Uno studio comparativo degli effetti della curcumina e delle sue nanoparticelle sulla crescita, l'immunità e la resistenza allo stress termico della tilapia del Nilo (Oreochromis niloticus)

Questo studio ha valutato gli effetti dell'integrazione alimentare con curcumina libera o nano sulle prestazioni di crescita, sullo stato immunitario e sulla resistenza allo stress termico della tilapia del Nilo (Oreochromis niloticus). Sono state preparate sette diete isonitrogene (28% di proteine) e isocaloriche (445 kcal/100 g DM). Sei diete sono state integrate con tre livelli di nano-curcumina (50 (CN50), 100 (CN100), 200 (CN200) mg kg−1 dieta) o di curcumina libera (50 (C50), 100 (C100), 200 (C200 ) mg kg−1 dieta), e la dieta di controllo è stata lasciata senza additivo (CON). I pesci (13,54 ± 0,32 g) (media ± DS) sono stati alimentati con diete sperimentali per 65 giorni.

Dopo la prova di alimentazione, i pesci sono stati esposti a stress da calore acuto aumentando gradualmente la temperatura dell'acqua da 25 a 40 gradi entro 3 ore. Il pesce è stato quindi esposto a 40 gradi per 4 ore. I risultati hanno rivelato la superiorità della nano-curcumina rispetto alla sua forma libera nel migliorare le prestazioni di crescita, con i risultati più alti ottenuti a CN100, seguito da CN200. Solo lo stress da calore, non le diete sperimentali, ha aumentato le piastrine, il volume corpuscolare medio (MCV), l'emoglobina corpuscolare media (MCH), i leucociti e la conta dei neutrofili, mentre i linfociti sono diminuiti.

Esiste una stretta relazione tra la resistenza allo stress termico e l'immunità. Lo stress da calore può causare molte sfide al corpo, come temperatura elevata, bassa temperatura, fame e ipossia. Queste sfide possono portare a cambiamenti nell'ambiente intracellulare ed extracellulare che innescano la risposta allo stress del corpo. Dopo un lungo periodo di adattamento, il corpo può sviluppare una maggiore resistenza allo stress da calore. Allo stesso tempo, anche lo stress da calore può influire sull'immunità. Dopo un prolungato stress da calore, il sistema immunitario del corpo sarà danneggiato in una certa misura. Lo shock immunitario causato dallo stress da calore aumenta il rischio di infezione nei pazienti e riduce la funzione delle cellule immunitarie. Tuttavia, lo stress da calore moderato può aumentare l'immunità in quanto attiva l'autoguarigione e il sistema immunitario del corpo. Pertanto, uno stress termico moderato può rafforzare la resistenza e l'immunità del corpo e migliorare l'adattabilità e il tasso di sopravvivenza degli organismi in ambienti complessi. Oltre alla biologia, noi esseri umani dovremmo anche prestare attenzione al miglioramento dell'immunità. Cistanche ha un effetto significativo sul miglioramento dell'immunità. La cistanche è ricca di una varietà di sostanze antiossidanti, come vitamina C, vitamina C, carotenoidi, ecc. Questi ingredienti possono eliminare i radicali liberi, ridurre lo stress ossidativo e migliorare la resistenza del sistema immunitario.

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I gruppi CN50 e CN100 hanno mostrato una minore attività degli enzimi epatici (alanina aminotransferasi (ALT) e aspartato aminotransferasi (AST)) rispetto agli altri trattamenti, mentre C200 ha dato la più alta attività di questi enzimi. I più alti livelli di immunoglobuline (IgM) sono stati rilevati in CN100, CN200, C100 e C200, seguiti da CN50. Il gruppo C200 ha mostrato livelli più elevati di complemento 3 e complemento 4 (rispettivamente C3 e C4) rispetto agli altri trattamenti. I gruppi C50 e CON hanno fornito i valori più bassi di IgM, C3 e C4. I livelli di cortisolo erano significativamente più bassi nei gruppi CN50 e CN100 rispetto agli altri gruppi. Dopo lo stress da calore, ALT, AST, IgM, C3, C4, cortisolo e glucosio sono aumentati. Pertanto, la nano-curcumina è più efficace della sua forma libera nel migliorare la resistenza allo stress da calore, inducendo l'immunità innata, abbassando gli indicatori di stress e promuovendo le prestazioni di crescita della tilapia del Nilo con la migliore concentrazione a 100 mg kg-1 dieta.

La seconda specie di Fsh più comune prodotta a livello globale dopo la carpa è la tilapia del Nilo (Oreochromis niloticus) 1,2. La tilapia è attualmente coltivata in più di 120 paesi in tutto il mondo2. La produzione globale di tilapia è passata da meno di 0,5 milioni di tonnellate metriche (MMT) nei primi anni '90 a 6,03 MMT nel 2018, con un tasso di crescita medio annuo del 13,5% 2. Tuttavia, la coltura intensiva della tilapia la rende sensibile a vari fattori di stress, come lo stress da calore (HS), una delle principali conseguenze del riscaldamento globale3. Sebbene la tilapia del Nilo possa tollerare un'ampia gamma di temperature (l'intervallo di temperatura ottimale è di 25-28 gradi), temperature dell'acqua al di sopra dell'intervallo ottimale possono sopprimere il sistema immunitario e danneggiare la sua risposta antiossidante4,5. L'HS sopprime il sistema immunitario attraverso risposte immunitarie cellulo-mediate e umorali6. Ad esempio, è stato riscontrato che l'HS riduce il livello di immunoglobuline (IgG e IgM)7.

