariti. Essendo un enzima metabolico vitale del colesterolo, la 7-deidrocolesterolo reduttasi (DHCR7) potrebbe cancellare il doppio legame C (7–8) nell'anello B degli steroli e catalizzare il colesterolo dalla 7-deidrocolesterolo ({{100} }DHC) (Luu et al., 2015). 7-Il DHC è anche un precursore della vitamina D e le mutazioni di DHCR7 sono collegate a livelli più elevati di vitamina D, suggerendo che DHCR7 mostra effetti biologici complicati nella conversione del colesterolo e della vitamina D (Kuan et al., 2013; Prabhu et al. , 2016a). Uno studio ben presentato ha dimostrato che il silenzio di DHCR7 potrebbe attivare la via PI3K-AKT3, portando alla fosforilazione di IRF3 Ser385 e promuovere la produzione di IFN per inibire infezioni virali multiple in vitro e in vivo (Xiao et al., 2020). Tuttavia, la comprensione del metabolismo del colesterolo mediato dal DHCR7-nell'evasione immunitaria mediata dalla proteina ZIKV NS è scarsamente definita. Qui, chiariamo un meccanismo distinto con cui ZIKV NS4B prende di mira DHCR7, un enzima chiave nella sintesi del colesterolo, per attenuare la risposta IFN-I e facilitare l'infezione da ZIKV. Abbiamo scoperto che l'infezione da ZIKV aumenta l'espressione di DHCR7. È interessante notare che il DHCR7 potenziato promuove l'infezione da ZIKV, mentre abbattere o prendere di mira DHCR7 con inibitori può sopprimere l'infezione da ZIKV. Inoltre, ZIKV NS4B potrebbe legare DHCR7 e quindi indurre l'espressione di DHCR7, che inibisce l'attivazione di TBK1 e IRF3 e porta a una ridotta produzione di IFN e ISG. Pertanto, proponiamo che il legame di ZIKV NS4B a DHCR7 diminuisca l'attivazione di IRF3, che a sua volta inibisce IFN e ISG per facilitare l'evasione di ZIKV. Questo studio amplia nuove conoscenze su come la proteina non strutturale ZIKV abolisce l’immunità innata per facilitare l’infezione virale attraverso l’interazione con gli enzimi metabolici del colesterolo.

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2. Materiali e metodi

2.1. Linee cellulari

Le cellule U251 sono state acquistate dal China Center for Type Culture Collection (CCTCC) (Wuhan, Cina). Cellule di rene di Cercopithecus aethiops (Vero), cellule di rene embrionale umano (HEK 293T) e cellule di adenocarcinoma polmonare umano (A549) sono state acquistate dall'American Tissue Culture Collection (ATCC). Le cellule sono state mantenute in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (Gibco) integrato con il 10% di siero bovino fetale (FBS) (Gibco), penicillina (100 U/mL) e streptomicina solfato (100 ug/mL) a 37 C e 5 % CO2. Le cellule di Aedes albopictus (C6/36) sono state coltivate in terreno minimo essenziale (MEM) integrato con 10% FBS, penicillina (100 U/mL) e streptomicina solfato (100 ug/mL) a 28 C con 5% CO2.

2.2. Amplificazione, titolazione e infezione di ZIKV

L'isolato ZIKV z16006 (numero di accesso GenBank, KU955589.1) è stato coltivato in cellule C6/36 e ZIKV è stato aliquotato in fiale congelate e conservato a 80 C. I titoli ZIKV sono stati misurati mediante test su placca. Le cellule sono state infettate con ZIKV alla molteplicità di infezione (MOI) indicata per 2 ore, seguite da lavaggio con tampone fosfato salino (PBS), quindi coltivate, raccolte ed esaminate.

2.3. Plasmidi e reagenti

Il plasmide di espressione pcDNA3.1(þ)-3 Flag è stato utilizzato per clonare singoli geni ZIKV da frammenti corrispondenti del cDNA ZIKV. Per costruire pGEX6p-1-NS4B, ZIKV NS4B è stato sottoclonato nel vettore pGEX6p-1 utilizzando il kit di clonazione One Step ClonExpress II (Vazyme Biotech, Nanjing, Cina). I cDNA che codificano DHCR7, RIG-I, TBK1 e IRF3 umani clonati nel vettore pCAGGS-HA o nel vettore flag pcDNA3.1 (þ)-3 sono stati costruiti mediante il metodo di clonazione molecolare standard. La mutazione missenso G410S di DHCR7 è stata costruita utilizzando il metodo della mutagenesi sito-diretta. La busta anti-ZIKV di coniglio monoclonale (GTX133314) è stata acquistata da GeneTex (Irvine, CA, USA). Anti-DHCR7 policlonale di coniglio (A8049), anti-ISG15 monoclonale di coniglio (A2416), anti-TBK1 monoclonale di coniglio (A3458), anti-P-TBK1 monoclonale di coniglio a Ser172 (AP1026), anti-IRF3 policlonale di coniglio (A11118), anti -IgG di coniglio (ac005) e IgG anti-topo (ac011) sono stati acquistati da ABclonal Technology (Wuhan, Cina). Gli anticorpi secondari antitopo FITC e anti-coniglio Cy3 sono stati acquistati da Abbkine (Wuhan, Cina). L'anti-P-IRF3 monoclonale di coniglio a Ser396 (29047S) e l'anti-ISG56 monoclonale di coniglio (14769S) sono stati acquistati da Cell Signaling Technology (CST, Boston, MA, USA). L'anti-Flag monoclonale di topo (F3165), l'anti-HA monoclonale di coniglio (H6908) e l'anti-GAPDH monoclonale di topo (G9295) sono stati acquistati da Sigma (St Louis, MO, USA). L'anticorpo-anticorpo monoclonale del gruppo antiFlavivirus di topo (MAB10216) è stato acquistato da Millipore (Mass, USA). Lipofectamine 2000 (11668-027) e Trizol (15596018) sono stati acquistati da Invitrogen Corporation (Carlsbad, CA, USA). Poly (I: C) è stato acquistato da InvivoGen (San Diego, CA, USA).

