Astratto:L'obiettivo principale del presente studio è quello di stimare, attraverso l'analisi differenziale, varie attività biologiche del contenuto totale di fenoli in estratti alcolici di tre varietà di palma da datteri sensibili o resistenti al Fusarium oxysporum. sp Albidinis. Qui, i prodotti stilbene con capacità antiossidanti e bioattive sono stati evidenziati nella varietà resistente Taabdount (TAAR). Inoltre, la frazione metanolica della varietà di palma da datteri resistente al TAAR contiene un prodotto significativo, determinato mediante LCMS/MS e 1H, 13C NMR, appartenente alla famiglia degli idrossistilbeni, che presenta capacità antiossidanti, inibisce l'attività tirosinasica dei funghi e attiva ed esercita un effetto protettivo sul danno indotto dall'ipoclorito nel proteasoma 20S delle cellule invecchiate di fibroblasti dermici umani. Complessivamente, i risultati attuali indicano che l'idrossitoluene presente nella resistente Phoenix dactylifera L. dovrebbe essere studiato per comprendere il modo in cui lo stilbene potrebbe esercitare capacità anti-invecchiamento.

Il glicoside di cistanche può anche aumentare l'attività della SOD nei tessuti del cuore e del fegato e ridurre significativamente il contenuto di lipofuscina e MDA in ciascun tessuto, eliminando efficacemente vari radicali reattivi dell'ossigeno (OH-, H₂O₂, ecc.) e proteggendo dai danni al DNA causati da radicali OH. I glicosidi feniletanoidi di Cistanche hanno una forte capacità di scavenging dei radicali liberi, una maggiore capacità riducente rispetto alla vitamina C, migliorano l'attività della SOD nella sospensione dello sperma, riducono il contenuto di MDA e hanno un certo effetto protettivo sulla funzione della membrana dello sperma. I polisaccaridi Cistanche possono migliorare l'attività di SOD e GSH-Px negli eritrociti e nei tessuti polmonari di topi sperimentalmente senescenti causati dal D-galattosio, nonché ridurre il contenuto di MDA e collagene nei polmoni e nel plasma e aumentare il contenuto di elastina, hanno un buon effetto scavenging su DPPH, prolunga il tempo di ipossia nei topi senescenti, migliora l'attività della SOD nel siero e ritarda la degenerazione fisiologica del polmone nei topi senescenti sperimentalmente Con la degenerazione morfologica cellulare, gli esperimenti hanno dimostrato che Cistanche ha la buona capacità antiossidante e ha il potenziale per essere un farmaco per prevenire e curare le malattie dell'invecchiamento cutaneo. Allo stesso tempo, l'echinacoside in Cistanche ha una significativa capacità di eliminare i radicali liberi DPPH e ha la capacità di eliminare le specie reattive dell'ossigeno e prevenire la degradazione del collagene indotta dai radicali liberi, e ha anche un buon effetto di riparazione sul danno dell'anione dei radicali liberi della timina.

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Parole chiave:Phoenix dattilifera L.; Fusarium oxysporum. sp Albidinis (FoA); attività antiossidanti; attività anti-tirosinasica; attivazione del proteasoma; analisi LC-MS/MS; derivati ​​dello stilbene

1. Introduzione

La palma da dattero (Phoenix dactylifera L.) è una monocotiledone perenne della famiglia delle Arecaceae. Questo albero è della massima importanza nella vita delle popolazioni sahariane del Marocco meridionale e sud-orientale, sia economicamente che socialmente. Malattia di Bayoud, causata dal fungo del suolo Fusarium oxysporum f. sp Albidinis (FoA) [1], negli ultimi anni ha notevolmente ridotto la resa delle palme da datteri marocchine [2]. Si stima che il FoA sia scomparso da due terzi del patrimonio phoenicicole marocchino, ma continui a distruggere tra il 4,5% e il 12% delle cultivar commerciali di palme da dattero di altissima qualità [2]. Sono stati fatti molti sforzi per combattere questa malattia ed esporre alcuni meccanismi di difesa della palma da datteri [3]. I primi studi sui possibili meccanismi di difesa della palma da datteri hanno evidenziato il ruolo dei composti fenolici e la capacità antiossidante nella tolleranza al FoA [4,5]. L'analisi biochimica delle cultivar di composti fenolici delle radici resistenti e sensibili è stato il primo studio biochimico che ha chiarito il vantaggio dei meccanismi di difesa della palma da datteri. In effetti, la letteratura indica che le cultivar a radice resistente sono più ricche di acido 5-caffeoil shikimico e dei suoi isomeri di posizione rispetto alle cultivar a radice sensibile [5]. Questi composti hanno effettivamente mostrato una potenziale attività antimicotica in vitro contro FoA [6].