Anche gli indicatori primari della risposta immunitaria (globuli bianchi, globuli rossi, emoglobina e glucosio) sono influenzati durante l'HS8. L'orata dal muso smussato (Megalobrama amblycephala Yih) ha mostrato un aumento del lisozima, delle attività del complemento alternativo, delle proteine ​​totali e dei livelli di Ig M dopo essere stato esposto a stress da calore per 6 ore, quindi questi parametri sono diminuiti. Di conseguenza, lo stress da caldo può influire negativamente sulla salute dei pesci, portando a una regressione della crescita ea un'elevata mortalità di Fsh10. Rafforzare i meccanismi di difesa dei pesci attraverso la somministrazione di immunostimolanti nella dieta è diventata una priorità per il controllo dei fattori di stress in acquacoltura11. Tra i vari immunostimolanti, le erbe medicinali contengono costituenti chimici che migliorano l'immunità attraverso percorsi specifici o non specifici, rendendo l'animale più resistente ai fattori di stress esterni12.

La curcumina è un ingrediente vegetale giallo-arancio, idrofobo, bioattivo e un composto polifenolico estratto dalla curcuma (Curcuma longa). I principali costituenti attivi della curcumina sono il diferuloilmetano (77%), la demetossicurcumina (17%) e la bisdemetossicurcumina (6%)13. Sorprendentemente, la curcumina possiede proprietà antivirali, antimicotiche, antinfiammatorie, antiossidanti e antitumorali14-17. Pertanto, la curcumina può stimolare il sistema immunitario innato in fsh18,19. Diversi studi hanno dimostrato gli effetti benefici della curcumina come potenziale candidato immunostimolante e antiossidante nelle diete di varie specie ittiche20-26. Tuttavia, la scarsa solubilità in acqua e la biodisponibilità limitano le applicazioni pratiche della curcumina13.

Recentemente, la nano-curcumina è stata sviluppata per evitare le scarse proprietà di rilascio della curcumina e potenziarne gli effetti terapeutici27. A differenza della curcumina, che forma grumi a causa della sua bassa solubilità in acqua, la nanocurcumina si dissolve completamente in un mezzo acquoso e non forma grumi a causa della presenza del potenziale zeta27. Rispetto alla curcumina libera, la nano-curcumina ha dimostrato una maggiore permeabilità, una circolazione più lunga e una migliore biodisponibilità sistemica nel plasma e nei tessuti28-30

Secondo Jiang et al.31 la curcumina caricata in nanosfere stimolava le sue attività antiossidanti e immunologiche. Questi effetti possono essere collegati alla riduzione delle particelle a scala nanometrica, che garantisce un rilascio sostenibile dei materiali attivi e aumenta la biodisponibilità ei livelli di dispersione molecolare31. Sebbene non siano stati condotti studi per confrontare l'effetto della nano-curcumina con quello della sua forma libera sul pesce, è stato recentemente testato su uccelli come la quaglia giapponese (Coturnix japonica)32. Marchiori et al.32 hanno scoperto che la curcumina nanoincapsulata ha migliorato le prestazioni delle quaglie giapponesi (Coturnix japonica) a una dose tre volte inferiore rispetto alla curcumina libera, indicando il potenziale dei nanomateriali per migliorare la produzione animale.

Fino ad ora, la nano-curcumina non è stata testata nelle diete dei pesci. Pertanto, questo studio mirava a valutare gli effetti dell'integrazione alimentare con curcumina libera o nanoformata sul miglioramento delle prestazioni di crescita, dello stato immunitario e della resistenza allo stress termico nella tilapia del Nilo.

Materiali e metodi Diete sperimentali.

La composizione e l'analisi chimica delle diete sperimentali sono mostrate nella Tabella 1. Sono state preparate sette diete isonitrogene (28% di proteine) e isocaloriche (445 kcal/100 g DM). Sei diete sono state integrate con tre livelli di nano-curcumina (50 (CN50), 100 (CN100), 200 (CN200) mg kg−1 dieta) o di curcumina libera (50 (C50), 100 (C100), 200 (C200 ) mg kg−1 dieta), e la dieta di controllo è stata lasciata senza additivo (CON). Gli ingredienti secchi e finemente macinati sono stati accuratamente miscelati a mano durante l'aggiunta degli oli. Successivamente, tutti gli ingredienti sono stati impastati aggiungendo gradualmente acqua tiepida. L'impasto è stato pellettizzato utilizzando un tritacarne di diametro adeguato. Le diete venivano essiccate al sole e conservate a -20 gradi in barattoli di plastica.

Il pesce e le strutture sperimentali.

