L'analisi in silico di un peptide del veleno parassitoide della Drosophila rivela la prevalenza del motivo della clip catione-polare-catione nelle proteine ​​Knottin Parte 2

2.6. Una clip CPC è presente anche nel peptide antimicrobico Drosomycin

A differenza di LhKNOT, la struttura della Drosomicina contiene una piega diversa con un'elica alfa e un foglietto beta a tre filamenti ritorto, che è stabilizzato da tre ponti disolfuro [43]. Questo motivo strutturale, chiamato "motivo stabilizzato con cisteina", si trova anche in altre proteine ​​di difesa dell'ospite come la defensina A antibatterica degli insetti, le tossine dello scorpione, le tionine delle piante e le defensine delle piante antimicotiche [43,44].

-helix è un polipeptide con elevata attività biologica, che può attivare il sistema immunitario umano e migliorare l'immunità umana, prevenendo e curando così varie malattie. Gli studi hanno dimostrato che -helix ha l'effetto di migliorare la funzione immunitaria, può migliorare notevolmente l'abilità fagocitaria dei macrofagi e l'attività delle cellule T, migliorare la resistenza del corpo ai microrganismi patogeni esterni, ridurre la sensibilità del corpo agli ambienti avversi e promuovere la salute.

L'immunità è fondamentale per la salute umana. Può aiutarci a resistere a varie malattie, mantenere la forma fisica e migliorare la resistenza alle malattie. Tuttavia, le persone vivono in un ambiente pieno di varie esposizioni a agenti patogeni e inquinamento ambientale e l'immunità è facilmente compromessa. Pertanto, migliorare l'immunità è molto necessario per mantenere la salute umana.

Come peptide attivo naturale, -helix può non solo regolare il sistema immunitario e migliorare l'immunità, ma anche svolgere un buon ruolo nella prevenzione delle malattie cardiovascolari e dei disturbi metabolici, migliorare la funzionalità epatica, ridurre i lipidi nel sangue e la glicemia e migliorare la forza fisica e l'anti - capacità di fatica. Pertanto, -helix è stato ampiamente utilizzato nei campi della medicina, dei prodotti sanitari e dei cosmetici, ha ottenuto effetti notevoli ed è stato accolto calorosamente.

In breve, -helix è strettamente correlato all'immunità umana, può stimolare l'immunità umana e svolge un ruolo importante nel garantire la salute umana e la longevità. Nella vita e nel lavoro futuri, dovremmo migliorare attivamente l'immunità, migliorare le abitudini di vita, l'esercizio fisico e gli aggiustamenti della dieta in modo corretto, prendere in considerazione l'uso di -helix per migliorare l'immunità e affrontare più attivamente le sfide e le opportunità future. Si può vedere che dobbiamo migliorare l'immunità. Cistanche può migliorare significativamente l'immunità perché i polisaccaridi in Cistanche possono regolare la risposta immunitaria del sistema immunitario umano, migliorare la capacità di stress delle cellule immunitarie e potenziare l'effetto battericida delle cellule immunitarie.

Clicca supplemento cistanche deserticola

Data la nota funzione antimicrobica della drosomicina e il relativo "motivo stabilizzato con cisteina" [43,44], abbiamo esaminato la possibilità di una base comune per l'attività antimicrobica e le relazioni struttura-funzione condivise con LhKNOT per comprendere meglio il potenziale significato di questo motivo in LhKNOT nel contesto della difesa ospite.

Nonostante una piega strutturale leggermente diversa, la drosomicina si sovrappone all'interno di un RMSD di 2,2Å sia di LhKNOT che di pB1 (Figura 5A). Quando la precedente analisi della clip CPC è stata estesa alla Drosomicina, i risultati hanno rivelato la presenza del motivo della clip CPC anche nella Drosomicina. Il motivo della clip CPC in Drosomycin (R 6- S {4- K38) rientra in una deviazione di 2 Å dei parametri del motivo (Figura 5B, Tabella supplementare S5).

Inoltre, l'elettrostatica superficiale della drosomicina ha confermato la formazione della presunta clip CPC di una tasca di legame cationica come osservato anche per LhKNOT e altri nodi (Figura 5C, Tabella supplementare S5).

Questi risultati suggeriscono che potrebbe esserci una somiglianza nella modalità di azione di Drosomycin e LhKNOT e che la biochimica incorporata in questo motivo strutturale può guidare la funzione antimicrobica in entrambi i peptidi.

