Le N-idrossicinnamoilfenalchilammidi (36H) hanno mostrato capacità sia antiossidanti che antitirosinasi. Il composto è stato studiato per le sue proprietà antiossidanti, utilizzando un test di scavenging dell'1,1-difenil-2-picrylhydrazul- (DPPH-), una valutazione del potere antiossidante di riduzione dello ione ferrico (FRAP) e una valutazione del potere antiossidante del metallo- dosaggio del potere chelante. I risultati hanno mostrato che il 36H aveva capacità antiossidanti negli esami del potere di eliminazione del DPPH e di riduzione del ferro, ma il dosaggio del potere chelante non ha dimostrato la capacità antiossidante. 36H è stato anche misurato per l'attività inibitoria della tirosinasi applicando varie piattaforme di specie, tra cui funghi in vitro, melanoma di topo B16F10 e cellule di melanociti umani. In termini di soppressione della tirosinasi dei funghi in vitro, il 36H ha frenato i processi di melanogenesi. Si presume che 36H abbia bloccato il sito attivo della tirosinasi come inibitore competitivo per la tirosinasi dei funghi, quindi non diminuendo la normale vitalità cellulare dei melanociti umani. Una reazione quantitativa a catena della polimerasi in tempo reale (qRT-PCR) e western blot hanno scoperto che 36H sottoregolava l'RNA e le proteine ​​correlate alla melanogenesi, inclusa la produzione di pigmenti (MITF, tirosinasi, TRP-1 e TRP-2) , maturazione del melanosoma (Rab27a) e trasporto del melanosoma (Myo5a, MLPH e Mreg). Complessivamente, il 36H mostrava le funzioni biologiche di antiossidazione e soppressione della melanina, quindi c'era la possibilità della sua applicazione come additivo alimentare o agente sbiancante per la pelle.

Secondo studi pertinenti,cistancheè un'erba comune che è conosciuta come "il miracoloerbache prolunga la vita". Il suo componente principale ècistanoside, che ha vari effetti comeantiossidante, antinfiammatorio, Epromozione della funzione immunitaria. Il meccanismo tra cistanche epellesbiancamentosta nell'effetto antiossidante diglicosidi di cistanche. La melanina nella pelle umana è prodotta dall'ossidazione ditirosinacatalizzata datirosinasi, e ilossidazionela reazione richiede la partecipazione dell'ossigeno, quindi i radicali liberi dell'ossigeno nel corpo diventano un fattore importante che influenza la produzione di melanina. Cistanche contienecistanoside, che è un antiossidante e può ridurre la generazione di radicali liberi nel corpo, quindiinibendo la produzione di melanina.

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1. Introduzione

La pelle umana è l'organo più grande del corpo umano; mantiene le funzioni corporee e previene la perdita di acqua, elettroliti e biomolecole. La pelle è composta dall'epidermide, dal derma e dall'ipoderma. L'epidermide è ulteriormente suddivisa in cinque strati separati: lo strato corneo, lo strato lucido, lo strato granuloso, lo strato spinoso e lo strato basale [1]. Lo strato di base dell'epidermide, che è collegato al derma, è lo strato basale che contiene i melanociti. I melanociti hanno dendriti per trasferire la melanina ai cheratinociti, che determinano la superficie del colore della pelle a causa del contenuto di melanina all'interno di questi cheratinociti [2].

I radicali liberi sono composti da un atomo o da un gruppo di atomi che hanno uno o più elettroni spaiati. Sono coinvolti nelle reazioni fisiologiche, metaboliche e immunitarie e nelle funzioni di trasferimento del segnale. Sebbene facciano parte dei normali processi biochimici sani nel corpo, sono anche responsabili del danno. Le specie reattive dell'ossigeno (ROS) e vari radicali liberi sono stimolati dalla generazione di anioni superossido o perossidi di idrogeno. Ciò può causare messaggi confusi, danni alle membrane cellulari e danni alle comunicazioni delle cellule ioniche a causa della perossidazione lipidica. Ciò influisce sulle molecole intracellulari che presentano gruppi SH e proteine ​​e DNA attivi [3]. La quantità di ROS è controllata dai sistemi di autodifesa che sono mediati dagli antiossidanti nel loro stato normale, come gli antiossidanti. Questi includono la vitamina C, la vitamina E o il glutatione [4], che eliminano i radicali liberi per prevenire il danno cellulare. Tuttavia, interrompono l'equilibrio dello stato di ossidazione cellulare che si traduce in troppi ROS. Precedenti studi hanno dimostrato che molte malattie degenerative, come l'invecchiamento e il cancro, sono causate da specie di ossigeno attivo o radicali liberi. Le proprietà antiossidanti suggeriscono che la perossidazione dei lipidi all'interno delle membrane dei melanociti aumenta il contenuto di glutatione intracellulare, che può spiegare la depigmentazione [5, 6].