La grande capacità degli antiossidanti naturali di eliminare i radicali liberi è ciò che sta guidando la loro crescente popolarità negli studi medici e alimentari [7-10].

Ad esempio, le specie reattive dell'ossigeno sono fattori aggravanti nel danno cellulare e nei processi di invecchiamento [11] e sono quindi collegate a molte malattie. Di conseguenza, le molecole antiossidanti possono aiutare la salute umana prevenendo le malattie degenerative e rallentando le conseguenze dell'invecchiamento [12]. In questo studio, siamo interessati alla capacità degli antiossidanti di promuovere l'attivazione del proteasoma 20S e proteggerlo dal danno ossidativo. Il proteasoma contribuisce infatti al mantenimento dell'omeostasi cellulare consentendo il processo cellulare di eliminazione delle proteine ​​danneggiate e la distruzione controllata delle proteine ​​a vita breve [13]. Pertanto, l'attivazione del proteasoma con antiossidanti potrebbe rivelarsi una nuova strategia anti-invecchiamento [14]. Inoltre, questo lavoro intende esplorare il potenziale del contenuto fenolico di radici resistenti al FoA come composti biologici attivi.

2. Materiali e metodi

2.1. Campione di pianta

Lo studio è stato condotto per ciascun campione con materiale proveniente da 10 cultivar adulte di palma da datteri (Phoenix dactylifera L.) cresciute da parcelle contaminate o non contaminate situate a Palmaria Figuig, nel sud-est del Marocco. Le radici principali (comprese le loro radici che respirano aria) hanno un diametro compreso tra 0,5 e 2 cm di varietà suscettibili, come charas Bouffegous infetto (BI) o quelle non infette (BNI). Inoltre, è stata raccolta la cultivar di Taabdount (TAAR) resistente alla FoA e le foglie di due piante medicinali sono state utilizzate localmente come trattamento filattico contro la FoA. Inoltre, nella stessa parcella incontaminata sono stati raccolti anche rosmarino (R, Rosmarinus officinalis) e melograno (G, Punica granatum L.) [15], dove sono stati analizzati e utilizzati come controllo. I campioni sono stati prelevati durante due periodi dell'anno, settembre e fine gennaio (tra il 2013 e il 2015), e conservati ermeticamente a temperatura ambiente. Poiché i campioni sono stati acquisiti da un palmer, sono debitamente certificati (identificazione e classificazione) dal ministro dell'Agricoltura del Marocco [16].

2.2. Preparazione degli estratti

Dopo un lungo lavaggio con acqua, le radici o le foglie venivano essiccate all'ombra, quindi macinate in un frullatore. Per ogni campione (BI, BNI, TAAR, R e G), 10 mL di metanolo sono stati aggiunti a 1 g di materiale secco e poi lasciati in agitazione per 4 ore a temperatura ambiente. Quindi, sono stati filtrati ed evaporati a 37 ◦C mediante vaporizzatore rotante. L'estratto secco è stato posto in una soluzione di metanolo ad una concentrazione finale di 10 mg/mL o 50 mg/mL (successivamente utilizzata per saggiare le attività biologiche in vitro). Per i saggi di attività biologica sono state eseguite tre estrazioni indipendenti per ciascun campione.