2.4. Analisi della placca

Il surnatante contenente ZIKV è stato diluito con DMEM privo di siero e cellule Vero infette in una piastra a pozzetti 12- per 2 ore, seguito da lavaggio con 1 mL di PBS due volte. DMEM contenente il 2% di FBS e il 2% di agarosio a basso punto di fusione sono stati miscelati bene secondo un rapporto volumetrico 1:1 e a ciascun pozzetto è stata aggiunta 1 mL di miscela. Le cellule infette sono state coltivate a 37 C con il 5% di CO2 per 5-7 giorni. Le cellule sono state fissate con paraformaldeide al 4% per 1 ora e colorate con 0,5% cristalvioletto per 30 minuti. La piastra a pozzetti 12- è stata lavata con acqua e sono state calcolate le placche.

2.5. Produzione e infezione di lentivirus

Le sequenze target degli shRNA per il DHCR7 umano erano le seguenti: sh-DHCR7-1: 50 -ATTGCCAGCACAGACGGATTT-30, sh-DHCR7-2: 50 -CGTGATTGACTTCTTCTGGAA{ {8}}. Il vettore pLKO.1 contenente uno shRNA codificato per un controllo negativo (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) o la sequenza target specifica è stato trasfettato in cellule HEK293T insieme a psPAX2 e pMD2.G con lipofectamina 2{{19} }00. Le particelle virali contenenti surnatanti sono state raccolte 36 ore dopo la trasfezione e quindi centrifugate a 210 g per 10 minuti. La fase surnatante priva di cellule è stata filtrata attraverso un filtro da 0,45 μm per rimuovere i detriti cellulari. Le cellule U251 sono state infettate con particelle lentivirali in presenza di 8 ug/ml di polibrene. Dopo 48 ore di coltura, le cellule U251 sono state selezionate con puromicina (2 ug/mL, Sigma). L'efficienza di abbattimento di sh-DHCR7 è stata determinata mediante RT-PCR e analisi Western blot.

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2.6. Macchia occidentale

Le cellule sono state lisate mediante tampone RIPA addizionato con inibitori della proteasi e inibitori della fosfatasi su ghiaccio per 1 ora, quindi centrifugate a 4°C, 13,000 g per 1{{10}} minuto per raccogliere la cellula lisato. La concentrazione proteica nel lisato cellulare è stata misurata mediante dosaggio proteico dell'acido bicinconinico (BCA). La proteina è stata separata mediante SDS-PAGE e quindi trasferita su una membrana di polivinildifluoruro (PVDF). La membrana in PVDF è stata bloccata con il tampone bloccante immunoblotting TBST (10 mmol/L Tris-HCl, pH 7,4, 0,15 mol/L NaCl e 0,05% Tween-20) contenente il 5% di BSA per 1 ora. Dopo il lavaggio con TBST, la membrana è stata incubata con anticorpi primari e secondi anticorpi e successivamente rilevata utilizzando un sistema di imaging a chemiluminescenza (Bio-Rad).

2.7. Analisi del colesterolo totale

Il colesterolo totale nelle cellule è stato rilevato utilizzando un kit di analisi del colesterolo totale nei tessuti di Applygen Technologies Inc. (Pechino, Cina). Lo standard di colesterolo da 5 mmol/L è stato sottoposto a una diluizione seriale con etanolo anidro per tracciare la curva standard e le quantità di colesterolo totale cellulare sono state calcolate secondo le curve standard. L'esperimento è stato condotto seguendo la procedura fornita dal produttore.

2.8. Saggi di co-immunoprecipitazione

Le cellule HEK293T sono state trasfettate con i plasmidi indicati. Le cellule sono state raccolte e lisate con tampone di lisi RIPA integrato con inibitori della proteasi. Dopo la centrifugazione a 18,000 g per 15 minuti a 4 C, i lisati cellulari sono stati raccolti e immunoprecipitati mediante Flag-Trap ProteinG Sepharose (GE Healthcare, Milwaukee, WI, USA) per 4 ore a 4 C. Le proteine ​​legate sono stati eluiti con 2 buffer di caricamento e analizzati mediante immunoblotting.

2.9. PCR in tempo reale

Gli RNA totali sono stati estratti dalle cellule utilizzando il reagente TRIzol (Invitrogen Life Technologies) e il cDNA è stato prodotto con un kit di trascrittasi inversa M-MLV (Promega, Madison, WI, USA). La RT-PCR è stata eseguita utilizzando i kit SYBR RT-PCR (DBI Bio-science) su Roche LC480. L'mRNA della gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi (GAPDH) è stato impostato come riferimento endogeno per normalizzare gli mRNA e i livelli di espressione genica sono stati calcolati utilizzando il metodo 2 ΔΔCT. Le sequenze dei primer RT-PCR sono mostrate nella Tabella Supplementare S1. 2.10. Microscopia confocale

Le cellule U251 sono state trasfettate con plasmide e coltivate per 30 h, quindi lavate tre volte con PBS. Le cellule sono state fissate con paraformaldeide al 4% per 15 minuti e permeate con PBS contenente TritonX-100 allo 0,1% per 5 minuti. Dopo il lavaggio con PBS, le cellule sono state sigillate con PBS contenente il 5% di BSA per 30 minuti. Le cellule sono state lavate tre volte con PBS e incubate con anti-HA, anti-FLAG e anti-flavivirus, quindi incubate con anticorpi secondari anti-FITC di topo e anti-coniglio Cy3. Le cellule sono state colorate con 40,6-Diamidino-2-fenilindolo dicloridrato (DAPI) ed analizzate utilizzando un microscopio confocale Olympus.