Gli avannotti di tilapia del Nilo (Oreochromis niloticus) sono stati ottenuti da un allevamento commerciale vicino ad Alessandria e tenuti in una vasca di fibra di vetro (1 m3) nel laboratorio di allevamento ittico presso l'Istituto nazionale di oceanografia e pesca, filiale di Alessandria, Egitto. Centosessantotto pesci (13,54±0,32 g) sono stati ripopolati in 21 acquari di vetro (70 L di acquario-1) a una densità di 8 pesci per acquario. Ogni trattamento consisteva in 3 repliche (A, B e C). I pesci sono stati acclimatati negli acquari per 2 settimane e sono stati alimentati con la dieta di controllo per adattarsi alle diete sperimentali. I pesci sono stati nutriti con le diete sperimentali tre volte al giorno fino a sazietà per 65 giorni. Ad ogni acquario è stata fornita acqua di rubinetto declorata con aerazione continua. La quantità di mangime consumata in ciascun trattamento è stata calcolata settimanalmente dalla differenza nel peso dei contenitori di cibo prima e dopo l'alimentazione. Il fotoperiodo è stato impostato a 12 h:12 h luce: buio, rispettivamente. I parametri di qualità dell'acqua sono stati monitorati ogni settimana per tutta la durata dell'esperimento utilizzando il fotometro multiparametro Hanna Aquaculture, HI83303. La temperatura dell'acqua, l'ossigeno disciolto, l'ammoniaca-N e il pH sono stati registrati come segue; 25 ± 2,1 gradi, 6,4 mg L-1, 0,05 mg L-1 e 7,7, rispettivamente. Dopo l'esposizione allo stress da calore (40 gradi), l'ossigeno disciolto e l'ammoniaca-N nella vasca dei pesci erano rispettivamente di 2,1 mg L-1 e 0,62 mg L-1. Due ore dopo l'alimentazione, le feci sono state rimosse mediante sifonamento.

Dichiarazione etica.

Gli esperimenti sono stati eseguiti secondo le linee guida delineate e approvate dal National Institute of Oceanography and Fisheries Committee for Institutional Care of Aquatic Organisms and Experimental Animals (NIOF-IACUC), Egitto.

Preparazione di curcumina e nano-curcumina.

La curcumina e la nano-curcumina sono state preparate dal dipartimento di ricerca di NanoTech Egypt per la fotoelettronica e la nanotecnologia. La nano-curcumina è stata preparata attraverso il metodo di riduzione descritto da Dhivya et al.33. Gli spettri di assorbimento UV-Vis sono stati ottenuti su uno spettrofotometro per fibre ottiche Ocean Optics USB2000 plus VIS-NIR. Per studiare la morfologia superficiale e le dimensioni delle nanoparticelle, è stato utilizzato un microscopio elettronico a trasmissione ad alta risoluzione (TEM), JEOL JEM-2100. L'imaging TEM ha rivelato la forma quasi sferica, la superficie liscia e la distribuzione uniforme delle dimensioni di quasi 50 ± 5,5 nm di nano-curcumina (Fig. 1). La distribuzione delle dimensioni delle particelle e il potenziale zeta delle particelle di nano-curcumina sono stati determinati dallo strumento Zetasizer Malvern (Malvern, Regno Unito), versione 7.13, numero di serie: MAL 1203718. Il potenziale zeta (mV) e la deviazione zeta (mV) erano -25 .0 e 4.16, rispettivamente (Fig. 2).

Prestazioni produttive.

Tutti i pesci in ogni vasca sono stati raccolti e pesati prima di iniziare e al termine della prova di alimentazione. La crescita, l'utilizzo dei mangimi e altri indici biometrici sono stati calcolati secondo le seguenti equazioni:

Composizione chimica corporea.

Prima dell'inizio della prova di alimentazione, 10 pesci sono stati campionati in modo casuale e congelati a -20 grado per l'analisi biochimica di tutto il corpo. Al termine della prova di alimentazione, sono stati campionati sei pesci per trattamento per l'analisi biochimica di tutto il corpo. Tutti i campioni sono stati immediatamente congelati a -20 gradi fino all'analisi. Sono stati seguiti i metodi AOAC34 per valutare il contenuto di proteine ​​grezze, lipidi, umidità e ceneri di tutti i campioni.

Prelievo di sangue.

Dopo l'esperimento di alimentazione, sei pesci per trattamento sono stati campionati per l'analisi del sangue. L'olio di chiodi di garofano (0.1 ml L−1) è stato usato per anestetizzare il pesce. Campioni di sangue (1 ml) sono stati raccolti dalla vena caudale del pesce in microtubi di plastica contenenti un anticoagulante (acido etilendiamminotetraacetico dipotassico, EDTA) per la conservazione dei campioni da utilizzare nel test ematologico. Un mL di sangue da ciascun campione è stato raccolto in microprovette senza anticoagulante e centrifugato per 10 minuti a 2500 × g per separare il siero, che è stato assegnato per il test biochimico.

Saggio ematologico.

Eritrociti, ematocrito (HCT), emoglobina (HGB), volume corpuscolare medio (MCV), emoglobina corpuscolare media (MCH), concentrazione corpuscolare media di emoglobina (MCHC), piastrine (PLT), leucociti e conte differenziali (neutrofili (NEUT), linfociti (LYMPH)), monociti (MON), eosinofili (EO), basofili (BAS) e granulociti immaturi (IG) sono stati contati utilizzando l'emocitometro automatizzato XE 2100 (Advia 2120 e Sysmex, Siemens). Tutti gli indici menzionati sono stati valutati prima e dopo lo stress da calore.

