Un regime eterologo di innesco AZD1222 e potenziamento di BNT162b2 suscita in modo più efficiente anticorpi neutralizzanti, ma non cellule T di memoria, rispetto al regime omologo BNT162b2

astratto

Contesto: sono necessarie analisi comparative delle risposte immunitarie specifiche per SARS-CoV-2-indotte da diversi regimi di potenziamento primario per stabilire regimi efficienti per il controllo di COVID-19. Metodo: in questo studio prospettico di coorte osservazionale, l'immunoglobulina G (IgG) e gli anticorpi neutralizzanti (nAbs) specifici per il picco insieme a risposte delle cellule T specifiche per il picco in gruppi di pari età di vaccinazione omologa BNT162b2/BNT162b2 o AZD1222/AZD1222, eterologa AZD1222/ Sono state valutate la vaccinazione BNT162b2 e la precedente infezione/vaccinazione SARS-CoV-2 wild-type. Risultati: le risposte immunitarie di picco sono state raggiunte dopo la seconda dose di vaccino nei gruppi vaccinati naïve e dopo la prima dose nel gruppo di infezione/vaccinazione precedente. I titoli di picco di IgG anti-spike e nAb erano significativamente più alti nei gruppi vaccinati con AZD1222/BNT162b2 e con precedente infezione/vaccinazione rispetto ai gruppi BNT162b2/BNT162b2 o AZD1222/AZD1222. Tuttavia, la frequenza di cellule T CD4 più produttrici di interferone-c era più alta nel gruppo di vaccinazione BNT162b2/BNT162b2. Risultati simili sono stati osservati nell'analisi delle cellule T polifunzionali. Quando sono state analizzate le risposte delle cellule nAb e CD4 più T contro la variante Delta, il gruppo di infezione/vaccinazione precedente ha mostrato risposte più elevate rispetto ai gruppi di altri regimi di vaccinazione omologhi o eterologhi. Conclusione: nAbs sono stimolati in modo efficiente dalla vaccinazione eterologa AZD1222/BNT162b2, nonché da precedenti infezioni/vaccinazioni, mentre le risposte delle cellule T e CD4 specifiche del picco sono suscitate in modo efficiente dalla vaccinazione omologa BNT162b2. L'immunità che riconosce la variante è generata in modo più efficiente da una precedente infezione/vaccinazione rispetto agli altri regimi di vaccinazione omologa o eterologa.

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1. Introduzione

Sindrome respiratoria acuta grave coronavirus 2 (SARS-CoV-2) si è diffuso a livello globale sin dalla sua comparsa nel dicembre 2019 e lo sviluppo di vaccini efficaci contro la malattia da coronavirus 2019 (COVID-19) è stato accelerato [1 ]. Il successo dell'impresa è stato visto in tempi relativamente brevi e diversi vaccini che impiegano la proteina spike (S) come antigene del vaccino hanno dimostrato con successo la sicurezza e l'efficienza nella prevenzione del COVID sintomatico-19. In particolare, il vaccino a base di mRNA BNT162b2 (Comirnaty, Pfifizer-BioNTech) e il vaccino a base di adenovirus AZD1222 (Vaxzevria, AstraZeneca) sono stati inizialmente approvati e ampiamente somministrati come regime di primo potenziamento a due dosi. Due dosi di BNT162b2 hanno avuto un'efficacia del 95% (95% intervallo di confidenza [CI], 90-98%) contro il COVID sintomatico-19 [2], e due dosi di AZD1222 hanno avuto un'efficacia del 70% (95% CI, 55-81 percentuale ) efficacia [3]. Curiosamente, i regimi eterologhi prime-boost di vaccini COVID-19 autorizzati hanno riscosso notevole interesse e sono stati successivamente avviati in diversi paesi nonostante i dati insufficienti in merito all'immunogenicità e alla sicurezza. BNT162b2 somministrato come dose boost in soggetti vaccinati con AZD1222 indotti da robusti titoli anticorpali (Ab) immunoglobulina G (IgG) specifici per S, risposte anticorpali neutralizzanti (nAb) e cellule T interferone-c plus (IFN-c plus) [4 ,5]. Tuttavia, pochi studi hanno valutato l'efficacia della vaccinazione eterologa AZD1222/BNT162b2 rispetto alla vaccinazione omologa BNT162b2/BNT162b2 [6-8], e questi studi mancavano di una valutazione completa delle risposte delle cellule T specifiche. Di conseguenza, rimane poco chiaro se la vaccinazione eterologa AZD1222/BNT162b2 si traduca in potenti risposte nAb o T-cellula cross-variant. Un altro esempio di priming-boosting eterologo può essere visto in individui che erano stati infettati da SARS-CoV-2 e successivamente vaccinati contro il virus. Diversi studi hanno suggerito che i livelli specifici di Ab e nAb leganti sono rilevati in livelli elevati in individui con precedente infezione e vaccinazione, sebbene non siano state effettuate analisi comparative [9,10]. Gli operatori sanitari con precedente infezione da SARS-CoV-2 hanno titoli Ab più elevati in risposta a una singola dose di vaccino a mRNA rispetto a quelli che non erano stati precedentemente infettati [11]. Inoltre, gli individui con precedente infezione mostrano risposte potenziate delle cellule T specifiche S e risposte delle cellule B di memoria che secernono Ab dopo la dose primaria senza la dose boost [12]. Nel presente studio, abbiamo esaminato in modo completo l'immunogenicità umorale e cellulare dei regimi prime-boost omologhi ed eterologhi in una coorte osservazionale prospettica con confronti affiancati di anticorpi specifici per S, nAb e CD4 specifici per S più risposte di cellule T . Abbiamo anche valutato gli esiti immunologici nei partecipanti che erano stati infettati da SARS-CoV -2 di tipo selvatico e avevano ricevuto vaccini COVID-19 per determinare se l'infezione e la vaccinazione precedenti suscitassero in modo efficiente risposte immunitarie contro la variante Delta.