2.3. Attività biologiche

2.3.1. Contenuto fenolico e attività antiossidanti

La procedura delineata da Nacoulma et al. è stato applicato per valutare i fenoli totali e il contenuto totale di flavonoidi di ciascun estratto [17], con un adattamento finale dei volumi a 200 µL da utilizzare su un lettore di micropiastre. L'assorbanza a 760 nm e 510 nm, rispettivamente, è stata determinata rispetto a un bianco di metanolo. Curve di calibrazione standard di acido gallico (0–300 mg/L) (y=0.0083x plus 0.9106, r2=0.978) e quercetina (0–100 mg/L) (y {{14 Sono stati utilizzati rispettivamente }}.0008x più 0.0597, r2=0.994).

Utilizzando il radicale libero 1,1-difenil-2-picrylhydrazyl, è stata studiata l'attività di scavenging antiossidante (DPPH). Utilizzando un adattamento finale dei volumi a 300 µL e 275 µL, rispettivamente, per impiegare un lettore di micropiastre, è stata valutata la capacità degli estratti di ridurre il ferro (III), come descritto da Nacoulma et al. [17]. Rispetto a un bianco di metanolo, l'assorbanza è stata misurata rispettivamente a 517 nm e 700 nm. Quindi, utilizzando la seguente equazione, l'attività di scavenging dei radicali liberi di ciascuna soluzione è stata stimata come percentuale di inibizione:

È stata ottenuta una curva di calibrazione standard utilizzando l'acido ascorbico ({{0}}–100 mg/L) come standard antiossidante (y=0.0014x più 0.0875, r2=0.998).

2.3.2. Saggio di inibizione della crescita dell'elio FoAMyc

Con una piccola modifica, il metodo descritto da Neri et al. [18] è stato utilizzato per determinare il grado in cui le sostanze chimiche pure hanno inibito la crescita del micelio FoA. Una coltura di FoA di 7-giorni aveva cinque millimetri di dischi miceliali posizionati su piastre di Petri con terreno PDA integrato con le sostanze chimiche pure sopra elencate a 50, 75 e 100 µg/mL. Le piastre sono state incubate per 5 giorni a 28°C. Il diametro medio della colonia misurato a due angoli retti è stato utilizzato per valutare l'inibizione della crescita del micelio FoA. Ogni trattamento consisteva in tre test utilizzando tre diversi ceppi di FoA: FoA 41818, FoA 41814 (BCCM, Belgio) e FoA Local (Palemeraie di Figuig, Marocco), nonché un controllo negativo utilizzando un terreno che non era stato aggiunto.

2.3.3. Vitalità cellulare e attività del proteasoma 20S

Sono stati utilizzati fibroblasti cutanei umani normali di un uomo di {{0}} anni (NHDF) (Promocell, Heidelberg, Germania) in cui le cellule sono state collocate a una densità di 100,{{3 }} cellule/mL in RPMI 10% integrato con 10% (p/v) di FBS, 1% (p/v) di L-glutammina, 100 unità/mL di penicillina e 100 µg/mL di streptomicina. Sono stati tenuti in 96-micropiastre bianche o trasparenti per 24 ore a 37 ◦C in un incubatore con un ambiente umidificato al 5% di CO2. Per il saggio dell'attività del proteasoma, nonché per la valutazione degli effetti protettivi sul danno indotto dall'ipoclorito, le cellule sono state quindi trattate con materiali di prova (un composto puro da 5 a 50 µg/mL, controllo positivo a 0,5 e/o 1 µM, ed estratti vegetali metanolici da 15 a 50 µg/mL) per 24 ore con un massimo dello 0,3% di DMSO nella concentrazione finale, simultaneamente, senza modifiche, rispetto al controllo negativo. Lo studio degli effetti protettivi dell'estratto di TAAR o dei composti puri sull'attività del proteasoma ha significato che le cellule dei fibroblasti sono state successivamente sottoposte a 50 µM OCl- per 35 minuti (selezionate come ottimali, senza tossicità cellulare, inibitore ossidante della condizione del proteasoma 20S) [19]. Le seguenti fasi sperimentali sono state completate dalla metodologia del fornitore (Proteasome-Glo Chymotrypsin-Like Cell-Based Assay, Promega Corporation, USA): In primo luogo, un esperimento di vitalità cellulare simultaneo che utilizzava saggi colorimetrici al violetto di cristallo o test MTT che sono stati eseguiti in condizioni assolutamente simili è stato utilizzato per normalizzare questo saggio di bioluminescenza cellulare. Vengono visualizzate le deviazioni standard e la fluorescenza media in campioni triplici di due test separati (n=6). Tutte le misurazioni e gli esperimenti indipendenti (n=2) sono stati eseguiti due volte.