Figura 5. (A) Sovrapposizione di LhKNOT (blu), peptide cicatrizzante di Pereskia bleo (marrone chiaro; pB1; cactus; PDB: 5XBD) e Drosomicina (verde; Drosomicina; mosca; PDB: 1MYN). (B) Distanze misurate in PyMOL tra i centri di massa dei residui partecipanti (pseudo-atomi grigi) nell'interazione Drosomicina-eparina. Le distanze rientrano nei 2Å degli intervalli di valori del motivo della clip CPC. (C) Elettrostatica superficiale della Drosomicina (mosca; PDB: 1MYN), che mostra la superficie di legame caricata positivamente formata dalla clip CPC in cui è ancorata l'eparina. I potenziali elettrostatici superficiali sono classificati in base al colore da −4 kT/e (rosso) a più 4 kT/e (blu).

3. Discussione e speculazione

Le funzioni biochimiche delle proteine ​​sono facilitate dalle loro strutture complessive, che secondo quanto riferito sono 3-10 volte più ben conservate rispetto alle loro strutture primarie [45]. Di conseguenza, gli allineamenti di sequenza spesso non riescono a studiare il potenziale funzionale di proteine ​​come i knottins, dove le varie strutture primarie possono oscurare le relazioni struttura-funzione condivise.

I metodi in silico facilitano un'ampia analisi delle potenziali correlazioni struttura-funzione per pieghe così interessanti [46-50]. La nostra analisi dettagliata della struttura LhKNOT e dei suoi omologhi strutturali supporta l'idea che questa proteina parassita abbia le caratteristiche di un peptide knottin con funzioni nella difesa dell'ospite: (a) le corrispondenze più vicine a LhKNOT sono peptidi antimicrobici; (b) La firma Pfam di LhKNOT lo descrive come "peptide antimicotico" annodato con cisteina; e (c) è presente una clip CPC.

L'analisi di un login pB1 del peptide di guarigione delle ferite annodato dal cactus frondoso Pereskia bleo ha inizialmente rivelato la presenza di una clip CPC, una firma strutturale conservata delle proteine ​​​​leganti l'eparina [42]. Ha funzioni correlate all'immunità e alla segnalazione nella guarigione delle ferite e nel cancro ed è usato come anticoagulante [51].

I GAG sono presenti sulla superficie delle cellule animali e sono diventati un obiettivo sempre più popolare di studi che vanno dalla clinica alla cosmetica [52]. Il motivo della clip CPC delle proteine ​​leganti l'eparina è considerato il motivo minimo richiesto per l'affinità legante l'eparina ed è definito da specifiche relazioni spaziali tra tre residui, due cationici (Arg/Lys) e uno polare (Asn, Gln, Ser, Thr, Tyr).

Questo motivo della clip CPC è definito dalle distanze sia tra i carboni dei residui coinvolti sia dalle distanze tra i centri di massa dei residui coinvolti. È noto che le proteine ​​leganti l'eparina interagiscono promiscuamente con altri substrati caricati negativamente, in particolare le membrane superficiali dei microbi [41].

Di conseguenza, le proteine ​​leganti l'eparina possono mostrare attività antimicrobica a vari livelli [53]. Sebbene i meccanismi precisi di questo potenziale antimicrobico non siano ben definiti, è stato ipotizzato che la clip CPC possa facilitare queste interazioni proteina-microbo [41]. Stanno emergendo nuovi potenziali ruoli del legame con l'eparina, come nei potenziali interventi terapeutici per l'amiloidogenesi [54], quindi comprendere i determinanti strutturali della clip CPC in diverse proteine ​​può essere la chiave per delineare il meccanismo dell'interazione e la sua interruzione.

Un indizio su un possibile meccanismo antimicrobico per LhKNOT deriva dalla nostra scoperta che il suo nodo di cisteina inibitorio e quelli di altri nodi esaminati qui hanno una clip CPC intrinseca alle loro pieghe (Tabella Supplementare S5).

È stato notato che i requisiti strutturali e biofisici per la capacità delle proteine ​​leganti l'eparina di interagire con l'eparina sono sorprendentemente simili alle caratteristiche strutturali di molti AMP conosciuti [53]. Pertanto, il motivo della clip CPC può soddisfare i criteri per entrambi questi requisiti [41].