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2. Metodi

2.1. Progettazione dello studio

Nel marzo 2021 è stata istituita una coorte prospettica multicentrica per studiare le risposte immunitarie alla vaccinazione COVID-19. I partecipanti a questa coorte sono stati reclutati volontariamente tra gli operatori sanitari e inizialmente programmati per ricevere due dosi di BNT162b2 a un intervallo di 3-settimane o AZD1222 a un intervallo di 12-settimane. Tuttavia, una parte degli individui vaccinati con AZD1222 ha ricevuto la dose di richiamo di BNT162b2 tra maggio e giugno 2021 ed è stata inclusa nel gruppo di vaccinazione AZD1222/BNT162b2. Tra i partecipanti alla coorte, quelli che avevano avuto una precedente infezione da SARSCoV -2 wild-type e avevano ricevuto BNT162b2 o AZD1222 sono stati inclusi come gruppo di infezione/vaccinazione precedente. Tutti i destinatari del vaccino analizzati in questo studio erano di pari età tra i gruppi. I campioni di sangue periferico sono stati raccolti da tutti i partecipanti alla coorte in ogni punto temporale (T): prima e 3 settimane dopo la prima dose di vaccino (T1 e T2, rispettivamente), 5 settimane dopo la prima dose di BNT162b2 o 11 settimane dopo la prima dose di AZD1222 (T3) e 14 settimane dopo la prima dose di vaccino (T4). Una rappresentazione schematica del protocollo di studio è fornita in Fig. 1. Per confronto, sono stati ottenuti campioni convalescenti da pazienti non vaccinati infettati con la variante SARSCoV-2 Delta confermata dalla reazione a catena della polimerasi di trascrizione inversa in tempo reale utilizzando il Seegene Allplex { {38}}nCoV Assay kit (Seegene, Corea) e Illumina BTSeq SARS-CoV-2 kit di sequenziamento dell'intero genoma (Celemics Inc, Corea) su un sequenziatore MiSeq (150-bp modalità paired-end; Illumina, San Diego, CA, USA). La sequenza di base ottenuta tramite BTseq è stata confrontata con la sequenza di riferimento NCBI NC_045512.2 utilizzando il software IGV 2.10 per confermare la variante Delta. Lo studio è stato approvato dai comitati di revisione istituzionale di ciascun istituto partecipante e condotto secondo i principi della Dichiarazione di Helsinki. Tutti i partecipanti hanno fornito il consenso informato scritto prima dell'arruolamento.

2.2. Partecipanti allo studio

Questa coorte comprendeva 22 partecipanti che hanno ricevuto la vaccinazione omologa BNT162b2/BNT162b2 (età media, 38.0 anni; 31,8% uomini), 20 partecipanti che hanno ricevuto la vaccinazione omologa AZD1222/AZD1222 (età media, 39,7 anni; 23,8% uomini) e 9 partecipanti che hanno ricevuto la vaccinazione eterologa AZD1222/BNT162b2 (età media, 38,2 anni; 33,3% uomini). Degli 11 partecipanti con precedente infezione da SARS-CoV-2 wild-type (età media, 38,5 anni; 27,3% uomini), 2 e 9 sono stati vaccinati rispettivamente con BNT162b2/BNT162b2 e AZD1222/AZD1222. I dati demografici dei diversi gruppi vaccinati sono forniti nella Tabella supplementare 2. Tutti i partecipanti con precedente infezione da SARS-CoV di tipo selvaggio-2 hanno manifestato COVID asintomatico o lieve-19 e 3 di loro avevano la polmonite. Il tempo mediano dalla conferma del COVID-19 alla prima vaccinazione è stato di 121,5 (intervallo interquartile [IQR], 102,3–252,5) giorni. I dati demografici dei partecipanti con precedente infezione e vaccinazione SARS-CoV -2 wild-type sono forniti nella Tabella supplementare 1. I campioni convalescenti sono stati ottenuti da 17 pazienti (età media, 53 anni; 52,9% uomini) infettati dalla SARS -CoV-2 Variante Delta e ricoverato in ospedale per COVID-19 da moderato a critico (moderato, 17,6%; grave, 35,3%; malato critico, 47,1%). Il tempo mediano dall'insorgenza dei sintomi correlati al COVID-19-al campionamento è stato di 24 (IQR, 22-32) giorni. I dati demografici dei partecipanti convalescenti SARS-CoV-2 Delta sono forniti nella Tabella supplementare 2 e nella Tabella 3.