L'oscuramento della pelle, degli occhi e dei capelli è causato dalla sintesi della melanina, che è un biopolimero pigmentato sintetizzato nel melanosoma dei melanociti. La melanina è un meccanismo protettivo contro i danni causati dai raggi UV [7]. I geni congeniti possono influenzare il colore della pelle, ma l'induzione delle radiazioni UV, l'infiammazione e i cambiamenti ormonali inducono i melanociti a sintetizzare più melanina. Tuttavia, la sovrapproduzione di melanina può indurre disturbi del pigmento, come melasma, lentigo senile, lentiggini e iperpigmentazione [8]. Questi sono solitamente trattati con cosmetici o ingredienti farmaceutici che contengono componenti sbiancanti per la pelle. Anche se questi elementi provengono da fonti naturali, solo alcuni agenti vengono utilizzati nei cosmetici o nelle medicine a causa di problemi di sicurezza o di efficacia sbiancante. La melanogenesi comporta il legame dell'ormone stimolante i melanociti alla melanocortina-1, che aumenta l'adenosina monofosfato ciclico (cAMP) e attiva i fattori di trascrizione associati alla microftalmia (MITF) [9]. Il MITF sovraregola l'espressione di un enzima melanogenico, la tirosinasi, che svolge un'importante funzione nell'idrossilazione della L-tirosina a diidrossifenilalanina (L-DOPA) e nell'ossidazione della L-DOPA a dopachinone [10]. I trattamenti medici e cosmetici utilizzano sempre più gli inibitori dell'attività della tirosinasi. La produzione di melanogenesi e il trasferimento dei melanosomi dai melanociti ai cheratinociti sono necessari per la colorazione della pelle [11]. I melanosomi sono legati al citoscheletro di actina alla periferia dei melanociti tramite il complesso tripartito formato dalla proteina Ras-correlata Rab-27 (Rab27a), melanofilina (MLPH) e miosina Va (Myo5a). Rab27a è una proteina legata alla membrana coinvolta nel trasporto delle proteine ​​e nella piccola trasduzione del segnale mediata da GTPasi. La melanofilina forma un complesso ternario con Rab27a nel sito legato al GTP con Myo5a che è la proteina motrice. La pigmentazione visibile dei mammiferi nei capelli e nella pelle è secondo questo complesso tri-proteico per legare gli organelli produttori di pigmento. Se la proteina complessa è carente, la connessione tra F-actina e melanosoma viene interrotta [12].

All'interno dei potenziali composti terapeutici positivi, è stato riportato che le N-idrossicinnamoilfenalchilamidi (36H) hanno un effetto inibitorio sull'espressione delle metalloproteinasi di matrice- (MMP-) 9 in THP-1, una linea cellulare monocitica della leucemia umana, che viene stimolata dal fattore di necrosi tumorale- (TNF-) [7]. Uno studio precedente ha mostrato che l'espressione TNF indotta di MMP-9 sia per i livelli di proteine ​​che di mRNA era completamente inibita in modo dipendente dalla concentrazione (1–20 μM). È stato scoperto che 36H ha soppresso marcatamente il potenziatore del gene del polipeptide leggero del fattore nucleare κ nella segnalazione delle cellule B (NF-κB) come rilevato dal test del gene reporter NF-κB, ma non ha avuto alcun effetto sulla degradazione del (fattore nucleare del polipeptide leggero κ potenziatore genico nell'inibitore delle cellule B (IκB) o la traslocazione di NF-κB. I dati di immunoprecipitazione della cromatina hanno dimostrato che l'affiliazione tra MMP-9 e il gene del promotore della subunità p65 di NF-κB (p65) è stata completamente annullata da 36H e dalla fosforilazione di p65 non è stato influenzato. In generale, un rapporto precedente ha dimostrato che il 36H ha soppresso la secrezione di MMP-9 mediante la downregulation mirata al nucleare dei meccanismi della via NF-κB nel THP-1. Il 36H è un analogo dell'acido della caffeina estere fenetilico (CAPE), che è un noto soppressore delle metastasi e dell'invasione del cancro [14].Sono state studiate le attività antiossidanti e l'eliminazione dei radicali liberi di alcuni analoghi del CAPE e i risultati di tali studi hanno spinto questo studio a determinare se il 36H riducesse attività della tirosinasi e RNA e proteine ​​​​correlati alla melanogenesi sottoregolati. Questo studio rileva che 36H è un antiossidante potenziale e positivo e un agente sbiancante per la pelle.