La nostra scoperta di questo motivo di clip CPC non solo in LhKNOT ma anche in altre 75 proteine ​​​​di knottin correlate o non correlate (Tabella supplementare S5) suggerisce che questo motivo di clip CPC potrebbe essere una caratteristica altamente conservata delle proteine ​​​​di knottin.

La coincidenza del motivo della clip CPC all'interno della struttura del nodo della cisteina in diverse proteine ​​suggerisce che il motivo della clip CPC stesso possa essere alla base della funzione antimicrobica. Tuttavia, poiché questo motivo strutturale è identificato anche nei nodi offensivi (Tabella Supplementare S5), può anche svolgere un ruolo più generale tramite questo motivo di interazione con clip CPC più generalizzato.

La scoperta di un presunto motivo della clip CPC nella drosomicina è intrigante, poiché fa luce sul possibile meccanismo d'azione di questo peptide antimicotico e supporta una possibile funzione antimicrobica per il motivo della clip CPC stesso. Precedenti studi hanno dimostrato l'importanza dei residui R6 e K38 della Drosomicina, che fanno parte del suo motivo a clip CPC (R6-S{4-K38), per il suo potenziale antimicotico; le alterazioni di questi residui riducono l'attività antimicotica [55]. La nostra analisi strutturale della vespa LhKNOT e le sue somiglianze con Drosophila Drosomycin offre possibili approfondimenti sulla capacità di L. heterotoma di sopprimere ampiamente il percorso TollNF-κB in D. melanogaster e tuttavia avere successo su ospiti immunocompromessi.

In assenza di una via immunitaria Toll funzionale e, di conseguenza, senza produzione di Drosomicina, le larve di Drosophila possono spesso soccombere a patogeni opportunisti [11,13,56]. Le presunte attività antimicrobiche di LhKNOT potrebbero difendere l'ospite da patogeni microbici opportunistici nelle larve dell'ospite infette da vespe e immunocompromesse e nelle pupe in via di sviluppo. In alternativa, simile alla Drosomicina, LhKNOT potrebbe indurre l'apoptosi degli emociti [57]. Gli EV di L. heteroatom entrano negli emociti dopo l'infezione [58] e le loro attività all'interno degli EV compromettono l'incapsulamento [19,21].

È stato dimostrato che la clip CPC si associa in modo promiscuo ai GAG [41], che sono tuttavia ubiquitari negli insetti, inclusa la Drosophila [59]. I GAG di eparina solfato nelle mosche fungono da recettori del fattore di crescita e partecipano alla creazione e al mantenimento dei gradienti morfogenici [60]. È stato anche dimostrato che la clip CPC si associa promiscuamente ai lipopolisaccaridi (LPS) [41]. Gli LPS batterici, essendo i principali componenti di superficie dei batteri Gram-negativi, sono stimolatori estremamente potenti della risposta immunitaria innata in varie specie eucariotiche, inclusi gli insetti [61]. I GAG in Drosophila controllano anche il legame della proteina C, un determinante della virulenza dello streptococco di gruppo B [62].

Pertanto, è possibile che una clip CPC contenente LhKNOT e Drosomicina (e possibilmente altri AMP moscerini, come Defensin [63]) possa modulare la segnalazione immunitaria (e/o legarsi alle proteine ​​di virulenza del patogeno), influenzando in modo simile il patogeno batterico/metazoo esito parassitario. Precedenti studi hanno dimostrato che tre knottins omologhi (Alo-1, 2, 3) dello scarabeo arlecchino Acrocinus longimanus sono attivi contro il lievito, Candida glabrata [30]. Inoltre, un peptide candidacida che forma i pori, la Psacoteasina, attacca la Candida albicans [64]. Infine, un fungo della ruggine patogeno per le piante, Melampsora lyrics-popular, produce un peptide knottin come suo effettore candidato [65].

La nostra scoperta che più presunti peptidi knottin possono essere secreti da vespe parassitoidi adulte di Drosophila è stata inaspettata e intrigante. Sebbene le loro funzioni non siano note, la possibile esistenza di una famiglia di geni knottin suggerisce una certa ridondanza nelle loro funzioni che potrebbe essere collegata alla storia della vita del parassita. L'esplorazione della piega strutturale del nodo in nodi non correlati e ancora da scoprire si rivelerà preziosa. Il nostro lavoro fornisce un breve elenco di residui significativi per l'attività fisiologica proposta per l'indagine sulle proteine ​​​​della famiglia Knottin. Tali informazioni possono essere incorporate nella scoperta razionale di farmaci e nella progettazione di malattie infettive e terapie correlate.