2.3. Anticorpi leganti

Gli anticorpi leganti specifici per SARS-CoV-2 S sono stati analizzati utilizzando un test immunologico commerciale. Il test Elecsys anti-S protein (Roche Diagnostics, Germania) è un test immunologico a elettrochemiluminescenza utilizzato per rilevare anticorpi specifici per SARS-CoV-2 S sull'analizzatore Cobas e411 (Roche Diagnostics, Germania), con un intervallo di misurazione da { {8}}.4 U/mL a 250 U/mL (fino a 2500 U/mL con diluizione 1:10 integrata e fino a 12.500 U/mL con diluizione 1:50 integrata). Il dominio di legame del recettore ricombinante della proteina S è stato utilizzato con un principio di sandwich a doppio antigene. Gli antigeni nel reagente catturano prevalentemente IgG anti-SARSCoV-2. Il test della proteina anti-nucleocapside Elecsys (Roche Diagnostics, Germania) è stato utilizzato per rilevare precedenti infezioni da SARS-CoV-2, con un indice di cut-off di 1,0.

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2.4. Saggio di neutralizzazione della riduzione della placca

Saggi di neutralizzazione della riduzione della placca per i virus SARS-CoV- 2 wild-type (BetaCoV/Korea/KCDC03/2020) e il ceppo variante Delta YS117 (numero di accesso GenBank MZ798798 e numero di accesso GISAID EPI{ {8}}ISL_3411836) sono stati eseguiti utilizzando campioni di plasma. Il virus è stato coltivato su cellule Vero E6 in un laboratorio di livello 3 di biosicurezza presso l'Avison Biomedical Research Center di Seoul, in Corea. I campioni di plasma inattivato (135 lL) di campioni di plasma inattivato sono stati 2-volte diluiti in serie (da 1:40 a 1:1280) e aggiunti a un volume uguale di 100 volte la dose infettiva della coltura tissutale al 50% (TCID50) del virus. Gli isolati contenenti 100 volte il TCID50 sono stati incubati in 96-pozzetti per 60 minuti a 37°C. Le miscele virus-plasma sono state incubate per 60 minuti a 37°C in un incubatore a CO2. Le miscele virus-plasma sono state quindi aggiunte alle cellule Vero E6 seminate in una 24-pozzetto con 1x105 cellule/pozzetto e incubate per 1 ora a 37°C. Terreno di sovrapposizione composto dal 2% di siero bovino fetale (FBS) in DMEM e l'1% di agar è stato aggiunto alle cellule E6 e incubate per 3 giorni a 37°C in un incubatore a CO2. Dopo che si è formata una placca, sono stati usati una soluzione di formaldeide al 10% e rosso neutro allo 0,33% in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) per fissare e colorare lo strato di coltura cellulare. La diluizione neutralizzante di ciascun campione è stata determinata identificando il pozzetto con la più alta diluizione plasmatica senza un effetto citopatico osservabile. Le dosi di neutralizzazione del 50% (ND50) sono state espresse come diluizione reciproca del plasma, che ha comportato una riduzione del 50% del numero di placche rispetto al controllo positivo del virus. Il metodo Spearman-Kärber è stato utilizzato per calcolare i titoli ND50. Rispetto ai sieri standard internazionali dell'OMS (NIBSC 20–136; titolo nAb: 1000 IU/mL), i titoli nAb sono stati convertiti in unità internazionali per millilitro (IU/mL).

Fig. 1. Rappresentazione schematica delle coorti di destinatari del vaccino. Schema di studio per il rilevamento di anticorpi leganti specifici del picco SARS-CoV-2, anticorpi neutralizzanti e risposte delle cellule T in campioni di sangue periferico di individui vaccinati per COVID-19. Lo studio include BNT162b2/BNT162b2 (n=22), AZD1222/AZD1222 (n=20), AZD1222/BNT162b2 (n=9) e SARS-CoV wild-type precedente{{20 }} gruppi di infezione/vaccinazione (n=11). Tra le precedenti infezioni/vaccinazioni da SARS-CoV-2 wild-type, 2 e 9 sono stati vaccinati rispettivamente con BNT162b2/BNT162b2 e AZD1222/AZD1222. La storia dell'infezione da SARS-CoV-2 è stata confermata da un test positivo per gli anticorpi anti-SARS-CoV-2 nucleocapside. T, punto temporale; settimane, settimane.