2.11. Saggi pull-down GST

Il plasmide pGEX6p-1-NS4B è stato trasfettato nel ceppo BL21 di Escherichia coli (E. coli). GST e GST-NS4B sono stati indotti da IPTG con una concentrazione finale di 0,5 mmol/L e le colture sono state coltivate per altre 6–8 ore a 37 C. E poi la proteina GST e GST- Le proteine ​​NS4B sono state purificate dai batteri E. coli. La proteina GST o GST-NS4B è stata incubata con sfere di glutatione sefarosio (Novagen) e lavata tre volte con PBS. Le proteine ​​GST e GST-NS4B sono state incubate con la proteina di fusione eucariotica HA-DHCR7, che ha origine da plasmidi che codificano lisati cellulari HEK293T espressi da HA-DHCR7- per 4 ore a 4 C. I precipitati sono stati lavati cinque volte, bolliti in 2 Tampone di caricamento SDS e rilevato mediante Western blot con anticorpi anti-GST e anti-HA.

2.12. Mutagenesi sito-diretta di HA-DHCR7

Coppie appropriate di primer mutageni (Tabella Supplementare S1) sono state sintetizzate e utilizzate per generare il costrutto mutato mediante PCR. HA-DHCR7 è stato utilizzato come modello per PrimeSTAR® HS Premix (Takara). Dopo la PCR, il plasmide wild-type rimasto nel prodotto PCR è stato digerito selettivamente da DpnI (New England Biolabs). Il prodotto PCR digerito è stato trasfettato nel ceppo DH5 di E. coli. Il mutante desiderato è stato confermato dall'analisi della sequenza di Sanger.

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2.13. analisi statistica

Tutti gli esperimenti sono stati ripetuti almeno tre volte con risultati simili. I dati sono espressi come deviazione standard media (SD). Il significato della variabilità è stato determinato dal test t spaiato a due code di Student per ANOVA a due gruppi o unidirezionale con il test per confronti multipli di Dunnett o ANOVA a due vie con il test per confronti multipli di Sidak per confronti di gruppi multipli utilizzando il software GraphPad Prism (versione 8.0.1). Un valore di P < 0.{{10}}5 è stato considerato statisticamente significativo e P > 0.05 è stato identificato come statisticamente non significativo. Per tutti i dati, la significatività è stata presentata come *P < 0,05, **P < 0,01 e ***P < 0,001.

3. Risultati

3.1. L'infezione da ZIKV induce l'espressione di DHCR7

Prove sempre più numerose hanno dimostrato che il metabolismo del colesterolo influenza le risposte immunitarie innate dell’ospite contro l’infezione da flavivirus, come ZIKV e il virus Dengue (DENV) (Leier et al., 2020; Randall, 2018). DHCR7 codifica un enzima che trasforma il 7-DHC in colesterolo, l'ultimo passaggio nella biosintesi del colesterolo (Moebius et al., 1998). Per prima cosa abbiamo rilevato l'espressione di DHCR7 in seguito all'infezione da ZIKV. L'astrocita umano U251 è stato infettato da ZIKV, che ha aumentato in modo dose-dipendente l'espressione di DHCR7 sia nell'mRNA che nella proteina (Fig. 1A-C). Per confermare il fenomeno, abbiamo successivamente esaminato l'espressione di DHCR7 nelle cellule Vero e scoperto che l'infezione da ZIKV induceva sostanzialmente l'espressione di DHCR7 (Fig. 1D-F), che era coerente con i risultati nelle cellule U251.

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3.2. Il targeting di DHCR7 suscita un'attività anti-ZIKV critica

Per valutare gli effetti di DHCR7 contro l'infezione da ZIKV, le cellule U251 e A549 sono state trasfettate con il plasmide codificante HA-DHCR7 e quindi infettate con ZIKV (MOI ¼ 1). I risultati hanno mostrato che la sovraespressione di DHCR7 ha migliorato significativamente l'espressione dell'mRNA di ZIKV (Fig. 2A e B). In particolare, con l'accumulo della proteina DHCR7, è stata aumentata anche l'espressione della proteina strutturale E di ZIKV (Fig. 2C e D). Inoltre, abbiamo condotto ulteriormente un test sulla placca utilizzando il surnatante della Figura 2C e abbiamo scoperto che la sovraespressione di DHCR7 aumentava significativamente le unità formanti placca, rispetto al gruppo di controllo (Fig. 2E e F). È stato segnalato che la mutazione missenso G410S di DHCR7 abolisce l'attività enzimatica (Fitzky et al., 1998; Shim et al., 2004; Witsch-Baumgartner et al., 2000). Per determinare ulteriormente gli effetti di DHCR7 sull'infezione da ZIKV, abbiamo successivamente costruito un mutante inattivo di DHCR7 (G410S). Rispetto al tipo selvaggio di DHCR7, il mutante G410S potrebbe inibire significativamente l'infezione da ZIKV (Fig. 2G). Abbiamo anche eseguito un test al microscopio confocale per confermare l'osservazione. Come mostrato in Fig. 2H, la sovraespressione di DHCR7 ha aumentato l'infezione da ZIKV. Per determinare se l'attività dell'enzima endogeno DHCR7 è fondamentale per l'infezione da ZIKV, abbiamo progettato due RNA a forcella corta (shDHCR7-1 e sh-DHCR7-2) mirati specificamente a DHCR7 e generato cellule U251 silenziate DHCR7- linee con sistema shRNA (Fig. 3A). Infine, abbiamo selezionato un sh-DHCR7-1 per la sua maggiore efficienza di silenziamento. Rispetto allo shRNA di controllo trasdotto dalla linea cellulare, queste cellule knockdown DHCR7 hanno mostrato una minore suscettibilità all'infezione da ZIKV (Fig. 3B e C). Successivamente abbiamo utilizzato l'inibitore selettivo del DHCR7 AY9944 che impedisce al 7-DHC di comunicare con il colesterolo (Xu et al., 2011), che ha dimostrato di inibire l'attività enzimatica del DHCR7 (Horlick, 1966; Moebius et al., 1998). Rispetto al controllo, la somministrazione di AY9944 ha inibito in modo dose-dipendente l'infezione da ZIKV nelle cellule U251 (Fig. 3D-F). Il test della placca è stato eseguito anche nelle cellule Vero per valutare ulteriormente gli effetti di DHCR7 e dimostrare che AY9944 potrebbe sopprimere significativamente l'infezione da ZIKV (Fig. 3G e H). In particolare, la microscopia confocale ha mostrato che la proteina ZIKV E era sostanzialmente ridotta in presenza di AY9944 (Fig. 3I). Questi risultati hanno indicato che prendere di mira DHCR7 potrebbe inibire l’infezione da ZIKV.