2. Materiali e metodi

2.1. Reagenti e Materiali.Il dimetilsolfossido (DMSO) e la L-tirosina sono stati ottenuti da Sigma-Aldrich Chemical Inc. (St. Louis, MO, USA). Il mezzo di Eagle modificato di Dulbecco (DMEM) e il siero bovino fetale (FBS) sono stati acquistati da Gibco-BRL (Gaithersburg, MD, USA). Tutti i reagenti e i tamponi alternativi sono stati acquisiti alla massima purezza commerciale.

2.2. Sintesi chimica di 36H.36H è stato fornito dal professor Yueh-Hsiung Kuo, che ha utilizzato i metodi successivi dall'accoppiamento di legame ammidico per ottenere i composti. Il benzotriazol-1-yloxytris (dimetilammino)-fosfonio esafluorofosfato (BOP) è stato combinato con una miscela di R2-NH2, R1-COOH e trietilammina (Et3N) in dimetilformammide (DMF). La soluzione di reazione è stata miscelata per 3{{1{{30}}}} minuti a 0 gradi C e poi miscelata a 25 gradi C per 2 ore. Quando il liquido chimico è stato evaporato, il residuo è stato diviso tra H2O e acetato di etile (AcOEt). Il residuo è stato quindi filtrato e purificato mediante cromatografia su colonna con una soluzione di eluizione (AcOEt–CH2Cl2, 1: 1, v/v) su gel di silice (70–230 e 230–400 mesh, Merck 7734). I prodotti sono stati ricristallizzati da AcOEt per ottenere la migliore Medicina Ossidativa e Longevità Cellulare e i cristalli più ideali. Per la spettrometria di massa ad impatto elettronico (EIMS) è stato utilizzato uno spettrometro di massa Finnigan TSQ-46C. Gli spettri 1H e 13C NMR sono stati ottenuti utilizzando uno spettrometro Bruker Avance 500. Uno spettrofotometro Nicolet Magna-IR 550 ha registrato gli spettri IR. 36H è stato inizialmente sciolto in soluzione DMSO prima dei seguenti studi. Per ogni analisi è stato utilizzato DMSO con una concentrazione costante e finale dello 0,2% (v/v). Questo composto non è noto come antiossidante o sbiancante per la pelle [7, 13] e la struttura è mostrata nella Figura 1. I campioni sono stati sciolti in DMSO e sono state preparate varie concentrazioni con una concentrazione finale di DMSO inferiore allo 0,5%.

2.3. Saggio della capacità di scavenging dei radicali DPPH.DPPH è 2,2-difenil-1-picrylhydrazyl, che diventa viola scuro quando ha un radicale libero. Quando l'antiossidante rimuove il radicale da DPPH˙, riduce DPPH˙ a un DPPH stabile, che ha un colore giallo chiaro [14]. Vari dosaggi del 36H (2 μL di volume totale) sono stati combinati in 98 μL di miscela DPPH (60 μM) e la piastra è stata esaminata utilizzando un lettore spettroscopico ELISA (test immunoassorbente legato all'enzima) da 517 nm. L'acido L-ascorbico è stato utilizzato come controllo positivo. I rapporti di DPPH residuo sono stati mappati accanto al campione per determinare la quantità di antiossidante che riduce la precedente concentrazione di DPPH. La proprietà di scavenging ( percentuale ) è stata determinata come

