Astratto:La quercetina è stata ampiamente studiata per i suoi effetti anti-Alzheimer (AD) e anti-invecchiamento. I nostri studi precedenti hanno scoperto che la quercetina e nella sua forma glicosidica, la rutina, possono modulare la funzione del proteasoma nelle cellule di neuroblastoma. Abbiamo mirato a esplorare gli effetti della quercetina e della rutina sull'omeostasi redox intracellulare del cervello (glutatione ridotto/glutatione ossidato, GSH/GSSG), la sua correlazione con l'attività dell'enzima di scissione dell'APP del sito 1 (BACE1) e la proteina precursore dell'amiloide (APP) espressione in topi transgenici TgAPP (portatori di transgene APP con mutazione svedese umana, APPswe). Sulla base del fatto che la proteina BACE1 e l'elaborazione dell'APP sono regolate dalla via ubiquitina-proteasoma e che l'integrazione con GSH protegge i neuroni dall'inibizione del proteasoma, abbiamo studiato se una dieta contenente quercetina o rutina (30 mg/kg/die, 4 settimane) riduce di parecchie primi segni di AD. Le analisi di genotipizzazione degli animali sono state effettuate mediante PCR. Per determinare l'omeostasi redox intracellulare, sono stati adottati metodi spettrofluorimetrici per quantificare i livelli di GSH e GSSG utilizzando o-ftalaldeide, ed è stato accertato il rapporto GSH/GSSG. I livelli di TBARS sono stati determinati come marker di perossidazione lipidica. Le attività enzimatiche di SOD, CAT, GR e GPx sono state determinate nella corteccia e nell'ippocampo. L'attività di BACE1 è stata misurata da un substrato specifico della secretasi coniugato a due molecole reporter (EDANS e DABCYL). L'espressione genica dei principali enzimi antiossidanti: APP, BACE1, una proteina 10 contenente dominio di disintegrina e metalloproteinasi (ADAM10), caspasi-3, caspasi-6 e citochine infiammatorie sono state determinate mediante RT-PCR. In primo luogo, la sovraespressione di APPswe nei topi TgAPP ha ridotto il rapporto GSH/GSSG, aumentato i livelli di malonaldeide (MDA) e, nel complesso, ha ridotto le principali attività degli enzimi antiossidanti rispetto ai topi wild-type (WT). Il trattamento dei topi TgAPP con quercetina o rutina aumentava il GSH/GSSG, diminuiva i livelli di MDA e favoriva la capacità antiossidante dell'enzima, in particolare con la rutina. In secondo luogo, sia l'espressione di APP che l'attività di BACE1 erano diminuite con la quercetina o la rutina nei topi TgAPP. Per quanto riguarda ADAM10, tendeva ad aumentare nei topi TgAPP con trattamento con rutina. Per quanto riguarda l'espressione caspase-3, TgAPP ha mostrato un aumento opposto a quello della rutina. Infine, l'aumento dell'espressione dei marcatori infiammatori IL-1 e IFN- nei topi TgAPP è stato ridotto sia dalla quercetina che dalla rutina. Collettivamente, questi risultati suggeriscono che, dei due flavonoidi, la rutina può essere inclusa nella dieta quotidiana come forma di terapia adiuvante nell'AD.

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Parole chiave:quercetina; rutina; glutatione; APPwe; BACE1; Il morbo di Alzheimer

1. Introduzione

Il declino della funzione cognitiva è un sintomo clinico fondamentale della neurodegenerazione strettamente correlato all'età [1]. L'impatto della nutrizione sul declino cognitivo associato all'età è un argomento sempre più in crescita, in quanto è un fattore vitale che può essere facilmente modificato. I cambiamenti patologici nel cervello osservati durante il declino cognitivo si verificano molto prima di qualsiasi manifestazione clinica, che si verifica soprattutto in età avanzata. Ciò fornisce un periodo più lungo per stabilire strategie di prevenzione riguardanti il ​​declino cognitivo correlato all'età e la demenza, che è una delle principali preoccupazioni per la salute pubblica [2]. Per molti anni è stata condotta un'intensa ricerca sui composti di origine naturale, trovati nelle diete quotidiane, sulla terapia di potenziamento cognitivo [3].