Biochimica del siero.

Nel siero dei campioni di sangue sono state analizzate le concentrazioni sieriche di alanina aminotransferasi (ALT), aspartato aminotransferasi sierica (AST), immunoglobulina M (IgM), complementi 3 e 4 (rispettivamente C3 e C4), cortisolo e glucosio. Il glucosio è stato analizzato secondo il metodo dell'esochinasi35 utilizzando il pacchetto Cobas (numero di riferimento, 04404483 190) tramite l'analizzatore Cobas-c 311, ID sistema 0768316. Il cortisolo è stato dosato sulla base del metodo di formazione del rispettivo complesso immunitario36 attraverso il pacchetto immunodosaggio elettrochemiluminescente "ECLIA" (numero di riferimento, 11875116 122) utilizzando l'analizzatore immunologico Cobas-e. L'analisi ALT è stata eseguita utilizzando il pacchetto Cobas C (numero di riferimento, 207649q57 322), analizzatore Cobas-C 311, ID sistema 0,764,957. L'ALT è stata rilevata secondo Bergmeyer et al.37 e ECCLS38. L'ALT ha catalizzato la reazione tra L-alanina e 2-ossoglutarato. Il piruvato formato da Te viene ridotto dal NADH in una reazione catalizzata dalla lattato deidrogenasi (LDH) per formare L-lattato e NAD. La velocità di ossidazione del NADH è direttamente proporzionale all'attività catalitica dell'ALT.

Viene determinato misurando la diminuzione dell'assorbanza. L'AST nel campione ha catalizzato il trasferimento di un gruppo amminico tra L-aspartato e 2-ossoglutarato per formare ossalacetato e L-glutammato. L'ossalacetato ha quindi reagito con NADH, in presenza di malato deidrogenasi (MDH), per formare NAD. Questo test ha seguito le raccomandazioni dell'IFCC ma è stato ottimizzato secondo Bergmeyer et al.37 e ECCLS38 utilizzando Cobas c pack (numero di riferimento, 20764949322) attraverso l'analizzatore Cobas-C 311. ID sistema 076494I. Le IgM sono state determinate in base al principio dell'agglutinazione immunologica39 mediante Cobas c 311, ID sistema 0767883 utilizzando Cobas c pack (numero di riferimento 03507190). Gli anticorpi IgM e gli antigeni hanno reagito tra loro nel campione e hanno formato un complesso antigene/anticorpo. Dopo l'agglutinazione, questa è stata misurata turbidimetricamente a una lunghezza d'onda secondaria/principale: 700/340. C3 e C4 sono stati determinati formando un precipitato mediante l'aggiunta di un antisiero specifico e successivamente sono stati determinati turbidimetricamente ad una lunghezza d'onda sub/principale: 700/34039. C3 è stato misurato attraverso il Cobas c 311, ID sistema 0765600 utilizzando Cobas c pack (numero di riferimento, 03001938322). Il C4 è stato analizzato tramite Cobas c 311, ID sistema 0765619 utilizzando Cobas c pack (numero di riferimento, 03001962322).

Stress da calore.

Al termine dell'esperimento di alimentazione, cinque pesci di ciascuna replica sono stati raccolti dagli acquari di vetro sperimentali e trasferiti in una vasca in fibra di vetro da 0.5-tonnellata contenente 7 unità di sub-allevamento (7- L contenitori cilindrici in plastica forata). Ogni contenitore rappresenta una replica di ogni trattamento. I replicati A, B e C di ciascun trattamento sono stati esposti a stress da calore rispettivamente il primo, secondo e terzo giorno. Pertanto, la sfida dello stress da calore è stata ripetuta tre volte in tre giorni consecutivi. La temperatura dell'acqua è stata gradualmente aumentata da 25 a 40 gradi entro 3 ore. La temperatura dell'acqua era controllata da un termostato artificiale. Dopo l'esposizione a 40 gradi per 4 ore, il pesce di ciascuna unità è stato anestetizzato usando olio di chiodi di garofano. I campioni di sangue sono stati raccolti per determinare i livelli di ALT, AST, IgM, C3 e C4, glucosio e cortisolo, nonché il conteggio ematologico dei pesci.

Analisi statistica.

I dati sulle prestazioni di crescita e sull'utilizzo dei mangimi sono stati elaborati utilizzando un'analisi della varianza unidirezionale (ANOVA). L'ANOVA a due vie è stata utilizzata per valutare l'effetto dello stress da calore e delle diete sperimentali sui pesci. Il test post hoc di Duncan è stato utilizzato per classificare le medie. P Minore o uguale a 0.05 è stato considerato statisticamente significativo. Tutte le statistiche sono state elaborate utilizzando il pacchetto SPSS (versione 23.0).

Dichiarazione.

Tutti i metodi sono riportati dalle linee guida ARRIVE 2.0.

Risultati

Prestazioni di crescita e utilizzo del mangime.