2.4. Saggio di potere riducente.Il dosaggio del potere antiossidante di riduzione degli ioni ferrici (FRAP) viene spesso applicato per valutare la capacità antiossidante di bevande, alimenti, frutta e integratori alimentari, inclusi flavonoidi o polifenoli. Vari dosaggi di 36H sono stati introdotti in una miscela tampone fosfato 67 mM (0.085 mL, pH 6,8) e ferricianuro di potassio al 20% [K3Fe(CN)6, 2,5 μL). La soluzione ha reagito per 20 minuti a 50 gradi C e quindi l'acido tricloroacetico (10 percento, 0,16 mL) è stato aggiunto alla soluzione prima che fosse centrifugata a 3000 g per 10 minuti [14]. Il surnatante della soluzione (75 μL) è stato combinato con il 2% di FeCl3 (25 μL), quindi un lettore spettroscopico ELISA ha misurato l'assorbanza risultante a 700 nm, per una piastra a 96-pozzetti. Il butilidrossianisolo (BHA) è stato impiegato come controllo positivo. Maggiore è la qualificazione riduttiva, più forte è l'assorbanza.

2.5. Saggio dell'attività chelante dei metalli.Il potenziale ferroso chelante gli ioni della clorofilla è stato misurato utilizzando la tecnica di Chen et al. [14]. In breve, dosaggi specifici dei campioni sono stati sciolti in DMSO e introdotti in una miscela di FeCl2·4H2O (2.0 mM, 0.05 mL). L'aggiunta di ferrozina (5 mM, 0,2 mL) ha avviato la reazione quando la soluzione è stata agitata con forza e quindi lasciata per 10 minuti a 25 gradi C. Quando la reazione ha raggiunto l'equilibrio, i valori di assorbanza per la soluzione sono stati determinati a 560 nm utilizzando un veicolo vuoto. EDTA è stato utilizzato come controllo positivo. La formula di calcolo per l'attività chelante era identica a (1).

2.6. Saggio dell'attività della tirosinasi dei funghi.Sia la soppressione dell'attività della tirosinasi dei funghi che l'inibizione della tirosinasi cellulare sono state determinate spettrofotometricamente utilizzando il metodo precedente, con modifiche minori [2]. L'acido cogico è stato utilizzato come controllo positivo per il test dell'attività della tirosinasi. I materiali sono stati dapprima sciolti in DMSO acquoso e coltivati ​​in L-tirosina (2,5 mg/mL) con tampone fosfato (50 mm, pH 6,8). Tutti i modelli hanno utilizzato DMSO, che è irrilevante per l'attività della tirosinasi quando si costituisce DMSO<0.5% of the total volume. Subsequently, 25 U/mL of mushroom tyrosinase with an identical buffer was then added, and the solution was incubated at 37° C for 30 min. An ELISA spectroscopic reader was used to conduct the absorbance measurements for the assays at 475 nm, using 96-well microplates (Molecular Devices, CA, USA).

2.7. Colture di cellule di melanociti umani (HMC).I melanociti epidermici umani primari dal prepuzio neonatale sono stati acquisiti da Cascade Biologics. Questo è stato applicato anche da Wang et al. [2]. È stato coltivato in terreno 254 (M-254- 500; Cascade Biologics, Portland, OR, USA) e potenziato con integratore per la crescita dei melanociti umani (HMGS, numero di cat. S-002-5). Il terreno 254 è un terreno di base con alcune vitamine non essenziali ed essenziali, composti organici, amminoacidi, sali inorganici e tracce di minerali. Il supplemento per la crescita dei melanociti umani includeva siero bovino fetale, insulina bovina, estratto ipofisario bovino, transferrina bovina, idrocortisone, fattore di crescita fibroblastico basico, forbolo 12-miristato 13-acetato ed eparina. Tutte le cellule sono state incubate a 37 gradi C in un incubatore umidificato con un'atmosfera di CO2 al 5%.