Una delle più comuni malattie neurodegenerative legate all'età è la malattia di Alzheimer (AD), che è caratterizzata da due caratteristiche neuropatologiche: placche amiloidi (A) e grovigli neurofibrillari. In termini di ricerca sugli animali, i modelli animali possono simulare la fase asintomatica dell'AD modificando la proteina precursore A (APP), ad esempio [4,5].

Sorprendentemente, diversi fitochimici bioattivi derivati ​​da piante associati a vari benefici per la salute e riduzione del rischio di molte malattie sono stati sottoposti a screening per la formazione di complessi non covalenti con il peptide amiloide (A) [3].

Sebbene numerose medicine tradizionali e prodotti dietetici naturali abbiano mostrato grandi progressi verso la mitigazione della patologia AD, siamo pienamente consapevoli dei limiti dei modelli animali AD, poiché gli effetti promettenti di tali sostanze non sono sempre replicabili negli studi sull'uomo [6]. Tuttavia, a causa della difficoltà di analizzare il tessuto cerebrale negli esseri umani, soprattutto nelle primissime fasi della progressione, sono necessari studi su modelli di roditori. Di conseguenza, questi modelli sperimentali possono supportare lo sviluppo di user agent da medicine tradizionali e composti naturali sicuri per ritardare la progressione delle malattie neurodegenerative. Pertanto, la sperimentazione di composti naturali, presenti nelle diete quotidiane, per la prevenzione delle malattie e la protezione contro il rischio di AD, dovrebbe essere una priorità.

Tra questi importanti agenti naturali dietetici c'è la quercetina, che è il principale flavonoide polifenolico in diversi tipi di frutta e verdura [7]. La quercetina è presente principalmente nella sua forma glicosidica, cioè la rutina. Da parte sua, la rutina (quercetina-3-O-rutinoside) ha mostrato profondi effetti sulle varie funzioni cellulari che sono alla base di diverse condizioni patologiche, vale a dire antimicrobica, anticarcinogena, antitrombotica, cardioprotettiva e neuroprotettiva. Questi effetti farmacologici sono principalmente associati alle attività antinfiammatorie e antiossidanti della rutina. Grazie alla sua capacità di attraversare la barriera emato-encefalica e/o i suoi metaboliti, è stato dimostrato che la rutina può alterare i sintomi sia cognitivi che comportamentali delle malattie neurodegenerative [8].

I nostri studi precedenti hanno scoperto che entrambi i flavonoidi, la quercetina e la rutina influenzano varie vie di segnalazione e reti molecolari associate alla modulazione delle funzioni del proteasoma nelle cellule di neuroblastoma [9]. Inoltre, è stato dimostrato che l'espressione di BACE1 e l'elaborazione di APP sono regolate dalla via ubiquitina-proteasoma [10] e che l'integrazione con glutatione ridotto (GSH) protegge i neuroni dall'inibizione del proteasoma [11]. La deplezione di GSH nel cervello è un riscontro comune nei pazienti con malattie neurodegenerative, come l'AD, e può causare neurodegenerazione prima dell'insorgenza della malattia [12]. L'ubiquitinazione di BACE1 e il blocco della via ubiquitina-proteasoma inibiscono la degradazione di BACE1 e, di conseguenza, portano ad un aumento della produzione dell'attività enzimatica di BACE1 [10].

Sulla base di questi risultati e del fatto che le abitudini alimentari e l'integrazione possono influenzare lo stato redox cellulare, abbiamo mirato a esplorare gli effetti di una dieta contenente quercetina o rutina sull'omeostasi redox intracellulare del cervello (GSH/GSSG), la sua correlazione con l'attività di BACE1, e l'espressione di APP in modelli murini di AD (portatori di transgene APP della proteina precursore dell'amiloide svedese, APPswe).

Infine, poiché vi sono prove convincenti dell'effetto delle integrazioni di flavonoidi nel migliorare specifici domini cognitivi e/o risultati della risonanza magnetica [13], abbiamo tentato di imitare, negli animali, un intervento fornendo una dieta sana contenente quantità moderate di un particolare potenziale attivo ingrediente (quercetina o rutina) come strategia efficace per prevenire l'espressione dei marcatori AD.

2. Risultati

2.1. Genotipizzazione dei topi

La colonia di topi TgAPP è stata sviluppata nel nostro laboratorio da maschi eterozigoti Tg2576 e femmine wild-type. La genotipizzazione dei topi è stata eseguita per rilevare gli individui transgenici. Di tutti i topi testati, circa il 40% è risultato essere transgenico (TgAPP).