I risultati relativi alle prestazioni di crescita e all'utilizzo del mangime dei pesci alimentati con le diete sperimentali sono presentati nella Tabella 2. Il peso finale (FW) e l'aumento di peso (WG) più elevati sono stati ottenuti nel CN100 alimentato con pesce seguito da CN200 (P minore o uguale a 0.05). I pesci nutriti con CN50 hanno dato FW e WG moderati ed erano simili a quelli nutriti con C100 (P maggiore o uguale a 0.0 5). I risultati più bassi di WG sono stati registrati in CON alimentati con pesce, C50 o C200 (P minore o uguale a 0,05). I pesci alimentati con CN100 e CN200 hanno mostrato il più alto tasso di crescita specifico (SGR), seguito da CN50 e C100 (P minore o uguale a 0,05). Tuttavia, l'SGR in CN200 alimentato con carne di pesce non differiva significativamente da CN50 o C100 (P maggiore o uguale a 0,05). I gruppi di pesci CON, C50 e C200 hanno prodotto il SGR più basso (P minore o uguale a 0,05). Il risultato più alto di guadagno medio giornaliero (ADG) è stato registrato nel gruppo CN100, seguito da CN200 e quindi dai gruppi CN50 e C100 (P inferiore o uguale a 0,05). I gruppi CON, C50 e C200 hanno mostrato i valori più bassi di ADG (P inferiore o uguale a 0,05). La più alta assunzione di mangime (FI) è stata registrata nei gruppi CN50, CN100, CN200 e C100, seguiti dai gruppi CON, C50 e C200 (P inferiore o uguale a 0,05). Il FCR più basso è stato rilevato in CN100 e CN200, seguito da CN50 e C100, mentre i valori più alti di FCR sono stati osservati in CON, C50 e C200 (P inferiore o uguale a 0,05). I gruppi di CN100 e CN200 hanno fornito i valori più alti del rapporto di efficienza proteica (PER), seguiti da CN50 e C100, mentre i valori più bassi sono stati prodotti in CON, C50 e C200 (P inferiore o uguale a 0,05).

Composizione chimica corporea.

I risultati della composizione chimica approssimativa della tilapia del Nilo alimentata con le diete sperimentali sono illustrati nella Tabella 3. Non vi è stata alcuna variazione significativa nella sostanza secca tra i diversi gruppi (P maggiore o uguale a 0.05 ). I valori più alti di proteina grezza (CP) sono stati ottenuti in CN50, CN10{0, CN200 e C100, seguiti da CON, C50 e C200 (P minore o uguale a 0,05); tuttavia, C50 non era significativamente diverso da CN50, CN100 e C100 (P maggiore o uguale a 0,05). Tutti i trattamenti avevano un rapporto lipidico grezzo più elevato rispetto a CON (P inferiore o uguale a 0,05). I risultati più alti di cenere sono stati registrati in CON e C200, seguiti da C50, e i risultati più bassi sono stati osservati in CN50, CN100, CN200 e C100 (P inferiore o uguale a 0,05).

Analisi ematologiche.

La Tabella 4 mostra l'analisi ematologica dei pesci dopo l'esperimento di alimentazione a 25 gradi e dopo lo stress da calore a 40 gradi. I risultati hanno rivelato che le diete sperimentali e lo stress da calore hanno influenzato in modo significativo alcuni parametri ematologici (P inferiore o uguale a 0.05). Le diete sperimentali non hanno influenzato le conte ematologiche (P maggiore o uguale a {{10}}.05) ad eccezione di C200, che ha dato un numero maggiore di leucociti e una minore conta dei neutrofili rispetto alle altre diete sperimentali (P inferiore a o uguale a 0,05). Tuttavia, dopo lo stress da calore, è stato rilevato un aumento del numero di piastrine, MCV, MCH, leucociti e neutrofili, mentre il numero di linfociti è stato ridotto (P inferiore o uguale a 0,05) e non vi è stato alcun effetto sugli altri parametri ematologici parametri (P maggiore o uguale a 0,05).

Analisi del sangue biochimico.

I risultati dell'analisi del sangue biochimico prima e dopo lo stress da calore della tilapia del Nilo alimentata con le diete sperimentali sono mostrati nella Tabella 5. Vi è un profondo effetto sia delle diete che dello stress da calore sui parametri biochimici del sangue di pesce (P minore o uguale a 0.05). ALT ha mostrato l'attività più alta in C200, seguita da CON e C100, quindi C50 e CN200, mentre i valori più bassi sono stati ottenuti nei trattamenti CN50 e CN100 (P minore o uguale a 0,05) . L'attività più alta di AST è stata data in C200, seguita dai trattamenti C100 e CON, seguiti da C50, mentre l'attività più bassa è stata rilevata nei trattamenti CN50, CN100 e CN200 (P inferiore o uguale a 0,05). Tuttavia, il valore AST in CN200 non era significativamente diverso da C50 (P maggiore o uguale a 0,05).