4. Metodi

4.1. Analisi di sequenza

Scansioni iniziali del database delle sequenze proteiche non ridondanti (nr) dell'NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein; accesso il 4 aprile 2018), il database delle sequenze del Transcriptome Shotgun Assembly (TSA) (https: //www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/tsa; consultato il 16 aprile 2018) [66], e Protein Data Bank (PDB; https://www.rcsb.org; consultato il 5 luglio 2018) [67] con la sequenza amminoacidica a lunghezza intera del peptide knottin di L. heteroatom (GAJC01011813.1) utilizzando NCBI BLAST (BLASTp; https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ Blast. cgi; accesso il 16 aprile 2018) [68] sono stati utilizzati per recuperare sequenze proteiche correlate in altri organismi. Gli omologhi remoti sono stati cercati utilizzando BLAST iterativo specifico della posizione (PSI-BLAST; https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi; accesso il 4 aprile 2022) [69] e Hidden Markov Models (HMMER; https://www.ebi.ac.uk/Tools/hmmer; accesso 6 aprile 2022) [70,71]. Le ricerche BLAST sono state adattate alla dimensione della parola 2 e alla matrice di punteggio BLOSUM45, mentre i parametri predefiniti sono stati utilizzati per HMMER.

Per identificare gli omologhi di knottin in selezionati Leptopilina e Ganaspis spp. non accessibile nei database delle proteine, sono state impiegate ricerche mirate utilizzando BLAST tradotti contro set di dati genomici e trascrittomici. Per identificare ulteriori L. heteroatom knottins, il L. heteroatom femminile trascrittoma addominale GAJC [72] e i trascrittomi di tutto il corpo da Ground GHUQ (GenBank Accession: GHUP00000000; TSA: Leptopilina heteroatom ceppo Lh14, trascrittoma shotgun) e Space GHUP (GenBank Accession: GHUQ00000000; TSA: Leptopilina heteroatom strain Lh14, transcriptome shotgun) sono stati cercati utilizzando tblastn (soglia del valore e impostata su 1, BLOSUM62, filtro a bassa complessità abilitato, filtro di copertura delle query impostato su 20 percento ) contro LhKNOT.

I seguenti trascrittomi sono stati cercati in modo simile per identificare L. boulardi knottins: trascrittoma addominale femminile di L. boulardi GAJA [72] e trascrittomi di tutto il corpo da Ground GITC (GenBank Accession: GITC00000000; TSA: Leptopilina boulardi ceppo Lb17, fucile trascrittoma), Space GISX (GenBank Accession: GISX00000000; TSA: Leptopilina boulardi ceppo Lb17, fucile trascrittoma) e GGGI00000000 (addome/testa femminile) [73]. Inoltre, ricerche mirate per Ganaspis spp. sono stati effettuati gli omologhi. Per G. hookeri, il GAIW00000000 TSA: Ganaspis spp.

Il set di dati G1 [74] è stato cercato (tblastn, soglia del valore elettronico impostata su 1, BLOSUM45, filtro a bassa complessità abilitato, filtro di copertura della query impostato su 20%) utilizzando la query LhKNOT. Lo strumento Expasy (web.expasy.org/translate/; accesso effettuato il 9 dicembre 2022) è stato utilizzato per tradurre queste sequenze TSA [75]. Le sequenze di peptidi previste risultanti sono state curate manualmente in base alla presenza del motivo della cisteina. Per G. brasiliensis, basato su AUGUSTUS (http://bioinf.uni-greifswald.de/augustus; accesso 9 aprile 2020) [76] previsioni geniche dalla sequenza genomica parzialmente assemblata (Gen-Bank: GCA{{15} }.1) sono stati realizzati utilizzando il modulo di addestramento del genoma di Nasonia vitripenis.

Le proteine ​​previste risultanti sono state cercate utilizzando blastp (soglia di valore e impostata su 1, filtro a bassa complessità abilitato, filtro di copertura delle query impostato su 20%) contro LhKNOT. Gli allineamenti e la visualizzazione sono stati eseguiti utilizzando Clustal Omega di EBI (https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo; accesso il 9 dicembre 2022) [77] per confermare la presenza del motivo knottin e per un'ulteriore cura di le sequenze.

Il set di sequenze identificate è stato allineato a LhKNOT per creare un allineamento di sequenze multiple utilizzando T-COFFEE (https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/tcoffee; accesso effettuato il 9 dicembre 2022) [78] e visualizzato utilizzando ESPript3 (https://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/index.php; accesso 9 dicembre 2022) [79] per identificare eventuali residui e/o motivi conservati nelle sequenze allineate.