I prodotti di PCR ottenuti sono stati separati mediante elettroforesi in gel di agarosio all'1,5% in tampone 0.5X TBE (Tris-borato-EDTA) a 70 V (tensione costante) e quindi ripresi mediante colorazione con GelRed (Millipore). Il profilo di amplificazione per entrambi i topi transgenici e WT è mostrato nella Figura 1.

2.2. Glutatione

Per valutare l'omeostasi redox intracellulare nei neuroni nei topi TgAPP, sono stati quantificati i livelli di GSH e GSSG e il rapporto GSH/GSSG è stato determinato come marker del potere di riduzione cellulare sia nei maschi che nelle femmine (Figura 2).

Nella valutazione dell'effetto del transgene sul sistema del glutatione, è stata osservata una diminuzione del potere di riduzione cellulare (GSH/GSSG) nei topi TgAPP riguardanti animali WT, sia nei maschi che nelle femmine e in entrambe le aree del cervello (Figura 2C3, H3), specialmente nell'ippocampo. In entrambi i topi WT e TgAPP, il rapporto GSH/GSSG era significativamente inferiore nei maschi rispetto alle femmine (Figura 2C3, H3; p <0.05). Mentre nelle femmine TgAPP questo declino è il risultato di livelli più bassi di GSH (Figura 2C1, H1), nei maschi TgAPP è principalmente attribuito a un aumento dei livelli di GSSG (Figura 2C2, H2).

I cambiamenti nei livelli di GSH e GSSG dei topi TgAPP, rispettivamente, dopo trattamento con quercetina o rutina, sono più evidenti nei maschi che nelle femmine. Sembra che la quercetina tenda ad aumentare i livelli di GSH (Figura 2C1, H1; p <0.05) e la rutina ad abbassare i livelli di GSSG (Figura 2C2, H2; p <0,05).

I trattamenti con quercetina e rutina, sia nei maschi che nelle femmine, sono stati in grado di invertire la caduta del rapporto GSH/GSSG nell'ippocampo (Figura 2H3) dove il recupero del potere redox era significativo rispetto ai topi TgAPP non trattati. Nei maschi, questo indice ha raggiunto valori simili a quelli dei topi WT nell'ippocampo (H3). Nelle femmine, sebbene questo rapporto non sia elevato a quello dei topi WT, il trattamento con quercetina e rutina lo ha migliorato significativamente rispetto a quello dei topi TgAPP nei loro ippocampi (H3: quercetina, p < 0.{{ 6}}01; rutina, p < 0,05).

2.3. Sostanze reattive all'acido tiobarbiturico (TBAR)

I livelli di TBAR sono stati determinati come marker di perossidazione lipidica. Utilizzando le curve di calibrazione, i risultati sono stati espressi come concentrazione di malondialdeide (MDA) (Figura 3).

Dopo la sovraespressione di APP, è stato osservato un aumento significativo dei livelli di MDA rispetto ai topi WT sia nella corteccia (Figura 3C) che nell'ippocampo (Figura 3H) e sia nei maschi che nelle femmine (p <0.001) .

Nelle femmine TgAPP, sia i trattamenti con quercetina che quelli con rutina hanno quasi ripristinato i livelli di MDA allo stesso livello di quelli dei topi WT (Figura 3C, H). Allo stesso modo, nei maschi TgAPP, entrambi i trattamenti con quercetina e rutina ripristinano i livelli di MDA allo stesso livello di quelli dei topi WT nella corteccia (Figura 3C) e sono ulteriormente ridotti nell'ippocampo (Figura 3H). In entrambi i topi WT e TgAPP, non trattati e trattati con la dieta con flavonoidi, i livelli di MDA erano dipendenti dal sesso (Figura 3C, H; p <0.05), ad eccezione dei topi TgAPP trattati con quercetina nell'ippocampo.

2.4. Attività enzimatica ed espressione di enzimi antiossidanti

Per capire se la regolazione dell'attività enzimatica o dell'espressione genica dei principali enzimi antiossidanti, o entrambi, si verifica con una dieta a base di quercetina o rutina, è stata eseguita la determinazione dell'attività enzimatica e dei livelli di mRNA.

La Figura 4 mostra le attività enzimatiche di SOD, CAT, GR e GPx, determinate in topi maschi e femmine, nella corteccia cerebrale (Figura 4a) e nell'ippocampo (Figura 4b).