2.3.4. Effetto inibitorio sulla tirosinasi dei funghi senza cellule

Per studiare l'effetto sull'attività enzimatica, i materiali di prova (antiossidanti puri o estratti vegetali metanolici) sono stati pre-incubati con enzimi in tampone fosfato a temperatura ambiente. In poche parole, 300 mL di una soluzione 5 mM di L-DOPA a 50 tampone fosfato mM (pH 6,5) con o senza materiali di prova in varie concentrazioni sono stati aggiunti a un 96-pozzetto micropiastra insieme a 100 mL di una soluzione acquosa di tirosinasi di funghi (20 unità). Per 40 minuti, la miscela di analisi è stata incubata a 25°C. Dopo l'incubazione, il livello di produzione di dopacromo della miscela di reazione è stato misurato spettrofotometricamente a 492 nm [20]. È stata tracciata una curva di calibrazione standard utilizzando acido gallico (0–1000 µg/mL) (y=−0,087 × più 0,45; r2=0,97). Ogni misurazione ed esperimento indipendente (n=2) è stato eseguito due volte.

2.4. Procedure di analisi, isolamento e chiarimento della struttura

La radice macinata (20 g) è stata estratta con 200 mL di metanolo, agitata per 24 h a temperatura ambiente, filtrata, centrifugata a 10,000× g per 15 min, e poi evaporata a 35 ◦C usando un rotante apparecchio di evaporazione sotto vuoto. L'estratto grezzo è stato diluito con 20 mL di acqua distillata, riestratto con 2 × 20 mL di acetato di etile e quindi concentrato utilizzando un sistema di evaporazione rotante sotto vuoto a 35 °C. Il prodotto principale è stato purificato mediante HPLC preparativa utilizzando una colonna Waters C18 (SymmetryPrep 150 × 19 mm, dimensione delle particelle di 7 µm) con le stesse condizioni di gradiente LC utilizzate sopra e una velocità di flusso di 5 mL/min. Il picco a temperatura ambiente era compreso tra 38,8 e 40,8 min, raccolto tra 39,2 e 40,2 min; la raccolta del volume totale è stata liofilizzata per dare 27 mg del composto. MS e NMR 1H e 13C lo hanno quindi identificato.

Le analisi sono state eseguite con un sistema della serie LC 1200 a risoluzione rapida utilizzando un rivelatore a serie di diodi (DAD) utilizzato per il monitoraggio degli spettri UV a 320 nm (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). La separazione dei composti è stata eseguita su una colonna Beckman C18 (ULTRASPHERE 250 mm × 4,6 mm, dimensione delle particelle di 5 µm) utilizzando un gradiente di 47 min di 10 mM di acetato di ammonio/0,2% di acido formico in acqua (v/v), pH 2,9 ({{ 13}}solvente A) e miscela acetonitrile/metanolo 30/70 (=solvente B). La portata era di 0,8 mL/min e il solvente B è stato aumentato dal 5 al 35 percento in 45 minuti e riequilibrato per 2 minuti. In una serie con DAD, è stata utilizzata una serie ESI-QTOF 6520 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) per analisi MS ad alta risoluzione e MS tandem mirate (MS/MS). Gli spettri sono stati acquisiti in modalità di acquisizione negativa e ad alta risoluzione (4 GHz).

Gli spettri 1H NMR e 13C NMR sono stati registrati su uno spettrometro Bruker Avance 300 operante a 300 MHz. I decadimenti di induzione libera sono stati elaborati con la suite NMR MestreNova 5.3.2 di MestreLab Research SL.