4.2. LhKNOT Analisi della struttura primaria

La sequenza LhKNOT è stata analizzata anche dal database di rilevamento dominio/motivo Conserved Domain Database (CDD; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/cdd. shtml; accesso il 6 aprile 2018) e Pfam ( pfam.xfam.org; consultato il 6 aprile 2018) per identificare eventuali domini o firme di sequenza [80,81].

La sequenza è stata ulteriormente analizzata utilizzando il software di previsione della sequenza del segnale SignalP{{0}}.0 (https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-5 .0; accesso 6 aprile 2018) [82] e Phobius (https://www.ebi.ac.uk/Tools/pfa/phobias; accesso 6 aprile 2018) [83] per identificare la posizione della sequenza del segnale e consentire una caratterizzazione più accurata del peptide. Il peptide maturo di 36 aminoacidi (con la sequenza del segnale prevista, i residui 1-24, rimossi) è stato utilizzato per ulteriori analisi.

La struttura secondaria del peptide è stata prevista utilizzando il meta-server Sympred (https://www.ibi.vu.nl/programs/sympredwww; accesso il 6 aprile 2018) [84] e analizzata per confermare la sua corrispondenza con la struttura secondaria prevista struttura per una piega annodata: un segmento alfa-elicoidale iniziale (sequenza di segnale prevista) seguito da tre filamenti beta antiparalleli.

4.3. Previsione e valutazione della struttura terziaria di LhKNOT e dei suoi omologhi

I programmi I-Tasser (https://zhanggroup.org/I-TASSER; accesso 16 aprile 2018) [85], Modeller (https://salilab.org/modeller; accesso 16 aprile 2018) [{{7 }}] e HHPred (https://toolkit.tuebingen.mpg.de/tools/hhpred; accesso 6 aprile 2018) [37] sono stati utilizzati per modellare la struttura terziaria di LhKNOT. Tre omologhi strutturali con la piega simile a un nodo Alo-3 (PDB: 1Q3J) [30], omega-agatossina-IVA (PDB: 1IVA) [28] e PAFP-S (PDB: 1DKC) [25] sono stati identificati come i migliori candidati e utilizzati come modelli nei programmi di costruzione di modelli.

Il modello previsto per LhKNOT è stato valutato da Verify3D (https://www.doe-mbi.ucla.edu/verify3d; accesso il 18 aprile 2018) [39], VoroMQA (https://bioinformatics.lt/wtsam/voromqa; consultato il 18 aprile 2018) [40], e Prosaweb (https://prosa.services.came.sbg.ac.at/prosa.php; consultato il 18 aprile 2018) [38]. La valutazione di piccoli peptidi con strumenti di valutazione standard può avere dei limiti.

Pertanto, i punteggi delle strutture terziarie risolte di NMR e dei peptidi derivati ​​dalla cristallografia di dimensioni e forma simili (PDB: 1Q3J, 1IVA e 1DKC) sono stati utilizzati per interpretare i punteggi di valutazione dei nostri modelli LhKNOT. Il modello di livello superiore è stato creato utilizzando HHPred [37], un programma di modellazione che utilizza il programma di costruzione del modello sottostante, Modeller [86] utilizzando un approccio di modellazione comparativa basato sui vincoli. Inoltre, lo strumento KNOTER3D del database KNOTTIN (https://www.dsimb.inserm.fr/KNOTTIN/knoter3d.php; accesso il 15 maggio 2020) [36] è stato utilizzato per valutare la struttura terziaria del modello, confermando l'adozione da parte di LhKNOT del Piega annodata. Tutti gli omologhi identificati senza strutture note sono stati modellati utilizzando il modello superiore identificato in HHPred [37].

4.4. Identificazione del motivo della clip CPC

Sovrapposizione del modello strutturale di LhKNOT con le strutture note di una clip CPC contenente il peptide knottin del cactus Pereskia bleo (PDB: 5XBD) [26] utilizzando i programmi Superpose (http://superpose.wishartlab.com; accesso 12 settembre 2{ {11}}18) [87] e MultiProt (http://bioinfo3d.cs.tau.ac.il/MultiProt; accesso il 12 settembre 2018) [88] hanno suggerito la presenza di un motivo di clip CPC che lega l'eparina. Per confermare la presenza della clip CPC in LhKNOT, analisi docking utilizzando il programma ClusPro 2.0 (che offre parametri specifici per l'eparina come ligando; https://cluspro.org; accesso 2 marzo 2019) [89] e successiva analisi degli scenari di attracco previsti nel programma di visualizzazione, è stato eseguito PyMOL (https://pymol.org; accesso il 10 marzo 2019) [90].