2.8. Determinazione della vitalità cellulare di HMC.La vitalità cellulare è stata determinata utilizzando un test MTT [3]. Quando un tetrazolo giallo viene combinato con la deidrogenasi mitocondriale (ubiquinone) nelle cellule viventi, gli anelli di tetrazolio dell'MTT si scindono e si riducono a formazano viola. Le cellule sono state seminate a una densità di 9 × 103 cellule/pozzetto in 96-pozzetti. Quando le cellule sono state coltivate per un giorno, il mezzo è stato cambiato e sono state aggiunte diverse concentrazioni di 36H in un volume medio finale di 100 μL. Dopo che questi sono stati incubati per 48 ore, il terreno è stato sostituito con un terreno fresco (100 μL), incluso MTT (0,5 mg/mL). La piastra è stata quindi coltivata in un incubatore a 37°C per 2 ore con il 5% di CO2. DMSO (100 μL) è stato quindi aggiunto a ciascun pozzetto per dissolvere i cristalli viola di formazano. Per garantire che le piastre raggiungessero la massima dissoluzione, le piastre sono state agitate delicatamente e miscelate al buio per 10 minuti e misurate a 595 nm. La crescita cellulare è stata calcolata come

2.9. Misurazione dell'attività della tirosinasi da HMC.Per determinare l'attività della tirosinasi nelle cellule di melanociti umani (HMC) (5 × 104 cellule per pozzetto), sono state posizionate in 12-pozzetti in 1000 μL di terreno con diversi dosaggi di 36H e coltivate per 48 ore [2] . Il tampone PBS è stato utilizzato per lavare le cellule trattate con il campione e queste sono state quindi lisate con l'1% di Triton X-100/PBS. L'estratto enzimatico è stato quindi raccolto dal lisato cellulare risultante e combinato con 50 μL di L-tirosina 2 mM. Gli estratti sono stati quindi incubati per 3 ore a 37°C al buio. È stato quindi utilizzato uno spettrofotometro per determinare la loro assorbanza a 490 nm.

2.10. Determinazione del contenuto di melanina in HMC.Con alcune modifiche minori, la tecnica precedente è stata utilizzata anche per questo esperimento [2]. I pellet cellulari sono stati sciolti in 2.0 N NaOH con il 10 percento di DMSO e riscaldati a 90 gradi C per 1 ora. Le sospensioni sono state separate mediante centrifugazione per 10 min a 10,000g. Utilizzando uno spettrofotometro, il contenuto di melanina è stato determinato tramite i dati prodotti a un livello di assorbanza di 475 nm.

2.11. Reazione quantitativa a catena della polimerasi in tempo reale.Per la qRT-PCR, una reazione di 20 μL conteneva una miscela 0,4 mL di due trascrittasi inverse: 10 μL di 2 × QuantiTect SYBR Green Master Mix (QIAGEN, Valencia , CA, USA) con la Taq polimerasi hot start, 0.8 mL di primer e 0.5 mL (10 ng/mL) del templato. Le sequenze dei primer sono elencate nella Tabella 1. Il sistema StepOnePlus™ è stato utilizzato per tutti i test PCR in tempo reale. La reazione è stata completata eseguendo la reazione RT a 42 gradi C per 20 min e quindi attivando la FastStart Taq DNA polimerasi a 95 gradi C per 5 min. Questo è stato quindi amplificato per 40 o 50 cicli a 95 gradi C per 5 secondi per denaturazione, ricottura e acquisizione a 60 gradi C per 5 secondi. Alla fine è stato allungato a 72 gradi C per 15 sec. La fluorescenza può essere misurata anche dopo la fase di allungamento, ma per questo esperimento è stata misurata dopo la fase di ricottura. Con una piastra a 96-pozzetti, 9 μL di lisato sono stati aggiunti a 11 μL della miscela di reazione, che consisteva in 10,6 μL di MasterMix dal kit core qPCR Eurogentec per SYBR Green I (1,4 μL di 50 mM MgCl2, 2 μL di tampone di reazione 10x, 0,8 μL di miscela dNTP 5 mM, 0,6 μL di SYBR Green I, 5,7 μL di acqua priva di nucleasi e 0,1 μL di GoldStar Taq polimerasi calda), 0,1 μL di MS2 RNA, 0,1 μL di inibitore dell'RNAse diluito 10 volte e 0,1 μL del primer REV (100 μM), nonché MS2 FWD per i saggi SG-PERT sul sistema ABI 7300 qPCR. La reazione qRTPCR, l'attivazione dell'enzima GoldStar Taq caldo, 40-l'amplificazione del ciclo, la ricottura e l'acquisizione, la denaturazione a 95 gradi C e l'allungamento a 72 gradi C hanno utilizzato lo strumento ABI 7300. Per preparare il saggio, tutti i reagenti sono stati tenuti su un blocco di raffreddamento o su ghiaccio. Reazioni SGPERT duplicate sono state eseguite su ciascun campione di lisato. Utilizzando il software e gli strumenti qPCR, un ABI 7300 con la sua soglia determinata manualmente e un LightCycler® 480 con il suo metodo della derivata seconda massima, ha generato i valori del ciclo di quantificazione (Cq). Utilizzando lo stesso software per entrambi gli strumenti, sono stati calcolati automaticamente anche i picchi di melting.