2.5. Saggi delle cellule T

Le cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) sono state isolate mediante centrifugazione in gradiente di densità utilizzando provette Leucosep (Greiner Bio-One) contenenti mezzo di separazione dei linfociti. Dopo la centrifugazione a 800 g per 15 minuti con il freno, la frazione cellulare arricchita costituita da PBMC è stata raccolta e lavata con 20 mL di PBS. Dopo la centrifugazione a 300 g per 10 minuti, il pellet cellulare è stato risospeso in 10 mL di PBS per il conteggio. Dopo la centrifugazione a 300 g per 10 minuti, le cellule sono state crioconservate in FBS con il 10% di dimetilsolfossido a 180°C fino all'uso. Per la colorazione delle citochine intracellulari (ICS) di IFN-c, interleuchina-2 (IL-2) e fattore di necrosi tumorale (TNF), abbiamo utilizzato pool peptidici di 15-mer peptidi sovrapposti di 11 aminoacidi che coprono le parti immunodominanti della proteina SARS-CoV-2 Wuhan S (aa 304–338, 421–475, 492–519, 683–707, 741–770, 785–802 e 885–1273; Miltenyi Biotec). Per confrontare le risposte delle cellule T rispetto ai ceppi Wuhan e Delta, abbiamo utilizzato due diversi set di pool di peptidi S comprendenti regioni non conservate di sequenze S tra i ceppi Wuhan e Delta (lignaggio B.1.617.2) (Miltenyi Biotec). Dopo aver scongelato le PBMC e averle fatte riposare per una notte, 1  106 le PBMC sono state stimolate con pool di peptidi a una concentrazione finale di 1 mg/mL e CD28/CD49d anti-umano (1 mg/mL; BD Biosciences) per 1 ora in { {45}}piastra a pozzetti in terreno RPMI-1640 contenente l'1% di penicillina-streptomicina, 2 mM di L-glutammina e il 10% di FBS. La coltura di PBMC è stata incubata per altre 5 ore dopo l'aggiunta di brefeldina A e monensina (BD Biosciences) a 37°C in 5% di CO2. Dopo la stimolazione, le cellule sono state lavate con PBS e colorate con Live/Dead-Aqua (Invitrogen) per 20 minuti a temperatura ambiente, seguite da un cocktail di Abs di superficie per 20 minuti a temperatura ambiente, incluso l'anti-CD14- BV510, anti-CD19-BV510, anti-CD4- BV650, anti-CD3-BV786 e anti-CD8-APC-Cy7 (BD Bioscience). Le cellule sono state fissate e permeabilizzate usando un Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set (eBioscience) e poi colorate con un cocktail di Ab intracellulare, tra cui anti-TNF-FITC, anti-IL-2-PE (eBioscience) e anti- IFN-c-APC (BD Biosciences) per 20 minuti a temperatura ambiente. Al termine della colorazione, le cellule sono state analizzate su uno strumento LSR II con FACSDiva (BD Biosciences) e i dati sono stati analizzati nel software FlowJo (FlowJo LLC).

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2.6. analisi statistica

I dati tracciati in scala lineare sono stati espressi come media ± deviazione standard. I dati tracciati in scale logaritmiche sono stati espressi come media geometrica ± deviazione standard geometrica. I test Mann-Whitney U o Wilcoxon sono stati applicati rispettivamente per confronti non appaiati o appaiati. Le analisi statistiche sono state {{0}}in coda, con P < 0.05 considerato significativo. Tutte le analisi sono state eseguite in R studio o GraphPad Prism v9.0.

3. Risultati

3.1. Cinetica delle risposte immunitarie suscitate da diversi regimi vaccinali

In primo luogo, abbiamo esaminato i titoli di IgG anti-S dopo la vaccinazione con diversi regimi. Come previsto, la prima dose ha aumentato significativamente i titoli di IgG anti-S (T2) e la seconda dose ha ulteriormente aumentato significativamente i titoli di IgG anti-S nella vaccinazione omologa BNT162b2/BNT162b2 (T3) e AZD1222/AZD1222 (T4) e nella vaccinazione eterologa AZD1222/ Gruppi di vaccinazione BNT162b2 (T4) (Fig. 2A). Nel gruppo con precedente infezione/vaccinazione, la prima dose ha aumentato al massimo i titoli di IgG anti-S (T3), ma la seconda dose non ha aumentato ulteriormente i titoli di IgG anti-S (T4). Abbiamo anche esaminato le risposte delle cellule T e CD4 S-specifiche in seguito alla stimolazione diretta ex vivo con pool peptidici che coprono la sequenza della proteina S SARSCoV-2 Wuhan wild-type. Sulla base di ICS, la prima dose ha aumentato significativamente la frequenza delle cellule produttrici di IFN-c tra le cellule CD4 più T e la seconda dose ha ulteriormente aumentato significativamente la frequenza nei gruppi di vaccinazione BNT162b2/BNT162b2 (T3) e AZD1222/BNT162b2 (T4) (figura 2B). Nei gruppi AZD1222/AZD1222 e precedente infezione/vaccinazione, la prima dose ha aumentato significativamente la frequenza delle cellule IFN-c plus tra le cellule T CD4 plus, ma la seconda dose non ha aumentato ulteriormente la frequenza.