Tutti i potenziali scenari di attracco sono stati analizzati per identificare i residui che formano il presunto motivo della clip CPC utilizzando i seguenti passaggi. Tutte le interazioni polari tra LhKNOT ed eparina sono state visualizzate in PyMOL e sono stati compilati elenchi di residui partecipanti. Le previsioni che contenevano le necessarie interazioni Cation-Polar-Cation sono state quindi ulteriormente esaminate per l'aderenza al parametro del motivo della clip CPC misurando le distanze tra i carboni alfa dei residui partecipanti e le distanze tra il centro di massa dei residui partecipanti. Lo strumento Wizard "Measurements" di PyMOL è stato utilizzato per misurare le distanze tra gli atomi di carbonio dei residui partecipanti.

Per valutare le distanze tra i centri di massa, uno script generato dall'utente disponibile sul sito Web Pymolwiki (Henschel, https://pymolwiki.org/index.php/Center_of_mass; accessibile su 15 marzo 2019) è stato utilizzato per generare pseudo-atomi al centro di massa calcolato della catena laterale. Il plug-in APBS Electrostatics di PyMOL [91] è stato utilizzato per eseguire il rendering dell'elettrostatica superficiale per LhKNOT modellato. Passaggi simili sono stati eseguiti per identificare il motivo della clip CPC in ciascuna delle rimanenti proteine ​​​​di knottin nella Tabella Supplementare S5.

4.5. Associazione di LhKNOT con altri GAG

Per valutare se la clip CPC faciliterebbe il legame con GAG aggiuntivi, è stato eseguito un ulteriore docking con acido ialuronico (PDB: 1HYA) e cheratan solfato (PDB: 1KES). Nel caso dell'acido ialuronico, gli atomi estranei (O, Na) sono stati rimossi dallo spazio che circonda la molecola. Il modello di Keratan sulfate è stato utilizzato così com'è. L'attracco è stato eseguito utilizzando AutoDock (https://autodock.scripps.edu; accesso il 7 aprile 2020) [92] e i risultati sono stati visualizzati in PyMOL. I risultati sono stati quindi inseriti in PDBSum (http://www.ebi.ac.uk/thornton-srv/databases/pdbsum/Generate.html; accesso il 10 aprile 2020) [93] per generare Ligplot per confermare l'associazione della clip GAG-CPC .

4.6. Analisi dell'aggancio della proteina-eparina per la clip CPC mutata in LhKNOT

Per studiare l'importanza della clip CPC nel legame con l'eparina, sono stati generati modelli mutati di LhKNOT utilizzando lo strumento di mutagenesi di PyMOL, sostituendo i residui della clip CPC con alanina. I modelli sono stati creati a tratti, sostituendo prima solo R14, poi R1 e R14 e infine R14, R1 e S3. L'attracco dell'eparina di tutti i modelli è stato eseguito utilizzando ClusPro e l'analisi è stata eseguita come descritto in precedenza.

4.7. Analisi dell'aggancio della proteina-eparina negli omologhi strutturali e nella drosomicina

Per valutare ulteriormente la presenza del motivo della clip CPC nella famiglia dei peptidi knottin, i metodi precedenti sono stati ulteriormente espansi a (a) omologhi strutturali di LhKNOT (PDB: 5XBD, 1Q3J, 1IVA e 1DKC) [25,26,28,30 ]; (b) Drosophila Drosomycin (PDB: 1MYN) [43], un peptide con nota attività antimicotica; (c) modellato proteine ​​knottin omologhe e (d) knottins rappresentativi di diverse categorie nel database KNOTTIN. I risultati sono stati considerati aderenti al motivo se le misurazioni rientravano entro 3Å dei parametri della clip CPC, per consentire una certa flessibilità delle conformazioni del ciclo proteico.

Materiali supplementari:

Le seguenti informazioni di supporto possono essere scaricate all'indirizzo https://www.mdpi.com/article/10.3390/pathogens12010143/s1. Tabella S1. Omologhi identificati di LhKNOT utilizzando diversi approcci basati sulla sequenza. Tabella S2. Omologhi putativi di L. heterotoma di LhKNOT. Le sequenze sono state identificate tramite tblastn da tre set di dati del trascrittoma Lh14 (vedere Metodi per i numeri di accesso).