2.12. Blotting occidentale.Un totale di 1 × 105 cellule è stato trattato con gruppi campione o con il controllo del veicolo bianco per due giorni. Le cellule sono state raccolte e lisate con tampone di lisi (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 137 mM sodio cloruro, 50 mM sodio L fluoruro, 10 mM sodio pirofosfato, 20 mM - glicerofosfato, 1 mM fenilmetilsulfonil L fluoruro , 1 mM di EDTA, 10% di glicerolo, 1% di Nonidet P-40, 2 μM di leupeptina, 0,1 mM di sodio ortovanadato e 2 ug/mL di aprotinina) [14]. I lisati sono stati centrifugati a 20, 000 × g per 30 minuti e le concentrazioni proteiche all'interno della soluzione surnatante sono state determinate con un kit di analisi delle proteine ​​dell'acido bicinconinico (BCA) (Pierce, Rockford, IL, USA). Quantità uguali di proteine ​​​​sono state separate mediante elettroforesi su gel di sodio dodecil solfato-poliacrilammide (SDS-PAGE) e quindi elettrotrasferite su una membrana di nitrocellulosa (PALL Life Science, Ann Arbor, MI, USA). La membrana è stata bloccata per 1 ora con latte scremato al 5% in tampone PBS-T (PBS contenente lo 0,1% di Tween 20). La pellicola di trasferimento è stata accuratamente rimossa dal serbatoio di trasferimento umido e dalla fessura di trasferimento semisecca e collocata in una scatola contenente il 5% di latte scremato in 1x TBST per 1 ora a temperatura ambiente. È stato quindi lavato delicatamente con 1x TBST per rimuovere le tracce del latte scremato. La membrana è stata quindi incubata con i rispettivi anticorpi primari. In ogni caso, le membrane sono state incubate con anticorpo anticoniglio o topo coniugato con perossidasi di rafano e quindi trattate con reagenti di rilevamento ECL (PerkinElmer, ECL1: ECL2=1: 1). Un sistema di imaging chemiluminescente di dimensioni minime di Life Science è stato utilizzato per la misurazione per rilevare le bande [14].

2.13. Analisi statistica.Sono stati utilizzati tre di ciascuna concentrazione per lo standard ei campioni. Utilizzando il test t di Student, i risultati sono stati confrontati statisticamente e sono stati espressi utilizzando la media dei valori medi ± deviazione standard (DS).

3. Risultati

3.1. DPPH Attività di scavenging dei radicali liberi.I ROS possono generare perossidi lipidici, danni al DNA, espressione proteica, invecchiamento dei tessuti e genesi del cancro quando l'equilibrio tra radicali liberi e antiossidanti intrinseci è disturbato. Le reazioni a catena dei radicali liberi vengono bloccate neutralizzando le donazioni o accettazioni di elettroni e chelando le coppie solitarie libere. Ridurre lo stress ossidativo dalle sfaccettature intrinseche ed estrinseche è un modo per migliorare la salute. Questo studio ha esaminato le proprietà antiossidanti, determinando il potere di riduzione del ferro, la capacità di scavenging dei radicali liberi del DPPH e il potere chelante del metallo. L'aumento della generazione e dell'accumulo di ROS produce l'ossidazione dei lipidi negli alimenti e nei cosmetici e un'attività antiossidante naturale. In particolare, le proprietà di scavenging dei radicali liberi sono vitali negli additivi nutrizionali funzionali e nei prodotti per la cura della pelle.