3.2. Confronto dei titoli Ab tra diversi regimi

Successivamente, abbiamo confrontato i titoli di picco di Ab legante tra i diversi regimi di vaccinazione. Come titoli di picco, abbiamo selezionato titoli di IgG anti-S dopo la seconda dose nei gruppi di vaccinazione BNT162b2/BNT162b2, AZD1222/AZD1222 e AZD1222/BNT162b2 e dopo la prima dose nel gruppo di infezione/vaccinazione precedente. I titoli di picco di IgG anti-S erano significativamente più alti nel gruppo di vaccinazione AZD1222/BNT162b2 rispetto ai gruppi di vaccinazione BNT162b2/BNT162b2 o AZD1222/AZD1222 (Fig. 3A). Allo stesso modo, i titoli di picco di IgG anti-S erano significativamente più alti nel gruppo di infezione/vaccinazione precedente rispetto ai gruppi di vaccinazione BNT162b2/BNT162b2 o AZD1222/AZD1222. Non c'era alcuna differenza nei titoli di IgG anti-S tra i gruppi AZD1222/BNT162b2 e quelli con precedente infezione/-vaccinazione. Abbiamo anche valutato i titoli nAb nei momenti di picco: dopo la seconda dose nei gruppi di vaccinazione BNT162b2/BNT162b2, AZD1222/AZD1222 e AZD1222/BNT162b2 e dopo la prima dose nel gruppo di infezione/vaccinazione precedente. Sorprendentemente, i titoli nAb erano significativamente più alti nel gruppo di vaccinazione AZD1222/BNT162b2 rispetto ai gruppi di vaccinazione BNT162b2/BNT162b2 o AZD1222/AZD1222 (Fig. 3B). Inoltre, i titoli nAb erano significativamente più alti nel gruppo di infezione/vaccinazione precedente rispetto ai gruppi di vaccinazione BNT162b2/BNT162b2 o AZD1222/AZD1222. Non c'era alcuna differenza nei titoli di nAb tra i gruppi AZD1222/BNT162b2 e quelli con infezione/vaccinazione precedenti. Il livello di risposta umorale suscitato da diversi regimi di vaccinazione è stato classificato in forte, moderato e nessuno/debole in base alla classifica percentile. La percentuale di risposte forti era più alta nel gruppo di infezione/vaccinazione precedente, seguito dal gruppo di vaccinazione AZD1222/BNT162b2 per quanto riguarda l'analisi di IgG anti-S (Fig. 3C) e nAb (Fig. 3D). Presi insieme, questi risultati indicano che l'adescamento e il potenziamento eterologhi, inclusa la vaccinazione AZD1222/BNT162b2 e la precedente infezione/vaccinazione, è più efficiente nella generazione di risposte umorali rispetto al priming e al potenziamento omologhi.

3.3. Confronto di CD4 S-specifici più risposte di cellule T tra diversi regimi

Abbiamo anche confrontato le risposte dei linfociti T e CD4 S-specifiche tra i diversi regimi di vaccinazione nei momenti di picco: dopo la seconda dose nei gruppi di vaccinazione BNT162b2/BNT162b2, AZD1222/AZD1222 e AZD1222/BNT162b2 e dopo la prima dose nei gruppi di vaccinazione precedenti gruppo infezione/vaccinazione. A differenza dei titoli anti-S IgG e nAb, la frequenza delle cellule IFN-c plus tra le cellule T CD4 plus era più alta nel gruppo di vaccinazione BNT162b2/BNT162b2 (Fig. 4A). La percentuale di risposte forti era anche più alta nel gruppo di vaccinazione BNT162b2/BNT162b2, seguito dal precedente gruppo di infezione/vaccinazione (Fig. 4B). Questi risultati mostrano che l'immunizzazione con il secondo boost omologo di BNT162b2 suscita in modo più efficiente le risposte delle cellule T della memoria rispetto alla seconda vaccinazione boost eterologa o alla prima dose di vaccinazione dopo l'infezione naturale da SARS-CoV-2. Al contrario, i regimi prime-boost eterologhi hanno maggiori probabilità di sviluppare livelli più elevati di risposte immunitarie umorali. Abbiamo anche analizzato la frequenza relativa delle cellule CD4 più T polifunzionali che producono simultaneamente più citochine (cioè IFN-c, IL-2 e/o TNF). Il gruppo di vaccinazione BNT162b2/BNT162b2 ha mostrato frequenze significativamente più elevate di cellule polifunzionali che producono 2 citochine tra cellule CD4 più T specifiche per S rispetto ai gruppi di vaccinazione AZD1222/AZD1222 o AZD1222/BNT162b2 (Fig. 4C). Non c'era differenza nella frequenza tra la vaccinazione BNT162b2/BNT162b2 e i gruppi di infezione/vaccinazione precedenti. La frequenza delle cellule polifunzionali era significativamente più alta nel gruppo di vaccinazione AZD1222/BNT162b2 rispetto al gruppo di vaccinazione AZD1222/AZD1222. I grafici a torta che rappresentano i linfociti T CD4 più positivi singoli, doppi e tripli in termini di produzione di citochine che rispondono ai pool di peptidi sovrapposti S indicano anche una frequenza relativamente alta di cellule positive doppio o triplo nella vaccinazione BNT162b2/BNT162b2 e precedente gruppi di infezione/-vaccinazione (Fig. 4D).