I livelli di IgM più elevati sono stati ottenuti in C200, C100, CN100 e CN20 0 seguito da CN50, mentre C50 e CON hanno fornito i valori più bassi (P inferiore o uguale a 0,05). C200 ha mostrato il livello più alto di C3, seguito da CN50 (P minore o uguale a 0,05), mentre C100, CN100 e CN200 non differivano significativamente da C200 o CN50 (P maggiore o uguale a 0,05). C50 e CON hanno fornito i valori più bassi per C3 (P minore o uguale a 0,05). I valori più alti di C4 sono stati trovati in C200 e CN200, seguiti da CN50 e poi CN100 e C100, mentre C50 e CON hanno dato i risultati più bassi (P minore o uguale a 0,05). C200 ha dato il valore più alto di cortisolo, seguito da CON, seguito da C100, e quindi CN200 e C50 (P minore o uguale a 0,05). I risultati più bassi di cortisolo sono stati registrati per CN50 e CN100 (P inferiore o uguale a 0,05). Il glucosio ottenuto in C200 e CON era superiore rispetto agli altri trattamenti (P ​​inferiore o uguale a 0,05). Dopo lo stress da calore è stato osservato un aumento di ALT, AST, IgM, C3, C4, cortisolo e glucosio (P minore o uguale a 0,05).

Discussione

Nel presente studio, l'alimentazione della tilapia del Nilo con diete contenenti curcumina ha portato a risultati di crescita notevolmente migliori rispetto alla dieta di controllo. Inoltre, questo studio rivela notevolmente la superiorità della nano-curcumina rispetto alla sua forma libera nel migliorare le prestazioni di crescita della tilapia del Nilo. Nel presente studio, le migliori prestazioni di crescita (WG, SGR e ADG) e l'utilizzo del mangime (FCR e PER) della tilapia del Nilo sono state ottenute a 100 mg kg-1, seguite da una dieta di 200 mg kg-1 di nano-curcumina . Ciò è in accordo con Mahmoud et al.23 che hanno scoperto che nutrire la tilapia del Nilo (Oreochromis niloticus) con 50 o 100 mg kg-1 di dieta di curcumina ha migliorato le prestazioni di crescita e l'utilizzo del mangime. Hanno collegato questo miglioramento delle prestazioni di crescita e dell'utilizzo del mangime a una migliore attività degli enzimi digestivi (amilasi, proteasi, tripsina e lipasi)22,40. Inoltre, la curcumina può potenziare altri enzimi (Na più/K più -ATPasi, fosfatasi alcalina intestinale, gamma-glutamil transpeptidasi e creatina chinasi) responsabili della degradazione e dell'assimilazione dei nutrienti22. Inoltre, la curcumina può funzionare come prebiotico, promuovendo i fori intestinali e migliorando la digestione e l'assorbimento intestinale, con conseguente miglioramento della salute generale e crescita del pesce40. Effetti positivi dell'integrazione alimentare di curcumina sono stati rilevati in diverse specie ittiche come la carpa erbivora (Ctenopharyngodon ideas)41, il carassio (Carassius auratus)22, la grande ombrina gialla (Pseudosciaene crocea)42, la trota iridea (Oncorhynchus mykiss)17 e la trota asiatica branzino (Lates calcarifer)43.

Come accennato in precedenza, il presente studio è superiore per le nanoparticelle di curcumina rispetto alla curcumina libera nel migliorare il tasso di crescita della tilapia del Nilo. In altre parole, una dose più bassa di nano-curcumina può migliorare le prestazioni di crescita della tilapia del Nilo e dare gli stessi effetti di una dose più alta di curcumina libera. Ad esempio, una dieta da 50 mg kg-1 di nano-curcumina ha dato gli stessi effetti di una dieta da 100 mg kg-1 di curcumina libera. A sostegno, la nano-curcumina ha mostrato un 60-aumento dell'emivita biologica rispetto alla curcumina libera nei modelli di ratto44. Inoltre, la nano-curcumina mostra una maggiore biodisponibilità sistemica nel plasma e nei tessuti rispetto alla free-curcumina30. Ciò può essere dovuto alla bassa solubilità della curcumina libera in acqua; forma quindi aggregati ed è suscettibile di opsonizzazione, mentre la nano-curcumina si dissolve completamente in acqua senza aggregazioni grazie al suo potenziale zeta27.

L'aggiunta di curcumina libera e nano-curcumina al livello più alto (dieta da 200 mg kg-1) nell'attuale studio ha ridotto le prestazioni di crescita e l'utilizzo del mangime rispetto al CON. Infatti, la curcumina è un polifenolo. È stato riportato che basse dosi di polifenoli possono bioaccumularsi nei tessuti corporei dove non sono completamente assorbite nell'intestino45. I polifenoli in alti livelli possono causare una regressione della crescita46. Questo effetto era inferiore nei trattamenti con nano-curcumina, indicando che la nano-curcumina potrebbe essere più sicura della sua forma libera. A sostegno, Lee et al.47 hanno rivelato la biosicurezza dell'utilizzo della nano-curcumina.

Nel presente studio, la curcumina e la nano-curcumina hanno aumentato il contenuto di proteine ​​grezze e lipidi nel corpo del pesce. Allo stesso modo, l'integrazione alimentare con curcumina a livelli di 50-200 mg kg-1 di dieta ha migliorato significativamente la deposizione di lipidi e proteine ​​grezze nei muscoli della tilapia del Nilo23. Ciò potrebbe essere correlato alla regolazione del microbiota intestinale, che ha migliorato l'utilizzo efficiente dei nutrienti23. Un'altra spiegazione sarebbero gli effetti benefici della curcumina sull'attività degli enzimi digestivi del pesce, tra cui tripsina, lipasi e amilasi22. Inoltre, le particelle caricate negativamente, come la nano-curcumina, rallentano il tasso di assorbimento delle proteine ​​sieriche, determinando un'emivita di circolazione più lunga rispetto alle particelle caricate positivamente48. Questo potrebbe spiegare perché le diete alimentate con pesce contenenti nano-curcumina avevano un contenuto di proteine ​​grezze più elevato rispetto alle diete prive di curcumina alimentate con pesce.