2.5. Analisi statistica

Tutti gli esperimenti indipendenti sono stati eseguiti in triplice copia. Tutti i dati sono stati presentati come valori medi ± SD. Utilizzando la versione 6 del programma GraphPad Prism, i risultati sono stati analizzati utilizzando il test Kruskal-Wallis non parametrico insieme al test di confronto multiplo di Dunn. I valori p 0.05 e inferiori sono considerati significativi.

3. Risultati e discussioni

3.1. Contenuto totale di fenoli e flavonoidi degli estratti metanolici

A causa delle loro proprietà redox, è stato scoperto che i composti fenolici delle piante hanno una varietà di impatti biologici, inclusa l'attività antiossidante [21]. La Tabella 1 illustra il contenuto fenolico totale degli estratti di radice di metanolo (500 µg/mL) di varietà suscettibili di ghagras Bouffegous infettate (BI) e non infette (BNI) dal FoA o resistenti come Taabdount (TAAR). La loro concentrazione variava da 171 ± 14 a 253 ± 47 mg di acido gallico eq./g. La quantità più alta di questi composti è stata trovata nella varietà BNI, mentre la concentrazione più bassa proveniva dall'estratto di radice di metanolo di BI. Il numero di flavonoidi in questi stessi estratti (Tabella 1) variava da 240 ± 25 a 406 ± 66 mg di quercetina eq./g, e, ancora una volta, la quantità maggiore è stata attribuita alla varietà BNI. C'è una perdita di circa 1/3 della quantità di un numero totale di polifenoli e flavonoidi tra le varietà non infette (BNI) e le varietà infette (BI) o resistenti (TAAR) al FoA. Pertanto, è interessante verificare come la perdita di composti, descritti come critici per la capacità antiossidante della pianta, possa influenzare le attività biologiche a cui siamo interessati.

3.2. Potenziale antiossidante degli estratti metanolici

L'attività di scavenging dei radicali DPPH è un metodo ampiamente utilizzato per lo screening dell'attività antiossidante degli estratti vegetali [22]. Questo test determina se le sostanze chimiche antiossidanti presenti negli estratti sono in grado di eliminare le specie di radicali stabili DPPH. I dati sperimentali (Figura 1) rivelano che è probabile che tutti gli estratti metanolici (a 100 o 500 µg/mL) abbiano l'effetto di scavenging dei radicali liberi con le più alte attività di scavenging del DPPH osservate nelle radici TAAR (87,0 percentuale di inibizione DPPH). L'attività antiossidante sembra non dipendere dalla presenza della quantità totale di composti polifenolici o flavonoidi. Tuttavia, la migliore attività degli estratti metanolici della radice TAAR potrebbe essere dovuta a più componenti donatori di idrogeno contenuti nell'estratto.

Il potere riducente è valutato dalla capacità dell'estratto metanolico di trasformare il Fe (III) in Fe (II). Questa capacità di ridurre Fe (III) può essere attribuita al numero e alla posizione dei gruppi idrossilici presenti nei composti fenolici e alla loro capacità di donare idrogeno [23]. La tabella 2 ha mostrato le attività riducenti degli estratti metanolici dei nostri campioni di piante rispetto all'acido ascorbico come standard. Gli estratti metanolici delle radici TAAR contengono elevate riduzioni (95 ± 1 mg di acido ascorbico eq./g), mentre il contenuto più basso è stato ottenuto dagli estratti di radice BNI (27 ± 2 mg di acido ascorbico eq./g).