Le trascrizioni raggruppate per celle ombreggiate codificano peptidi knottin identici. I numeri di accesso alla trascrizione mostrati in grassetto codificano due distinti peptidi. I risultati sono stati recuperati dalla tabella descrittiva disponibile dai risultati dell'esplosione dell'NCBI. Tabella S3. Il putativo L. boulardi knottin omologhi di LhKNOT. Le sequenze sono state identificate tramite tblastn da quattro set di dati del trascrittoma di L. boulardi (vedere Metodi per i numeri di accesso). I peptidi knottin identici derivati ​​da diverse trascrizioni sono raggruppati per colore. I risultati sono stati recuperati dalla tabella delle descrizioni dai risultati dell'esplosione dell'NCBI. Tabella S4.

Sequenze putative di knottin da Ganaspis spp., omologhe a LhKNOT. Le sequenze di G. hookeri sono state identificate con tblastn, mentre le sequenze di G. brasiliensis sono state identificate con un'esplosione. I risultati per G. hookeri e G. brasiliensis sono stati recuperati dalla tabella delle descrizioni disponibile dai risultati della ricerca NCBI. Le sequenze ombreggiate codificano peptidi identici. Tavola S5.

Un elenco di residui di amminoacidi nelle clip CPC di knottin noto esaminato, peptidi di knottin modellati e drosomicina. Vengono mostrate le misurazioni della distanza (Å) del centro di massa del carbonio alfa e della catena laterale (tramite pseudo-atomo) dei residui partecipanti dei motivi della clip CPC identificati. Legenda: più annodamenti offensivi noti (tossine), Φ in modelli silico, * piega non annodata, ± peptide putativo alternativo, evidenziato in verde e giallo per delimitare i peptidi derivanti dalla stessa trascrizione. Figura S1: (A) Profilo di valutazione Prosa-web. Lo Z-score del modello è rappresentato come un punto nero su uno sfondo di Z-score di strutture note dal PDB (a sinistra) e visualizzazione del modello tridimensionale LhKNOT con residui colorati dal blu al rosso in ordine crescente energia residua (a destra). (B) Verificare il profilo di valutazione. Il grafico mostra i punteggi 1D-3D medi e grezzi per LhKNOT e il pannello in alto elenca la percentuale di residui che hanno ottenuto una media di 0.2 o superiore.

Un modello che supera almeno l'80 percento dei suoi residui ha un punteggio superiore a 0,2. (C) Profilo di valutazione VoroMQA. Punteggi globali VoroMQA nel contesto dei punteggi della struttura dei raggi X di alta qualità (a sinistra) e grafico del punteggio locale e del punteggio complessivo per LhKNOT (a destra). Figura S2. Ligplot che mostra le interazioni di LhKNOT con cheratan solfato (PDB: 1KES) include i residui di clip CPC (R1-S3-R14). Le linee tratteggiate verdi rappresentano le interazioni del legame idrogeno. Figura S3. Ligplot che mostra le interazioni di LhKNOT con l'acido ialuronico (PDB: 1HYA) include i residui di clip CPC (R1-S3-R14).

Le linee tratteggiate verdi rappresentano le interazioni del legame idrogeno. Figura S4. (A) Ligplot che mostra le interazioni di LhKNOT wild-type che interagiscono con l'eparina tramite la clip CPC primaria (R1-S3-R14). (B) Ligplot che mostra le interazioni del mutante R14A LhKNOT che interagisce con l'eparina tramite una clip CPC secondaria (R1-S3-R30). Le linee tratteggiate verdi rappresentano le interazioni del legame idrogeno. I riferimenti [94–111] sono citati nei Materiali Supplementari.

Contributi dell'autore:

Concettualizzazione, SS, SG e JA; metodologia, JA e SS; convalida, SS, SG, JA, JL e LVC; analisi formale, JA, JL e LVC; indagine, JA, JL e LVC; risorse, SS e SG; cura dei dati, JA, JL e LVC; scrittura—preparazione della bozza originale, JA; scrittura: revisione e modifica, SS, SG, JA, JL e LVC; visualizzazione, JA e JL; vigilanza, SS e SG; amministrazione del progetto, SS e SG Tutti gli autori hanno letto e accettato la versione pubblicata del manoscritto.