Qualsiasi aumento dell'attività degli enzimi epatici, come ALT e AST, è un marker biologico di danno epatico49,50. Nel presente studio, i livelli di ALT e AST erano diminuiti nei gruppi di nano-curcumina prima o dopo lo stress da calore e in una certa misura nei gruppi di curcumina libera, dimostrando i vantaggi della nano-curcumina (questo è stato giustificato in precedenza in questa discussione ). Allo stesso modo, la curcumina può prevenire l'epatotossicità nei ratti indotta dal perossido di idrogeno e ridurre i livelli degli enzimi ALT e AST51. Inoltre, i risultati sperimentali nei topi con fibrosi causata dal tetracloruro di carbonio (CCl4) hanno mostrato che la nano-curcumina ha ridotto significativamente i livelli di ALT e AST 52. Pertanto, la capacità della curcumina di ridurre alcuni marcatori del sangue (come ALT e AST) indica la sua capacità come anti -agente infiammatorio durante danno epatico53.

Nonostante gli effetti protettivi della curcumina contro i danni al fegato in questo studio a una concentrazione moderata (dieta 100 mg kg-1), gli effetti avversi sono apparsi a una concentrazione più elevata (dieta 200 mg kg-1). Seguendo lo stesso schema, la curcumina ha anche mostrato un effetto concentrazione-dipendente nella carpa gigante (Cyprinus carpio), che soffriva di danno epatico indotto da CCl54. Allo stesso modo, è stato riscontrato che la curcumina ha un duplice effetto sul danno epatico alcolico nei ratti maschi a seconda della concentrazione, poiché il suo effetto protettivo è stato ottenuto solo a bassa concentrazione, ma l'accelerazione del danno epatico è stata osservata a una concentrazione più elevata 55. Un altro studio in ratti hanno indicato che un'alta concentrazione con l'assunzione a lungo termine di curcumina può ridurre il peso corporeo, accelerare lo stress ossidativo e l'infiammazione e stimolare il danno epatico aumentando i livelli di AST e -GGT56.

Il duplice effetto della curcumina può essere collegato alla sua capacità di stimolare l'eme ossigenasi-1 (HO{-1) in concentrazioni non tossiche e tossiche, e l'induzione di HO-1 è associata alla produzione di specie reattive dell'ossigeno (ROS), suggerendo una relazione causale57. Allo stesso modo, Cao et al.58 hanno scoperto che a concentrazioni più basse, la curcumina ha effetti benefici inducendo attività antiossidanti; tuttavia, concentrazioni più elevate aumentano i livelli cellulari di ROS, con conseguente danno ossidativo al DNA nelle cellule G2 dell'epatoma umano.

Lo stress da calore eleva gli indicatori di stress, come i livelli di cortisolo e glucosio. Nel presente studio, l'inclusione della curcumina (esclusa la dose elevata di 200 mg kg-1 di dieta) o della nano-curcumina nelle diete a base di tilapia ha ridotto sia il glucosio che il cortisolo prima o dopo lo stress da calore. I migliori livelli di cortisolo sono stati rilevati a CN50 e CN100. Ciò è probabilmente giustificato dalla natura della curcumina come polifenolo. È stato dimostrato che i polifenoli migliorano gli indicatori di stress cortisolo e glucosio59,60). Questi effetti possono anche essere attribuiti alle proprietà antiossidanti della curcumina, che è stata trovata per eliminare i radicali lipidici nella membrana cellulare e diventare un radicale fenossilico14,61. Inoltre, la curcumina abbassa i livelli di glucosio epatico aumentando l'assorbimento del glucosio attraverso la sovraregolazione delle espressioni geniche GLUT2, GLUT3 e GLUT462. A sostegno, Wei et al.63 hanno rivelato che la curcumina alimentare riduce significativamente il cortisolo indotto dallo stress di un terzo nei suini.

Tuttavia, in questo studio, una maggiore concentrazione di curcumina (dieta 200 mg kg-1) ha portato a un livello più elevato di cortisolo rispetto agli altri trattamenti, compreso il gruppo di controllo. Parallelamente, C200 ha prodotto un livello più elevato di glucosio simile a quello ottenuto dal gruppo di controllo. Lo stesso effetto è stato riportato nelle galline ovaiole, dove dosi più elevate di curcumina non hanno ridotto il cortisolo rispetto a concentrazioni più basse che hanno ridotto i livelli di cortisolo prima o dopo un'esposizione ad alta temperatura 64. Gli autori hanno collegato questo effetto al potenziale di doppia azione della curcumina, in quanto può agire come antiossidante e/o ossidante, a seconda della sua dose65. L'elevata concentrazione di perossidi aumenta il rilascio di ROS che danneggia cellule e tessuti65.