Come conseguenza della sovraespressione di APP, è stata osservata solo una significativa diminuzione dell'attività CAT nei topi TgAPP rispetto ai topi WT sia nella corteccia (Figura 4a (C2); p < 0. 0 5) e l'ippocampo (Figura 4b (H2); p <0,05).

Il trattamento con quercetina non ha prodotto alcuna variazione significativa nelle attività enzimatiche rispetto ai topi TgAPP, nei maschi o nelle femmine, nelle aree cerebrali studiate. Al contrario, gli animali trattati con rutina hanno sperimentato un aumento dell'attività CAT nella corteccia (Figura 4a (C2)) e dell'attività GR nell'ippocampo (Figura 4b (H3)) sia nei maschi che nelle femmine (p <0 .05). Inoltre, la rutina ha aumentato l'attività CAT dell'ippocampo nei maschi TgAPP (Figura 4b (H2)) e l'attività GPx nelle femmine (Figura 4b (H4)).

La Figura 5 mostra l'espressione genica dei principali enzimi antiossidanti, SOD, CAT, GR e GPx, determinata in topi maschi e femmine, nella corteccia cerebrale (Figura 5a) e nell'ippocampo (Figura 5b).

Non si osservano differenze nell'espressione genica tra topi TgAPP e WT per i principali enzimi antiossidanti (Figura 5a, b). I maschi TgAPP trattati con rutina hanno mostrato un aumento significativo dell'espressione di CAT nell'ippocampo (Figura 5b (H2)). Per quanto riguarda il GPx dell'ippocampo, è stato osservato un modello simile al CAT, sebbene l'aumento non fosse significativo (Figura 5b (H4)).

2.5. Elaborazione APP: BACE1 e ADAM10

I risultati dell'attività dell'enzima BACE1 sia nella corteccia cerebrale che nell'ippocampo nei maschi e nelle femmine sono mostrati nella Figura 6, espressi come percentuali di attività relative ai topi TgAPP non trattati.

Nella Figura 6, è stato riscontrato che l'attività dell'enzima BACE1 nei topi TgAPP aumenta di circa l'10 percento rispetto ai topi WT, in entrambe le aree cerebrali sotto indagine e in entrambi i sessi, ed è risultata statisticamente significativa (p < 0,05).

L'aumento dell'attività osservato nei topi transgenici è stato ridotto dai trattamenti con quercetina e rutina, sia nella corteccia che nell'ippocampo. Tuttavia, si potrebbe ancora notare che l'effetto della rutina era leggermente maggiore di quello della quercetina nei maschi.

Una volta nota l'attività di BACE1, abbiamo deciso di effettuare lo studio dell'espressione genica di APP, la principale caratteristica del modello animale transgenico, e dei suoi principali enzimi di processazione: BACE1 e ADAM10. La Figura 7 mostra i risultati ottenuti nei topi femmina e maschio, sia nella corteccia che nell'ippocampo.

In entrambi i sessi, è stato osservato un aumento significativo dell'espressione di APP superiore all'85% nei topi WT, dimostrando la sovraespressione del gene sia nella corteccia cerebrale (Figura 7C1; p <0.05) e nell'ippocampo (Figura 7H1; p <0.05). I trattamenti con quercetina e rutina sono stati in grado di ridurre questa espressione di oltre il 45 percento (p <0,05) sia per i topi maschi che per quelli femminili in entrambe le aree cerebrali sotto indagine (Figura 7C1, H1), con effetti più evidenti nell'ippocampo ( Figura 7H1).

Per quanto riguarda l'espressione della proteina BACE1, sebbene l'attività di BACE1 fosse alterata, non vi erano differenze significative tra topi transgenici e non transgenici, indipendentemente dal sesso e dal trattamento con flavonoidi esaminati.

Pertanto, abbiamo valutato l'espressione ADAM10 coinvolta nell'elaborazione non amiloidogenica di APP. Sebbene i cambiamenti nell'espressione di ADAM10 nei topi TgAPP rispetto ai topi WT non fossero statisticamente significativi, è stata osservata una leggera diminuzione. Per quanto riguarda i trattamenti con flavonoidi, la rutina ha mostrato una tendenza crescente nell'espressione di ADAM10, sia nei maschi che nelle femmine e in entrambe le aree del cervello (Figura 7C3, H3).

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