Fig. 1. L'infezione da ZIKV induce l'espressione di DHCR7. Le cellule A-F U251 e Vero sono state infettate con ZIKV (MOI ¼ 0, 1 e 2) per 24 ore e i livelli di RNA intracellulare di ZIKV (A, D) e DHCR7 (B, E) sono stati determinati mediante RT-PCR con GAPDH come controllo interno. I livelli proteici relativi degli involucri DHCR7 e ZIKV sono stati rilevati mediante Western blot (C, F). I dati provengono da almeno tre esperimenti indipendenti (media DS) o dati rappresentativi (C, F). La significatività statistica è stata calcolata utilizzando l'ANOVA unidirezionale con il test di confronti multipli di Dunnett (A, B, D, E). **P < 0.01, ***P < 0,001. SD, deviazione standard.

3.3. DHCR7 inibisce l'attivazione di TBK1 e IRF3 per ridurre la produzione di IFN e ISG

Poiché DHCR7 è l'enzima vitale per convertire il 7-DHC in colesterolo (Moebius et al., 1998) e l'infezione da ZIKV potrebbe aumentare l'espressione di DHCR7, abbiamo quindi misurato il livello di colesterolo dopo l'infezione da ZIKV. Abbiamo rivelato che l'infezione da ZIKV ha poco effetto sulla sintesi del colesterolo nelle cellule U251 e Vero (Fig. 4A e B), sebbene DHCR7 fosse aumentato (Fig. 1A-D). Considerato il potenziamento di DHCR7 in seguito all'infezione da ZIKV e il ruolo chiave degli IFN nell'affrontare l'infezione da ZIKV, abbiamo successivamente determinato l'effetto di DHCR7 sulla via di segnalazione dell'IFN-I. Le cellule U251 di controllo e silenzianti DHCR7- sono state infettate con ZIKV o trasfettate con poli(I: C) ed è stata esplorata l'espressione di IFN. Rispetto al gruppo di controllo, l'infezione da ZIKV o il trattamento con poli(I: C) hanno marcatamente migliorato l'espressione di IFN nelle cellule U251 silenziate da DHCR7- (Fig. 4C e D). Gli ISG sono gli effettori delle azioni dell'interferone e svolgono un ruolo importante nella difesa immunitaria innata contro l'infezione da ZIKV. Abbiamo anche dimostrato che il blocco di DHCR7 potrebbe rafforzare significativamente l'espressione di ISG15 e ISG56 sia a livello di mRNA che di proteina (Fig. 4E-J). Coerentemente, il trattamento con l'inibitore DHCR7 AY9944 potrebbe indurre l'espressione di IFN-, ISG15 e ISG56 (Fig. 4K, L). È importante sottolineare che il mutante inattivo G410S potrebbe invertire parzialmente gli effetti inibitori di DHCR7 sull'espressione di IFN e ISG (Fig. 4M, N). L'attivazione di TBK1 e IRF3 è essenziale per l'induzione di IFN-ISG, quindi abbiamo successivamente esaminato l'effetto di DHCR7 sull'espressione e sull'attivazione di TBK1 e IRF3. Abbiamo dimostrato che DHCR7 non solo ha inibito in modo dose-dipendente il livello proteico, ma ha anche soppresso il livello di fosforilazione di TBK1 e IRF3 (Fig. 5A-C). Inoltre, il mutante inattivo G410S ha invertito in modo incompleto gli effetti inibitori di DHCR7 sulla fosforilazione di IRF3 e TBK1 (Fig. 5D). In contrasto con i risultati della sovraespressione di DHCR7, il trattamento con AY9944 potrebbe indurre l'attivazione di IRF3 e TBK1 nella cellula U251 (Fig. 5E).