In questo studio, le diete sperimentali non hanno influenzato le conte ematologiche, ad eccezione del C200 che ha dato più leucociti e più bassi neutrofili rispetto alle altre diete sperimentali. Un elevato numero di leucociti ad un alto livello di curcumina (dieta di 200 mg kg-1) può enfatizzare lo stato di stress del pesce a questa concentrazione. La leucocitosi è direttamente proporzionale alla gravità dello stress e al danno da stress che successivamente attiva il sistema di difesa immunitaria66,67.

La temperatura influisce sui parametri ematologici in fsh68. A questo proposito, dopo lo stress da calore, le conte di piastrine, MCV, MCH, leucociti e neutrofili sono aumentate mentre il numero di linfociti è diminuito e non vi è stato alcun effetto su altri parametri del sangue nello studio attuale. A sostegno, Grzelak et al.69 hanno riportato una significativa linfopenia e neutrofilia in pesci zebra acutamente stressati (Danio rerio) rispetto a pesci non stressati o di controllo. Inoltre, lo stress termico provoca ipossia o anossia70,71 e questo effetto è stato riportato nel presente studio. A sua volta, è stato riscontrato che l'ipossia aumenta il numero di leucociti, piastrine e neutrofili e riduce il numero di linfociti nella tilapia rossa 72. Ciò può essere collegato al livello elevato di cortisolo 72. La neutrofilia e la linfopenia erano evidenti dopo il trattamento con cortisolo nella carpa (C. carpio L.)73. Il carassio (Carassius carassius) ha prodotto un elevato rapporto di neutrofili e linfociti nel sangue dopo essere stato sottoposto a stress, che è strettamente correlato a livelli elevati di glucocorticoidi 74.

L'immunoglobulina M e i complementi (C3 e C4) sono componenti principali del sistema immunitario innato dei pesci e sono tra le prime linee di difesa del sistema immunitario e svolgono un ruolo cruciale nella protezione della salute dei pesci75-78. IgM e complementi svolgono un ruolo importante nella protezione del corpo animale dalle infezioni durante lo stress, oltre a promuovere l'ingorgo delle cellule apoptotiche e danneggiate79-82. Infatti, prima e dopo lo stress da calore nel presente studio, i livelli di IgM, C3 e C4 sono aumentati con l'inclusione dietetica della curcumina. Inoltre, la nano curcumina ha mostrato un miglioramento migliore in questi indicatori rispetto alla curcumina libera. I risultati qui presentati per IgM, C3 e C4 evidenziano due fatti: la bassa dose di curcumina è migliore e la nano-formulazione è più efficace (cosa giustificata in precedenza in questa discussione). A supporto, la curcumina ha indotto la risposta immunitaria innata della tilapia del Nilo a una dose di 50 mg kg-1 di dieta, ma la crescita è stata inibita a livelli più alti23. Il presente studio ha rilevato che i livelli di IgM, C3 e C4 aumentavano con la temperatura elevata, rivelando la stimolazione della produzione di sostanze antinfiammatorie per ridurre il danno tissutale. Ciò è supportato dai risultati degli enzimi epatici sierici (ALT e AST) nel presente studio. È noto che lo stress da calore causa danni ai tessuti e stress ossidativo nei pesci; quindi, porta all'apoptosi e alla morte cellulare83-85. Lo stress da calore acuto a breve termine porta alla sovraregolazione di C3 e C486. Inoltre, la carenza del sistema del complemento ha aumentato il danno vascolare, la permeabilità vascolare e l'angioedema 87.

Un graduale aumento dei livelli plasmatici di IgM è stato osservato con l'aumentare della temperatura (18, 23, 28, 33 gradi) nella tilapia del Nilo, ad eccezione della temperatura più alta10. Allo stesso modo, l'allevamento del branzino (Dicentrarchus labrax) ad alta temperatura (23 gradi) ha aumentato i livelli di IgM rispetto all'allevamento del pesce a 17 gradi 88. Al contrario, altri studi hanno rivelato che l'HS ha ridotto i livelli di IgM, C3 e C4 nei pesci89– 91. Questa discrepanza può essere giustificata dalla durata dello stress da caldo, dove i livelli di IgM, C3 e C4 aumentano sotto stress acuto ma diminuiscono sotto stress cronico9,10. L'orata dal muso smussato (Megalobrama amblycephala Yih) ha mostrato un aumento delle attività del complemento alternativo e dei livelli di IgM dopo 6 ore di esposizione allo stress da calore, che sono diminuiti dopo 12 ore9.

In conclusione, la nano-curcumina ha la superiorità rispetto alla curcumina libera nel migliorare le prestazioni di crescita, gli indicatori di stress, l'immunità non specifica e la resistenza allo stress termico della tilapia del Nilo. L'integrazione dietetica di nano-curcumina a livelli di 50 o 100 mg kg-1 di dieta è stata efficace nel migliorare le prestazioni e mitigare gli effetti negativi dello stress da calore, mentre dosi di 100 o 200 mg kg-1 di dieta hanno migliorato le prestazioni di crescita della tilapia del Nilo . Pertanto, una dose di 100 mg kg-1 di dieta era efficace sia per le prestazioni di crescita che per la capacità di resistenza al calore.

Disponibilità dei dati

Tutti i dati generati o analizzati durante questo studio sono inclusi in questo articolo pubblicato.

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