Finanziamento:

Questa ricerca non ha ricevuto finanziamenti.

Dichiarazione del comitato di revisione istituzionale:

Non applicabile.

Dichiarazione di consenso informato:

Non applicabile.

Dichiarazione sulla disponibilità dei dati:

I dati presentati in questo studio sono disponibili nell'articolo e nei materiali supplementari.

Ringraziamenti:

Siamo grati a Brian Wey per il loro aiuto con le previsioni del gene G. brasiliensis e SA Tasnim Ahmed per il suo aiuto con la formattazione delle cifre.

Conflitto di interessi:

Gli autori dichiarano assenza di conflitto di interesse.

Riferimenti

1. Penczykowski, RM; Laine, AL; Koskella, B. Comprensione dell'ecologia e dell'evoluzione delle interazioni ospite-parassita attraverso le scale. Evol. Appl. 2015, 9, 37–52. [CrossRef] [PubMed]

2. Lambrechts, L.; Fellous, S.; Koella, JC Interazioni coevolutive tra genotipi ospite e parassita. Tendenze Parassitolo. 2006, 22, 12–16. [CrossRef]

3. Quicke, vespe parassite DL; Springer: Dordrecht, Paesi Bassi, 1997.

4. Poirie, M.; Colinet, D.; Gatti, J. Approfondimenti sulla funzione e sull'evoluzione dei veleni di vespe parassitoidi. Corr. Opin. Insetto Sci. 2014, 6, 52–60. [CrossRef] [PubMed]

5. Kraaijeveld, AR; Godfray, HCJ Evoluzione della resistenza dell'ospite e della controresistenza del parassitoide. Avv. Parassitolo. 2009, 70, 257-280. [CrossRef] [PubMed]

6. Burke, Grecia; Strand, MR Analisi sistematica di un arsenale di parassitismo vespa. Mol. Ecol. 2014, 23, 890–901. [CrossRef] [PubMed]

7. Yan, Z.; Zanna, Q.; Wang, L.; Liu, J.; Zhu, Y.; Vanga, F.; Li, F.; Warren, JH; Sì, G. Approfondimenti sulla composizione del veleno e sull'evoluzione di una vespa endoparassitoide combinando analisi proteomiche e trascrittomiche. Sci. Rep. 2016, 6, 19604. [CrossRef]

8. Lue, C.; Driskell, AC; Leips, J.; Buffington, ML Rassegna del genere Leptopilina (Hymenoptera, Cynipoidea, Figitidae, Eucoilinae) degli Stati Uniti orientali, comprese tre specie appena descritte. J. imenotteri. Ris. 2016, 53, 35-76. [CrossRef]

9. Heavner, ME; Hudgins, AD; Rajwani, R.; Morales, J.; Govind, S. Sfruttando il modello naturale Drosophila-parassitoide per integrare l'immunità degli insetti con la genomica funzionale. Corr. Opin. Insetto Sci. 2014, 6, 61–67. [CrossRef]

10. Lee, Michael Jackson; Kalamarz, ME; Paddibhatla, I.; Piccolo, C.; Rajwani, R.; Govind, S. Fattori di virulenza e strategie di Leptopilina spp .: Risposte selettive negli ospiti di Drosophila. Avv. Parassitolo. 2009, 70, 123–145. [CrossRef]

11. Buchon, N.; Silverman, N.; Cherry, S. Immunity in Drosophila melanogaster: dal riconoscimento microbico alla fisiologia dell'intero organismo. Nat. Rev. Immunol. 2014, 14, 796–810. [CrossRef]

12. Govind, S. Immunità innata in Drosophila: agenti patogeni e percorsi. Insetto Sci. 2008, 15, 29–43. [CrossRef]

13. Kounatidis, I.; Ligoxygakis, P. Drosophila come sistema modello per svelare gli strati di immunità innata alle infezioni. Apri Biol. 2012, 2, 120075. [CrossRef]

14.Schlenke, AT; Morales, J.; Govind, S.; Clark, AG Strategie di infezione contrastanti nei parassitoidi della vespa generalista e specialista di Drosophila melanogaster. PLoS Pathog. 2007, 3, 1486-1501. [CrossRef]

15. Qiu, P.; Padella, pc; Govind, S. Un ruolo per il percorso Drosophila Toll/Cactus nell'emopoiesi larvale. Sviluppo 1998, 125, 1909-1920. [CrossRef]

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