Il primo test di inibizione dell'ossidazione è stato il test di scavenging dei radicali liberi DPPH. Si tratta di una piattaforma sperimentale semplice ed economica, in cui gli antiossidanti agiscono per prevenire i prodotti di ossidazione. Gli antiossidanti cambiano il colore del reagente radicale stabile DPPH dal viola al giallo chiaro della difenil-picrilidrazina. Per determinare le proprietà antiossidanti di 36H, è stata applicata una dose di 100 μM per determinare la capacità di scavenging. La tabella 2 mostra che il 36H ha mostrato un'eccellente capacità di eliminazione dei radicali liberi e elimina il 60 percento dei radicali liberi DPPH e la vitamina C alla stessa concentrazione (100 μM) elimina l'85,3 percento.

3.2. Potere antiossidante riducente ferrico.Il secondo test di inibizione dell'ossidazione è il test del potere di riduzione del ferrico, che è un modo comune e affidabile per misurare la sintesi del complesso Fe (III) – ferricianuro. Un agente funzionale riduce i complessi Fe3 plus/ferricianuro alla forma ferrosa. Questa combinazione aveva un colore blu a 7{{10}}0 nm perché K4Fe(CN)6 ha reagito con Fe3 plus per formare Fe[Fe(CN)6]3. Nell'esperimento, il colore della soluzione cambiava da giallo chiaro a diverse sfumature di blu e verde, a seconda del potere riducente del composto bersaglio. La tabella 2 presenta che BHA a 100 μM aveva un valore di potere riducente di 0,95 e 36H a 100 μM aveva un valore di potere riducente di 0,85 rispetto a BHA. Pertanto, è stato dimostrato che il 36H ha un buon potere antiossidante di riduzione del ferro.

3.3. Capacità chelante degli ioni ferrosi.L'attività chelante per gli ioni ferrosi di 36H è mostrata nella Tabella 2. L'EDTA (100 μM) è stato utilizzato come controllo positivo. Fe2 plus e ferrozina formano complessi quantitativamente. La formazione di complessi reagenti è spesso interrotta, a causa di agenti chelanti, che si traduce in una riduzione del colore rosso del complesso. 36H a un dosaggio di 10 μM non ha avuto effetti significativi sulla capacità di scavenging di Fe2 plus e alla concentrazione di 100 μM ha presentato un'inibizione del 43,2%. Il controllo positivo, EDTA, aveva una capacità di chelazione ionica di circa l'80% a 100 μM.

3.4. Effetto di 36H sull'attività della tirosinasi dei funghi.L'inibizione dell'attività della tirosinasi è stata descritta in numerosi rapporti, la maggior parte dei quali utilizzava la tirosinasi dei funghi come modello. I vantaggi sono ben sviluppati dagli scienziati, procedure semplici, basso costo, rapido processo di pigmentazione, caratteristiche strutturali e funzionali simili a quelle dei mammiferi e comodità nell'osservare lo sviluppo della melanina. È stata studiata l'inibizione dell'attività della tirosinasi dei funghi da parte di 36H e l'abilità inibitoria aveva una correlazione positiva con la concentrazione di 36H (Figura 2 (a)). Al quindicesimo minuto si è visto che 36H a diverse concentrazioni (1, 5 e 10 mM) rispetto al controllo riduce i valori di OD. L'attività enzimatica diminuisce di circa il 10 percento a 1 mM, il 30 percento a 5 mM e il 40 percento a 10 mM, rispetto al controllo del veicolo (Figura 2 (b)). È stata studiata la relazione tra l'attività della tirosinasi e la sua concentrazione in 36H. Diverse concentrazioni dell'inibitore danno un gruppo di linee che passano tutte per l'origine. L'inibizione dell'attività della tirosinasi da parte del 36H non ha influenzato la quantità di enzima, il che ha dimostrato che il 36H era un inibitore reversibile (Figura 2 (c)). Il tipo di inibizione della tirosinasi da parte di 36H è stato confermato utilizzando un grafico a doppio reciproco di Lineweaver-Burk. I grafici di 1/v contro 1/[s] hanno fornito una famiglia di linee rette attraverso l'origine, il che ha presentato che 36H era un complesso competitivo. La cinetica dell'enzima è presentata nella Figura 2 (d).