3.4. Risposte immunitarie contro la variante Delta tra diversi regimi

Infine, abbiamo analizzato le risposte immunitarie contro la variante Delta. In questa analisi, abbiamo incluso individui convalescenti che si sono ripresi dall'infezione SARS-CoV-2 Delta per confronto. I titoli nAb specifici della variante Delta erano significativamente più alti nel gruppo di infezione/vaccinazione precedente rispetto ai gruppi di vaccinazione BNT162b2/BNT162b2, AZD1222/AZD1222 o AZD1222/BNT162b2, ed erano persino più alti di quelli negli individui convalescenti Delta (Fig. 5A) . Abbiamo anche esaminato le risposte delle cellule T CD4 plus contro la proteina S della variante Delta. In questa analisi, abbiamo eseguito ICS di IFN-c in seguito a stimolazione ex vivo diretta utilizzando due diversi set di pool di peptidi S comprendenti regioni non conservate di sequenze S tra i ceppi di Wuhan e Delta e calcolato il rapporto tra la frequenza di Delta Sspecific IFN-c più cellule alla frequenza delle cellule IFN-c plus specifiche per Wuhan S. Come previsto, il rapporto era più alto negli individui Delta convalescenti. Curiosamente, il rapporto era più alto nel gruppo di infezione/vaccinazione precedente rispetto al gruppo di vaccinazione BNT162b2/BNT162b2 (Fig. 5B), sebbene le risposte delle cellule T CD4 più specifiche di Wuhan S fossero più alte nel gruppo di vaccinazione BNT162b2/BNT162b2 (Fig. 4A). Presi insieme, questi risultati indicano che le risposte delle cellule T nAb e CD4 plus che riconoscono in modo incrociato la variante Delta sono generate in modo più efficiente da una precedente infezione/vaccinazione rispetto ai regimi di vaccinazione omologa o eterologa.

Fig. 2. Risposte di anticorpi e cellule T provocate da diversi regimi di prime-boost. Risposte immunitarie longitudinali secondo il programma di campionamento dalla pre-vaccinazione a 14 settimane dopo la prima vaccinazione. (A) Gli anticorpi leganti specifici del picco SARS-CoV-2 sono stati misurati in BNT162b2/BNT162b2 (n=22), AZD1222/AZD1222 (n=20), AZD1222/ BNT162b2 (n {{ 20}}) e precedenti gruppi di infezione/vaccinazione (n=6). (B) SARS-CoV-2 CD4 specifico per picco più risposte delle cellule T sono state misurate in BNT162b2/BNT162b2 (n=19), AZD1222/AZD1222 (n=18), AZD1222/BNT162b2 (n=9) e precedenti gruppi di infezione/vaccinazione (n=7). I dati sono presentati come media geometrica ± SD geometrica (A) o media ± SD (B). Le analisi statistiche tra i punti temporali all'interno di ciascun gruppo sono state eseguite utilizzando il test dei ranghi con segno di Wilcoxon. ns, non significativo; *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001.

Fig. 3. Risposte immunitarie umorali nei momenti di picco. (A) Gli anticorpi leganti specifici del picco SARS-CoV-2 sono stati confrontati tra BNT162b2/BNT162b2 (n=22), AZD1222/AZD1222 (n=20), AZD1222/BNT162b2 (n {{ 15}}) e precedenti gruppi di infezione/vaccinazione (n=6) nei momenti di punta. (B) Gli anticorpi neutralizzanti sono stati confrontati tra BNT162b2/BNT162b2 (n {= 22), AZD1222/AZD1222 (n=20), AZD1222/BNT162b2 (n=9) e precedenti infezioni/vaccinazioni ( n=11) gruppi nelle ore di punta. I momenti di picco sono stati selezionati come segue: dopo la seconda dose nei gruppi di vaccinazione BNT162b2/BNT162b2, AZD1222/AZD1222 e AZD1222/BNT162b2 e dopo la prima dose nel gruppo di infezione/vaccinazione precedente. I dati sono presentati come media geometrica ± DS geometrica e analizzati per significatività utilizzando il test di Mann-Whitney. (C e D) Le percentuali di partecipanti con diversi livelli di risposte immunitarie umorali. La quantificazione del tipo di responder (forte, moderato e nessuno/debole) è espressa come frazione del numero di destinatari del vaccino in ciascun gruppo. I tipi di responder sono stati determinati dal punteggio percentile calcolato da tutti i partecipanti vaccinati. ns, non significativo; *P < {{40}}.05, **P < 0.01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001.