3.4. ZIKV NS4B interagisce con DHCR7 per inibire la fosforilazione di TBK1 e IRF3

Prove crescenti hanno rivelato che ZIKV ha evoluto proteine ​​NS specifiche per facilitare la replicazione efficiente nelle cellule ospiti eludendo direttamente l’immunità innata e adattativa dell’ospite attraverso una pletora di meccanismi discreti. Abbiamo eseguito un test co-IP per individuare la singola proteina ZIKV NS che potrebbe interagire con DHCR7. Le cellule HEK293T sono state co-trasfettate con pCMV-DHCR7-HA e il plasmide che esprime la proteina NS individuale fusa con Flag-tag. Come mostrato in Fig. 6A, DHCR7 si lega solo a NS4B ma non riesce a interagire con altre proteine ​​NS. Sono stati ulteriormente condotti test reciproci di co-IP e hanno mostrato che la proteina NS4B ha interagito con DHCR7 nelle cellule HEK293T (Fig. 6B e C). Per confermare l'interazione di NS4B e DHCR7, abbiamo successivamente eseguito un microscopio confocale e scoperto che la proteina NS4B e la proteina DHCR7 erano colocalizzate nel citoplasma (Fig. 6D). Il test pull-down GST ha ulteriormente dimostrato l'interazione di NS4B e DHCR7 (Fig. 6E). Inoltre, la trasfezione transitoria di NS4B nelle cellule U251 potrebbe indurre drammaticamente l'espressione di DHCR7 (Fig. 6F). È importante sottolineare che NS4B potrebbe bloccare in modo dose-dipendente la fosforilazione sia di TBK1 che di IRF3, che era correlata positivamente con l'attivazione potenziata di TBK1 e IRF3 in risposta a DHCR7 (Fig. 6G e H). Tuttavia, la sovraespressione di NS4B nelle cellule HEK293T ha ridotto significativamente il livello proteico di TBK1, ma ha avuto scarso effetto sulla proteina IRF3 (Fig. 6G e H). Per confermare ulteriormente queste osservazioni, NS4B è stato trasfettato in cellule U251 knockdown DHCR7 e ha mostrato effetti inibitori sulle proteine ​​endogene e sui livelli di fosforilazione di TBK1 e IRF3 (Fig. 6I). Presi insieme, questi risultati hanno dimostrato che ZIKV NS4B ha interagito con DHCR7 e ha migliorato l'espressione di DHCR7 per bloccare l'attivazione di TBK1 e IRF3 e quindi facilitare l'infezione da ZIKV.

Fig. 2. La sovraespressione di DHCR7 promuove la replicazione di ZIKV. Le cellule A-D U251 e A549 sono state trasfettate con il vettore HA o HA-DHCR7 alle concentrazioni indicate per 12 ore e quindi infettate con ZIKV per altre 36 ore. I livelli di RNA di ZIKV sono stati rilevati mediante RT-PCR con GAPDH come controllo interno (A, B) e i livelli di proteine ​​dell'involucro di ZIKV, HA-DHCR7 e GAPDH sono stati rilevati mediante Western blot (C, D). Le cellule E, F Vero sono state infettate con surnatante contenente ZIKV dalla Fig. 2C per 48 ore per determinare le copie di ZIKV mediante test della placca. Le cellule G U251 sono state trasfettate con il vettore HA, HA-DHCR7 o HA-DHCR7 (G410S) per 12 ore e infettate con ZIKV per 36 ore, e i livelli proteici dell'involucro di ZIKV, HA-DHCR7 e GAPDH sono stati rilevati mediante Western blot. Le cellule H U251 sono state trasfettate con il vettore HA o HA-DHCR7 (1 ug) per 12 ore, infettate con ZIKV per 36 ore, e successivamente incubate con anticorpi anti-flavivirus di topo e anti-HA di coniglio, successivamente colorate con antitopo coniugato con FITC e anticorpi anti-HA di coniglio. Anticorpi secondari anti-coniglio coniugati con Cy3-. I nuclei sono stati colorati con DAPI. Le immagini sono state visualizzate mediante microscopia confocale. Barra della scala ¼ 100 μm. I dati provengono da almeno tre esperimenti indipendenti (SD media) o dati rappresentativi (C, D, E, G, H). La significatività statistica è stata calcolata utilizzando il test t spaiato a due code di Student (F) o l'ANOVA unidirezionale con il test di confronti multipli di Dunnett (A, B). *P<0,05, ***P<0,001. SD, deviazione standard.