È stata eseguita un'analisi di regressione per correlare i risultati ottenuti (coefficiente di correlazione (R)). Sono state trovate correlazioni lineari significative tra il contenuto totale di fenolici e flavonoidi (R {{0}}.849, p <0.05) e tra DPPH e dosaggio del potere riducente (R=0. 816, p < 0,05), ma non ce n'era nessuno tra i contenuti fenolici o flavonoidi degli estratti metanolici e le loro attività antiossidanti. Infine, tutti gli estratti metanolici hanno mostrato attività antiossidanti significative contro l'attività di scavenging dei radicali DPPH e il dosaggio del potere riducente, ma queste attività antiossidanti sembrano non correlate al contenuto totale di fenolici o flavonoidi. Pertanto, questi risultati implicano che un particolare tipo di sostanza chimica, piuttosto che la quantità di composti fenolici o flavonoidi trovati nei nostri diversi estratti, è molto probabilmente responsabile dell'attività antiossidante degli estratti vegetali in esame. Alcuni componenti fenolici precedentemente descritti e che sono individui altamente attivi possono anche avere un impatto sull'attività antiossidante degli estratti vegetali: indipendentemente dalla loro concentrazione, i composti fenolici presenti nel vino rosso invecchiato possono esibire varie proprietà antiradicaliche legate ai loro aspetti strutturali [ 24].

La varietà TAAR FoA-resistente mostra la più alta attività antiossidante tra le diverse varietà di palme da datteri. Facendo riferimento alla letteratura, lo sviluppo della resistenza in queste particolari palme da datteri può essere attribuito ad un aumento della quantità di diversi isomeri posizionali dell'acido caffeoil shikimico [5].

3.3. Attività della tirosinasi dei funghi

L'attività della tirosinasi difenolasi del fungo catalizza l'ossidazione di due derivati ​​del dopachinone che portano alla sintesi della melanina. I risultati presentati nella Tabella 3 mostrano la capacità dei composti presenti negli estratti metanolici di TAAR, BI e BNI di interferire con l'idrossilazione di l-DOPA attraverso l'inibizione dell'attività della tirosinasi del fungo. Inoltre, questi risultati mostrano che l'estratto metanolico di TAAR è statisticamente più attivo degli estratti di BI (p <0.05) e BNI (p <0,05) sull'attività della tirosinasi dei funghi. Quindi, la capacità degli estratti di radice di dattero di palma di inibire l'attività della tirosinasi sembra seguire lo stesso andamento delle capacità antiossidanti.

Le tirosinasi sono principalmente associate alla pigmentazione della pelle, degli occhi e dei capelli. Infatti, le tirosinasi sono enzimi della melanogenesi coinvolti nelle prime fasi della biosintesi della melanina e la melanina è associata alla protezione contro le radiazioni ultraviolette (UV), solari o gamma, la ridotta suscettibilità cellulare e la resistenza della parete cellulare contro gli enzimi idrolitici [20]. Al contrario, una sovrapproduzione di melanina può svolgere un ruolo nelle anomalie cutanee o in malattie più gravi come il cancro (ad esempio il melanoma) e un eccesso di dopachinone può portare a malattie neurodegenerative (ad esempio il morbo di Parkinson) [20,25]. Inoltre, è stato riportato che la melanogenesi produce perossido di idrogeno e altri ROS, esponendo i melanociti umani ad alti livelli di stress ossidativo [26]. Diversi composti antiossidanti naturali (fenolici, flavonoidi e altri) ottenuti dalle piante hanno inibito l'attività della tirosinasi fenolasi [27,28]. Qui, l'estratto di TAAR sembra contenere uno o più composti suscettibili di inibire l'invecchiamento cutaneo e la melanogenesi.