3.5. L'effetto della vitalità cellulare, della tirosinasi cellulare e del contenuto di melanina su 36H in HMC.Essendo un potente composto schiarente per la pelle, il componente dovrebbe essere innocuo, senza effetti collaterali citotossici indesiderati. Esistono alcuni noti inibitori della sintesi della melanina, tra cui l'acido cogico, l'arbutina, il PTU o l'idrochinone, che attualmente vengono utilizzati a livello globale come ingredienti cosmetici. Abbiamo anche scoperto che questi inibitori melanogenici potrebbero indurre tumorigenicità della pelle umana a dosi ad alta concentrazione o uso frequente [2]. L'HMC è stato coltivato in 36H per 48 ore a varie concentrazioni di 1, 5, 10 e 25 μM e la vitalità cellulare è stata determinata per mostrare basse tossicità cellulari nella Figura 3 (a). Quando si considera l'agente per uso terapeutico o cosmetico negli esseri umani, abbiamo scoperto che le conseguenze citotossiche sulle viabilità cellulari dermiche umane erano insignificanti. Per comprendere l'effetto inibitorio di 36H sulla melanogenesi, abbiamo valutato l'attività della tirosinasi intracellulare in HMC. I risultati per l'attività della tirosinasi nell'HMC hanno mostrato che c'era un'ovvia variazione all'aumentare della concentrazione e l'attività della tirosinasi diminuiva per la bassa tossicità cellulare. Dopo il trattamento, l'attività della tirosinasi è stata ridotta al 39 ± 2,2 percento a 25 μM in modo dose-dipendente (Figura 3 (b)). Questi risultati hanno mostrato che il 36H ha inibito l'attività della tirosinasi intracellulare. I risultati del test della melanina hanno mostrato chiaramente che 36H riduce il contenuto di melanina in HMC in modo dose-dipendente (Figura 3 (c)). La percentuale di controllo rappresenta il contenuto di melanina. Dopo il trattamento, il contenuto di melanina era del 77% a 25 μM, dell'84% a 10 μM, dell'88% a 5 μM e del 90% a 1 μM. Questi risultati hanno mostrato che 36H ha avuto un significativo effetto inibitorio sulla sintesi di melanina in HMC a 25 μM.

3.6. L'mRNA e le proteine ​​​​correlati alla biosintesi della melanina sono stati influenzati da 36H in HMC.La biosintesi della melanina si verifica nei melanosomi e il substrato amminoacidico iniziale è la tirosina. La tirosina viene inizialmente catalizzata a L-DOPA tramite la tirosinasi e, utilizzando lo stesso enzima, la tirosinasi, la DOPA viene catalizzata a dopachinone. Il dopachinone è catalizzato dalla dopacromo tautomerasi (proteina correlata alla tirosinasi- 2, TRP-2), TRP-1 e tirosinasi per formare l'eumelanina. In HMC, 36H ha sottoregolato gli RNA e le proteine ​​​​correlati alla melanogenesi cellulare, come dimostrato nella Figura 4.

3.7. Effetto di 36H sulla maturazione del melanosoma.Il melanosoma è un organello che si basa sulla sintesi della melanina all'interno dei melanociti. Più melanosomi maturano, più melanina si forma. Pertanto, la maturazione del melanosoma è importante nel meccanismo dello sbiancamento della pelle. La proteina premelanosoma 17 (Pmel17) è mirata ai precursori dell'organello del pigmento, il melanosoma, dove viene processata proteoliticamente in diversi piccoli frammenti. Alcuni di questi frammenti formano amiloidi non patologici che si assemblano in fogli e formano il motivo striato che è alla base dell'ultrastruttura del melanoma. Questo studio ha dimostrato che 36H ha downregolato l'espressione dell'RNA e della proteina Pmel17 in HMC (Figura 5).

3.8. Effetto di 36H sul trasporto del melanosoma.Rab27a, MLPH e Myo5a formano un complesso tri-proteico per legare i melanosomi alle periferie dei melanociti. Nel processo di trasporto del melanosoma, il complesso ternario è la connessione tra il citoscheletro di actina e il melanosoma. La mancanza di queste proteine ​​influisce sul trasporto e la melanoregulina (Mreg) guida il trasferimento del melanosoma dai melanociti ai cheratinociti attraverso un meccanismo di spargimento regolato. Questo studio ha dimostrato che 36H ha diminuito il trasporto del melanosoma influenzando questo RNA e proteine ​​​​correlati (Figura 6).

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