4. Discussione

I vaccini a mRNA attualmente autorizzati e i vaccini vettoriali adenovirus hanno dimostrato una notevole efficacia nella prevenzione del COVID-19. Tuttavia, si ritiene che la vaccinazione eterologa prime-boost migliori l'immunogenicità e mitighi le carenze di approvvigionamento intermittenti [13]. Inoltre, sono stati sollevati problemi di sicurezza con i vaccini vettoriali dell'adenovirus dopo il riconoscimento di eventi avversi gravi, inclusa la trombosi venosa pericolosa per la vita associata alla vaccinazione AZD1222, specialmente nelle donne più giovani [14,15]. Questi hanno portato all'immunizzazione di richiamo dell'mRNA eterologo per coloro che avevano già ricevuto la prima dose di AZD1222. Sebbene non fossero disponibili dati sull'efficienza, molte autorità sanitarie nazionali hanno adottato regimi eterologhi di vaccini COVID-19 autorizzati. Pertanto, uno studio comparativo delle risposte immunitarie umorali e cellulari suscitate da diversi regimi di vaccinazione prime-boost è informativo e aiuta a comprendere meglio le sfide del mondo reale. Nel presente studio, abbiamo dimostrato l'induzione differenziale dell'immunità umorale e cellulare mediante vaccinazioni prime-boost eterologhe (Tabella Supplementare 4). In netto contrasto sia con i livelli specifici di anticorpi leganti che con i titoli di neutralizzazione, che erano più alti nel gruppo vaccinato con AZD1222/BNT162b2, le risposte dei linfociti T e CD4 specifici per S erano più alte nel gruppo vaccinato con BNT162b2/BNT162b2, non nel gruppo vaccinato con AZD1222/BNT162b2 gruppo. I livelli relativamente bassi di risposte dei linfociti T e CD4 S-specifici nei partecipanti vaccinati con AZD1222/BNT162b2- erano inaspettati e potrebbero comunque esporre questi individui al rischio di una grave infezione da SARS-CoV-2. I nostri risultati differiscono da quelli riportati da Schmidt e colleghi, che hanno suggerito che, dopo il potenziamento eterologo di BNT162b2, i titoli nAb e le risposte delle cellule T erano significativamente aumentati negli individui con AZD1222-innestato [7]. Tuttavia, la frequenza assoluta delle cellule CD69 plus IFN-c plus tra le cellule CD4 plus T era aumentata solo marginalmente e questo studio ha precluso analisi approfondite della polifunzionalità delle risposte delle cellule T specifiche S. Per gli individui che erano stati precedentemente infettati, la prima dose di vaccino può fungere da richiamo dell'immunizzazione e indurre potentemente risposte umorali e cellulari [16,17]. Poiché si presume che il titolo nAb sia un correlato chiave della protezione contro l'infezione da SARS-CoV-2 [18], i nostri risultati si adattano bene alla recente scoperta di un potenziamento benefico dell'immunità acquisita dall'infezione, con l'efficacia del vaccino aggiustata di > 90 percento dopo la prima dose nei destinatari del vaccino che avevano una precedente infezione da SARS-CoV-2 [19]. Inoltre, nonostante la considerevole fuga di risposte di nAb contro la variante Delta tra i partecipanti allo studio, abbiamo osservato i più alti livelli di riconoscimento incrociato di nAb per la variante Delta nel gruppo di partecipanti con precedente infezione da SARS-CoV -2 wild-type e vaccinazione. Tuttavia, in linea con il gruppo di vaccinazione eterologa AZD1222/BNT162b2, quelli con precedente infezione che erano stati vaccinati avevano una risposta CD4 più T-specifica S più debole rispetto agli individui con vaccinazione omologa BNT162b2/BNT162b2 senza precedente infezione. In particolare, i nostri risultati mostrano che due dosi di BNT162b2 portano a un'induzione affidabile e robusta di risposte CD4 specifiche per S più cellule T, significativamente più alte rispetto ad altri regimi di vaccinazione di primo richiamo. Questi risultati sono coerenti con un recente rapporto su quattro diversi vaccini COVID-19 [20], mentre la nostra analisi includeva regimi prime-boost eterologhi e immunità ibrida da precedenti infezioni e vaccinazioni. Di conseguenza, le piattaforme di vaccini a mRNA potrebbero essere selezionate per la loro capacità di indurre robuste risposte di memoria CD4 più cellule T. Con l'aumento dell'incidenza di infezioni da rottura dopo la vaccinazione in tutto il mondo, c'è un crescente interesse per l'immunità che protegge da COVID grave-19. Man mano che nuove varianti di SARS-CoV-2 continuano ad emergere ed eludono le difese immunitarie umorali, l'immunità cellulare, che prende di mira un ampio spettro di epitopi di SARS-CoV-2 riconosciuti dalle cellule T, può fornire un'immunità protettiva stabile [21 ], sebbene i determinanti delle risposte cellulari nella protezione mediata da vaccino non siano ancora definiti con precisione. Pertanto, rimane poco chiaro se l'aumentata immunogenicità umorale della vaccinazione eterologa AZD1222/BNT162b2 si traduca costantemente in una migliore protezione e ciò richiede ulteriori studi. Inoltre, è necessario indagare se le persone che hanno sviluppato scarse risposte delle cellule T dopo la vaccinazione, come quelle innescate con AZD1222, possano beneficiare delle formulazioni del vaccino delle cellule T [22]. Sia l'immunità indotta da infezione che quella indotta da vaccino diminuiscono naturalmente nel tempo; tuttavia, una maggiore protezione sembra essere conferita a persone che erano state precedentemente infettate da SARS-CoV-2 [23]. Negli individui vaccinati, l'infezione da rottura con la variante Omicron induce risposte nAb più piccole rispetto all'infezione con la variante Delta [24], e si sa relativamente poco sulle potenziali conseguenze dell'immunità ibrida conferita dall'infezione e dalla vaccinazione con ceppi diversi. Tuttavia, la presenza di cellule T polifunzionali S-specifiche in partecipanti precedentemente infettati e vaccinati nel nostro studio è coerente con un declino più lento della protezione contro COVID-19 grave in questa popolazione e può contribuire a modificare la gravità della malattia in seguito alla reinfezione da SARS -CoV-2 varianti [25,26]. Lo studio attuale presenta diversi limiti. In primo luogo, le piccole dimensioni del campione nella coorte rendono difficile un'analisi statistica solida; pertanto, i nostri risultati dovranno essere ulteriormente convalidati in coorti più ampie. In secondo luogo, non siamo stati in grado di testare campioni in momenti successivi per determinare la durata e il declino delle risposte immunitarie umorali e cellulari. In terzo luogo, i nostri risultati potrebbero sottovalutare l'impatto degli epitopi delle cellule T sottodominanti al di fuori degli epitopi dominanti. In quarto luogo, abbiamo studiato solo i linfociti circolanti e potrebbero essere necessari studi futuri sui linfonodi drenanti dopo la vaccinazione per comprendere i meccanismi alla base delle risposte differenziali osservate qui. In sintesi, l'attuale studio con confronti diretti in base all'età fa luce sull'immunogenicità cellulare e umorale discordante del priming e del potenziamento eterologo nel contesto delle esposizioni all'antigene SARS-CoV-2. I nostri risultati evidenziano come l'esperienza immunologica individuale modella la successiva risposta immunitaria suscitata dalla vaccinazione COVID-19. Ulteriori dati sull'efficacia nel mondo reale e indagini di laboratorio forniranno ulteriori informazioni sulla strategia di vaccinazione più appropriata per la protezione dalle varianti emergenti di SARS-CoV-2, con implicazioni per lo sviluppo di piattaforme di vaccini di nuova generazione.