3.4. Attività del proteasoma degli estratti metanolici della palma da datteri

È stato riportato che livelli elevati del proteasoma 20S portano a una maggiore tolleranza allo stress ossidativo [13]. Pertanto, è stata studiata la regolazione dell'attività del proteasoma da parte degli estratti di radice di cultivar BI, BNI e TAAR. L'attività misurata del proteasoma 20S è correlata all'attività simile alla chimotripsina (CT-L) nelle cellule invecchiate con NHDF (vedi Materiali e metodi). Come illustrato nella Figura 2A, le cellule trattate con 50 g/mL di estratti metanolici per 24 ore hanno mostrato un'attivazione significativa del CT-L per estratti BI e TAAR e un'inibizione per BNI senza generare più del 30 percento di tossicità cellulare. L'estratto di radice di TAAR ha mostrato un'attivazione coinvolgente del proteasoma rispetto a quella di 1 µM di acido lipoico (Ct più) (rispettivamente 212% e 248%). Il proteasoma è un complesso proteasico cilindrico contenente un nucleo di quattro anelli impilati responsabili della rimozione del proteasoma anormalmente degradato (26S) e delle proteine ​​danneggiate ossidativamente (complesso del nucleo proteolitico 20S) (Ciechanover, 1998). Come presentato nel lavoro di Hwang [29], la disfunzione del proteasoma può contribuire all'invecchiamento della pelle umana. In effetti, l'invecchiamento e le cellule senescenti replicative hanno dimostrato di avere una ridotta attività del proteasoma così come i livelli proteici delle subunità del proteasoma. Il fatto che sia le proteine ​​cellulari ossidate che quelle danneggiate si accumulino più spesso in queste cellule suggerisce che la via ubiquitina-proteasoma della degradazione proteica sia implicata nei processi di invecchiamento intrinseco. Le figure 2B e C mostrano la capacità dell'estratto metanolico TAAR di proteggere le cellule invecchiate con NHDF dall'inibizione dell'attività del proteasoma 20S da parte dell'ossidante OCl-. Infatti, l'ossidante OCl− inibisce al 50 percento l'attività del proteasoma delle cellule di controllo (Ct), mentre il più alto attivatore del proteasoma 20S (acido lipoico a 1 µM, Ct plus) con più del 50 percento dell'attività di inibizione non riesce a invertire l'inibizione dell'attività del proteasoma 20S da parte dell'OCl−, mentre tutte le altre concentrazioni testate (15, 50 e 75 µg/mL) dell'estratto metanolico di TAAR sembrano invertire questa inibizione (da 0 a 19 percento di inibizione). Questi risultati suggeriscono che gli estratti di radice di TAAR potrebbero contenere molecole che potrebbero ritardare l'invecchiamento cutaneo non solo stimolando l'attività del proteasoma, ma anche contrastando gli effetti inibitori degli agenti ossidanti. Tra queste molecole è molto probabile che sia presente l'acido caffeoil shikimico, così come altri composti. Inoltre, sono state condotte analisi LC-DAD-MS (MS) e NMR per identificare i principali composti degli estratti e sono qui discusse nella sezione successiva.

3.5. Analisi spettrometriche

3.5.1. Analisi LC-DAD-MS di estratti metanolici

Lo studio comparativo delle radici della palma da datteri non ha rivelato differenze qualitative, ma, invece, sono state notate in una certa misura differenze semi-quantitative (nei cromatogrammi DAD e MS) tra le cultivar (Figura 3A, D). In effetti, i risultati attuali non consentono un collegamento tra la resistenza delle palme da dattero a un aumento della quantità di diversi isomeri posizionali dell'acido caffeoil shikimico perché la cultivar resistente (TAAR) mostra l'abbondanza relativa più bassa di questi composti (Figura 3C). Tutti e tre gli isomeri posizionali dell'acido caffeoil shikimico (m/z=335.0768 con un errore di 1,2 ppm) sono stati identificati dai loro spettri MS/MS (Figura S6) con un frammento a m/z 179.0340, corrispondente ad un frammento di acido caffeico A (C9H7O4) e un frammento a m/z 135.0443, corrispondente alla decarbossilazione dell'acido caffeico (C8H7O2). Tuttavia, un altro composto che non corrisponde agli acidi caffeoyl shikimic (Figura 3C) e il cui tempo di ritenzione è di 29 min con m/z=259.0607 (o 373.0543 per l'addotto TFA), sembra essere chiaramente distinto tra diverse cultivar (Figura 3D). La differenza nell'accumulo di questo composto nelle radici di cultivar sensibili e resistenti (0,135 percento), con un rapporto intorno a 1:35 (da m/z=259.06, dati MS), potrebbe spiegare il prominente biologico attività osservate per l'estratto metanolico di questa radice.

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