4. Discussione

Gli IFN di tipo I e i loro ISG a valle affrontano un’ampia serie di agenti patogeni e svolgono un ruolo cruciale nella difesa immunitaria dell’ospite contro ZIKV (Lazear et al., 2016). Per eludere la sorveglianza mediata dall'IFN e ottenere una replicazione sufficiente, ZIKV fa evolvere proteine ​​NS mirate a vari punti della via di segnalazione dell'IFN per fuggire dal sistema immunitario innato cellulare (Lee et al., 2021). Studi sempre più numerosi hanno dimostrato che ZIKV NS1, NS3, NS4A e NS5 inibiscono moduli distinti del percorso RIG-I/IFN-I e facilitano l'infezione virale utilizzando meccanismi diversi e indipendenti (Grant et al., 2016; Kumar et al., 2016 ; Ma et al., 2018; Riedl et al., 2019; Xia et al., 2018; Zheng et al., 2018). Tuttavia, il meccanismo specifico con cui ZIKV NS4B contrasta la restrizione immunitaria è scarsamente definito. ZIKV NS4B è una proteina estremamente idrofobica composta da 251 aminoacidi e si trova nella membrana del reticolo endoplasmatico con N-terminale (Zou et al., 2014). L'inibizione di NS4B della via di segnalazione dell'IFN-I è stata identificata in diversi flavivirus (Ding et al., 2013; Munoz-Jordan et al., 2003, 2005; Shan et al., 2021; Yi et al., 2016; Zhang et al., 2021). Uno studio recente ha riportato che il ceppo ZIKV INMI1 isolato in Brasile utilizza NS4B per antagonizzare la via di segnalazione a valle dell'IFN-I schiacciando la fosforilazione di STAT1 e di conseguenza interrompendo il trasporto nucleare di STAT1 (Fanunza et al., 2021). In questo studio, abbiamo trovato un meccanismo distinto in cui ZIKV NS4B ha abolito la produzione di IFN sopprimendo la fosforilazione di TBK1 e IRF3, il componente a monte della via di segnalazione dell'IFN-I. In particolare, nel ZIKV NS4B è stata scoperta la sostituzione dell'amminoacido (G18R), che ha contribuito alla diminuzione della produzione di IFN e all'indebolimento dell'espressione di ISG, e di conseguenza ha facilitato l'infezione virale nei topi, indicando il significato di NS4B come determinante della patogenesi (Gorman et al. ., 2018). Prove emergenti hanno indicato l’importanza critica del metabolismo del colesterolo che partecipa alla risposta immunitaria innata (Akula et al., 2016; Dang et al., 2017; Reboldi et al., 2014; York et al., 2015). Sebbene sia stato documentato che diversi intermedi nel metabolismo del colesterolo hanno ampi effetti antivirali (Blanc et al., 2013; Li et al., 2017; Liu et al., 2013; Xiao et al., 2020), il nostro studio ha illustrato un nuovo meccanismo che l'enzima metabolico del colesterolo DHCR7 è stato coinvolto nell'infezione da ZIKV attenuando l'attivazione di TBK1 e IRF3 per facilitare l'infezione virale. Essendo un enzima chiave coinvolto nel metabolismo del desmosterolo e del colesterolo, DHCR7 rappresenta un passaggio nella conversione del 7-DHC in vitamina D nelle cellule della pelle esposte ai raggi UVB (Prabhu et al., 2016b). Inoltre, DHCR7 è posizionato non solo all’ingresso della via Bloch ma anche alla fine della via Kandutsch-Russell (Prabhu et al., 2016a, 2016b), che svolge un ruolo vitale nel controllo della sintesi del colesterolo. La diafonia di DHCR7 e la sua interazione con altri enzimi in diversi percorsi possono potenziare molteplici funzioni in diversi tipi di cellule o organi. Studi precedenti hanno rivelato che il blocco di DHCR7 potrebbe ridurre il desmosterolo, il precursore immediato della biosintesi del colesterolo, offrendo così una protezione sufficiente contro l’infezione da HCV (Luu et al., 2015; Rodgers et al., 2012). È importante sottolineare che Xiao et al. hanno dimostrato che l'infezione da VSV diminuisce l'espressione di DHCR7, portando a una riduzione del colesterolo, ma a un maggiore accumulo di 7-DHC nei macrofagi e nel fegato (Xiao et al., 2020). I macrofagi trattati con 7-DHC hanno fornito una risposta antivirale potenziata; mentre l'aggiunta di colesterolo ha mostrato una protezione minore. Gli inibitori di DHCR7 e la somministrazione di 7-DHC potrebbero essere approcci utili per combattere le infezioni virali come HIN1, HSV e VSV. In questo studio, abbiamo scoperto che l’inibitore DHCR7 AY9944 potrebbe sopprimere l’infezione da ZIKV. Tuttavia, il nostro studio ha rivelato che l’infezione da ZIKV ha indotto l’espressione di DHCR7, ma ha avuto scarso effetto sulla biosintesi del colesterolo nelle cellule gliali. Non abbiamo esaminato il livello di espressione di 7-DHC post-infezione da ZIKV, tuttavia, vale la pena indagare ulteriormente se 7-DHC e AY9944 abbiano un'efficacia terapeutica sinergica per il trattamento di pazienti che sono stati infettati da ZIKV infezione nel cervello. La sovraespressione di DHCR7 ha promosso l’infezione da ZIKV, mentre il trattamento con l’inibitore selettivo di DHCR7 (AY9944) ha aumentato fortemente la produzione di IFN contro l’infezione da ZIKV. L'attivazione di TBK1 e IRF3 è vitale per innescare la segnalazione IFN-I. Precedenti indagini hanno mostrato che il silenziamento di DHCR7 o il trattamento con 7-DHC attivavano la via PI3K-AKT3 per fosforilare IRF3, ma non TBK1 nei macrofagi (Xiao et al., 2020). Tuttavia, i nostri risultati hanno mostrato che DHCR7 diminuisce in modo dose-dipendente sia l'espressione di IRF3 che di TBK1, nonché la fosforilazione di IRF3 e TBK1. Queste indagini hanno suggerito che DHCR7 potrebbe contribuire all’infezione da ZIKV in un meccanismo cerebrale indipendente dal metabolismo del colesterolo. È stato ben chiarito che ZIKV utilizzava proteine ​​NS per interagire direttamente con diversi componenti della via RIG-I/IFN-I per eludere la risposta immunitaria e facilitare la replicazione virale. Abbiamo precedentemente segnalato l'interazione di ZIKV NS5 con RIG-I per attenuare la produzione di IFN (Li et al., 2020). Altri hanno dimostrato che ZIKV NS1 e NS2B miravano a TBK1, NS3 mirava a RIG-I e MDA5 per ridurre la produzione di IFN-I e ISG (Lee et al., 2021; Riedl et al., 2019). Tuttavia, la funzione delle proteine ​​ZIKV NS che mirano al metabolismo del colesterolo rimane in gran parte sfuggente. In questo studio, abbiamo anche illustrato un'interazione non segnalata tra l'enzima metabolico del colesterolo DHCR7 e le proteine ​​ZIKV NS. Abbiamo mostrato che DHCR7 è specificamente legato a NS4B, non ad altre proteine ​​NS. Abbiamo fornito la prova critica che ZIKV NS4B ha interagito con DHCR7 e ne ha sostanzialmente indotto l'espressione, il che era coerente con i risultati nelle cellule U251 dopo l'infezione da ZIKV. È importante sottolineare che, oltre a dimostrare direttamente l'impegno di DHCR7 e ZIKV NS4B, abbiamo anche scoperto che ZIKV NS4B aumentava l'espressione di DHCR7 per inibire la fosforilazione di TBK1 e IRF3 e facilitare l'infezione da ZIKV. In accordo con i nostri risultati, uno studio recente ha rivelato che il deficit di DHCR7 potrebbe attivare la segnalazione IRF3 e IFN per inibire VSV e altri virus nei macrofagi.