Fig. 4. Risposte immunitarie cellulari nei momenti di picco. (A) Le frequenze delle cellule IFN-c plus spike-specifiche tra le cellule CD4 plus T sono state confrontate tra BNT162b2/BNT162b2 (n=19), AZD1222/AZD1222 (n=18), AZD1222/BNT162b2 ( n=9) e precedenti gruppi di infezione/vaccinazione (n=7) nelle ore di punta. I momenti di picco sono stati selezionati come segue: dopo la seconda dose nei gruppi di vaccinazione BNT162b2/BNT162b2, AZD1222/AZD1222 e AZD1222/BNT162b2 e dopo la prima dose nel gruppo di infezione/vaccinazione precedente. (B) Le percentuali di partecipanti con diversi livelli di risposte immunitarie cellulari. La quantificazione del tipo di responder (forte, moderato e nessuno/debole) è espressa come frazione del numero di destinatari del vaccino in ciascun gruppo. I tipi di responder sono stati determinati dal punteggio percentile calcolato da tutti i partecipanti vaccinati. (C) Le frequenze delle cellule CD4 più T polifunzionali specifiche del picco che producono qualsiasi combinazione di IFN-c, IL-2 o TNF in ciascun gruppo di partecipanti vaccinati. (D) La frazione di cellule T CD4 più specifiche del picco è positiva per un dato numero di citochine. I dati sono presentati come media ± DS. La significatività è stata analizzata utilizzando il test di Mann-Whitney (A e C). ns, non significativo; *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001.

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Fig. 5. Risposte immunitarie cross-varianti contro il Delta suscitate da diversi regimi di potenziamento primario. (A) I campioni di plasma sono stati analizzati mediante test di neutralizzazione della riduzione della placca per la variante SARS-CoV-2 Delta in BNT162b2/BNT162b2 (n {{10}}), AZD1222/AZD1222 (n {{ 13}}), AZD1222/BNT162b2 (n=9), precedente infezione/vaccinazione (n=11) e Delta-convalescente (n {{20}}). Gli anticorpi neutralizzanti delta sono stati confrontati tra i gruppi nei seguenti punti temporali: dopo la seconda dose nei gruppi di vaccinazione BNT162b2/BNT162b2, AZD1222/AZD1222 e AZD1222/BNT162b2 e dopo la prima dose nel gruppo di infezione/vaccinazione precedente. (B) I PBMC sono stati analizzati mediante colorazione intracellulare per IFN-c in seguito a stimolazione diretta ex vivo utilizzando due diversi set di pool di peptidi S comprendenti regioni non conservate di sequenze di picchi tra i ceppi Wuhan e Delta in BNT162b2/BNT162b2 (n {{37} }), AZD1222/AZD1222 (n {{40}}), AZD1222/BNT162b2 (n=9), precedente infezione/vaccinazione (n=7) e Delta-convalescente ( n=17) gruppi. In ciascun gruppo è stato calcolato il rapporto tra la frequenza delle cellule CD4 più T che producono IFN-c contro il picco Delta e la frequenza delle cellule T CD4 più che producono IFN-c contro il picco di Wuhan. I dati sono presentati come media geometrica ± deviazione standard geometrica (A) o media ± deviazione standard (B) e analizzati per significatività utilizzando il test di Mann-Whitney. ns, non significativo; *P < 0.05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001.

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