Fig. 3. L'abbattimento di DHCR7 riduce l'infezione da ZIKV nelle cellule U251. Le cellule U251 sono state trasdotte con le particelle lentivirali contenenti shRNA contro DHCR7 (shDHCR7-1 e sh-DHCR7-2) o una sequenza non target (sh-NTC), seguita dalla selezione con puromicina per 14 giorni. L'efficienza di abbattimento è stata determinata mediante RT-PCR. Le cellule B, C DHCR7-silenzianti U251 (sh-DHCR7) e sh-NTC U251 sono state infettate in modo simulato o infette da ZIKV (MOI ¼ 1) per 36 ore. Il livello di RNA ZIKV intracellulare è stato rilevato mediante RT-PCR con GAPDH come controllo interno (B) e i livelli proteici dell'involucro ZIKV, DHCR7 e GAPDH sono stati rilevati mediante Western blot (C). Le cellule D, E U251 sono state trattate con l'inibitore DHCR7 AY9944 alla concentrazione indicata per 2 ore, quindi infezione con ZIKV (MOI ¼ 1) per 48 ore. Le cellule sono state sottoposte a RT-PCR per rilevare l'RNA di ZIKV (D). I livelli proteici dell'involucro ZIKV, DHCR7 e GAPDH sono stati rilevati mediante Western blot (E). Le cellule F U251 sono state trattate con l'inibitore DHCR7 AY9944 alla concentrazione indicata per 36 ore e DHCR7 e GAPDH sono stati rilevati mediante Western blot. Le cellule G, H Vero sono state infettate con surnatante contenente ZIKV dalla Fig. 3E per 48 ore per determinare le copie di ZIKV mediante test della placca. Le cellule U251 sono state trattate con AY9944 alla concentrazione indicata per 2 ore, quindi infezione con ZIKV a MOI ¼ 1 per 36 ore. Le immagini sono state visualizzate mediante microscopia confocale. Barra della scala ¼ 100 μm. I dati provengono da almeno tre esperimenti indipendenti (SD media) o dati rappresentativi (C, E, F, G e I). La significatività statistica viene calcolata utilizzando l'ANOVA unidirezionale con il test per confronti multipli di Dunnett (A, D, H) o l'ANOVA a due vie con il test per confronti multipli di Sidak (B). ***P < 0,001. SD, deviazione standard.

Fig. 4. DHCR7 inibisce la produzione di IFN e ISG. Le cellule A, B U251 e Vero sono state infettate con ZIKV (MOI ¼ 0, 0.5 e 1) per 24 ore e il colesterolo cellulare è stato misurato mediante il kit di analisi del colesterolo totale nei tessuti. Le cellule C–H DHCR7-silenzianti U251 (sh-DHCR7) e sh-NTC U251 sono state infettate con ZIKV (MOI ¼ 1) o trattate con Poly(I: C) (1 ug/mL) per 6 ore. L'RNA cellulare totale è stato estratto e sottoposto a RT-PCR per l'espressione dell'mRNA con GAPDH come controllo interno. Le espressioni relative di IFN e ISG sono state normalizzate rispetto a quelle dei campioni sh-NTC nel gruppo mock e i cambiamenti di piega sono stati mostrati in modo eccessivo. IFN- (C, D), ISG15 (E, F) e ISG56 (G, H). Le cellule I, J DHCR7-silenzianti U251 (sh-DHCR7) e sh-NTC U251 sono state infettate con ZIKV (MOI ¼ 1) o trasfettate con Poly(I: C) (1 ug/mL) per 24 ore, e i livelli proteici di ISG15, ISG56 e GAPDH sono stati rilevati mediante Western blot. Le cellule K U251 sono state trattate con la dose indicata di AY9944 per 2 ore, quindi infettate con ZIKV (MOI ¼ 1) per 6 ore. Il livello di IFN-RNA è stato rilevato mediante RT-PCR con GAPDH come controllo interno. Le cellule L U251 sono state trattate con la dose indicata di AY9944 per 2 ore e quindi infettate con ZIKV (MOI ¼ 1) per 24 ore. I livelli proteici di ISG15, ISG56 e GAPDH sono stati rilevati mediante Western blot. Le cellule M U251 sono state trasfettate con il vettore HA, HA-DHCR7 o HA-DHCR7 (G410S) per 24 ore e infettate con ZIKV (MOI ¼ 1) per 6 ore. I livelli di IFN-RNA sono stati rilevati mediante RT-PCR con GAPDH come controllo interno. Le cellule N U251 sono state trasfettate con il vettore HA, HA-DHCR7 o HA-DHCR7 (G410S) per 24 ore e quindi infettate con ZIKV (MOI ¼ 1) per 24 ore. I livelli proteici di ISG15, ISG56 e GAPDH sono stati rilevati mediante Western blot. I dati provengono da almeno tre esperimenti indipendenti (SD media) o dati rappresentativi (I, J, L, N). La significatività statistica viene calcolata utilizzando l'ANOVA unidirezionale con il test per confronti multipli di Dunnett (A, B, K, M) o l'ANOVA a due vie con il test per confronti multipli di Sidak (C–H). ns, P > 0,05, ***P < 0,001. SD, deviazione standard.

Fig. 5. DHCR7 inibisce l'attivazione di TBK1 e IRF3. Le cellule A, B HEK293T sono state co-trasfettate con il plasmide codificante TBK1- insieme al plasmide esprimente DHCR7- o al vettore vuoto (A). Le cellule HEK293T sono state co-trasfettate con il plasmide codificante IRF3-, il plasmide codificante RIG-I, insieme al plasmide codificante DHCR7-o al vettore vuoto (B). Le cellule sono state raccolte 24 ore dopo la trasfezione e sottoposte a Western blot con gli anticorpi indicati [anti-TBK1, anti-P-TBK1(S172), anti-IRF3, anti-PIRF3(S396), anti-HA e anti-GAPDH ]. Le cellule C U251 sono state trasfettate con la dose indicata di DHCR7 che esprime plasmide o vettore vuoto per 24 ore. Le cellule sono state quindi infettate con ZIKV (MOI ¼ 1) raccolte 6 ore dopo l'infezione e sottoposte a Western blot con gli anticorpi indicati [anti-TBK1, anti-P-TBK1(S172), anti-IRF3, anti-P-IRF3( S396), anti-HA e anti-GAPDH]. Le cellule D U251 sono state trasfettate con il vettore HA, HA-DHCR7 o HA-DHCR7 (G410S) per 24 ore. Le cellule sono state quindi infettate con ZIKV (MOI ¼ 1) raccolte 6 ore dopo l'infezione e sottoposte a Western blot con gli anticorpi indicati [anti-TBK1, anti-P-TBK1(S172), anti-IRF3, anti-PIRF3(S396) , anti-HA e anti-GAPDH]. Le cellule E U251 sono state trattate con la dose indicata di AY9944 per 2 ore e infettate con ZIKV (MOI ¼ 1) per 6 ore, quindi sottoposte a Western blot con gli anticorpi indicati [anti-TBK1, anti-P-TBK1(S172), anti -IRF3, anti-P-IRF3(S396) e anti-GAPDH]. I dati provengono da almeno tre esperimenti indipendenti e sono mostrati come dati rappresentativi (A–E).

Fig. 6. ZIKV NS4B interagisce con DHCR7 per inibire la fosforilazione di TBK1 e IRF3. Le cellule A HEK293T sono state co-trasfettate con plasmidi che codificano HA-DHCR7 e plasmidi che codificano per proteine ​​non strutturali ZIKV (FLAG-NS1, FLAG-NS3, FLAG-NS4A, FLAG-NS4B e FLAG-NS5) o plasmide di controllo vuoto per 3 0 h. I lisati cellulari sono stati immunoprecipitati con anticorpi anti-Flag e quindi analizzati mediante immunoblotting con gli anticorpi indicati. Le cellule B, C HEK293T sono state co-trasfettate con plasmidi che codificano HA-DHCR7, plasmidi che codificano FLAG-NS4B o plasmide di controllo vuoto per 30 ore. I lisati cellulari sono stati immunoprecipitati con anticorpo anti-HA (B) o anticorpo anti-FLAG (C) e quindi analizzati mediante immunoblotting con gli anticorpi indicati. Le cellule D U251 sono state trasfettate con il plasmide FLAG-NS4B insieme a plasmidi codificanti per HA-DHCR7. La localizzazione di FLAG-NS4B (verde), HA-DHCR7 (rosso), il marcatore del nucleo DAPI (blu) e la fusione sono state analizzate con la microscopia confocale. Barra della scala ¼ 10 μm. I lisati di cellule E provenienti da cellule HEK293T trasfettate con HA-DHCR7 sono stati incubati con la proteina GST o la proteina GST-NS4B che è stata incubata con sfere di glutatione-sefarosio. Le miscele sono state rilevate mediante Western blot con anticorpi anti-HA e anti-GST (in alto). I lisati di cellule HEK293T trasfettate e le proteine ​​purificate sono stati rilevati mediante Western blot con anticorpi anti-HA e anti-GST (in basso). Le cellule F U251 sono state trasfettate con il plasmide che codifica FLAG-NS4B (0, 1, 2 ug). I livelli proteici relativi di DHCR7, FLAG-NS4B e GAPDH sono stati rilevati mediante Western blot. Le cellule G, H HEK293T sono state co-trasfettate con un plasmide che esprime NS4B o un vettore vuoto, insieme al plasmide che codifica TBK1- (F), al plasmide che esprime IRF3- e ai plasmidi che codificano RIG-I (G) . Le cellule sono state raccolte 24 ore dopo la trasfezione e sottoposte a Western blot con gli anticorpi indicati [anti-TBK1, anti-P-TBK1(S172), anti-IRF3, anti-P-IRF3(S396), anti-FLAG e antiGAPDH ]. Le cellule U251 silenzianti DHCR7- (sh-DHCR7) e le cellule sh-NTC U251 sono state trasfettate con un plasmide che esprime NS4B o un vettore vuoto. Le cellule sono state raccolte 6 ore dopo la trasfezione e sottoposte a Western blot con gli anticorpi indicati [anti-TBK1, anti-P-TBK1(S172), anti-IRF3, anti-P-IRF3(S396), anti-FLAG e antiGAPDH ]. I dati sono rappresentativi di tre esperimenti indipendenti.

5. Conclusioni

In sintesi, uno studio precedente ha rivelato che l’enzima DHCR7 del metabolismo del colesterolo è coinvolto nella risposta immunitaria innata contro varie infezioni virali. Il nostro studio ha presentato che ZIKV NS4B ha interagito con DHCR7 e ha indotto l'espressione di DHCR7. L’aumento di DHCR7 inibisce notevolmente l’attivazione di TBK1 e IRF3 e si traduce in una ridotta produzione di IFN e ISG, che quindi facilita l’infezione da ZIKV nelle cellule gliali. Questi risultati hanno scoperto un nuovo meccanismo di fuga immunitaria virale secondo cui ZIKV supera la risposta immunitaria prendendo di mira direttamente DHCR7 con NS4B.

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